溫度脅迫對扇貝響應機制的研究進展

關文娟，黃小芳，劉鵬，劉曉雨

（大連海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

扇貝（Patinopecten yessoensis），隸屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（無頭綱、雙殼綱Bivalvia），翼形亞綱（Pterimorphia），異柱目（珍珠目）（Pterioida），扇貝科（Pectinidea），扇貝屬（Pecten），共有50 多個屬與亞屬，約400 種[1-2]。國內扇貝養(yǎng)殖品種主要有海灣扇貝（Argopecten irradians）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis），其中海灣扇貝和蝦夷扇貝均屬引進國外的優(yōu)良品種，而櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝則屬本土物種[3]。扇貝作為中國重要的經(jīng)濟海水養(yǎng)殖貝類，主要分布于遼寧、山東、河北省等環(huán)黃海區(qū)域[2，4]。扇貝不僅享有“海洋食草動物”之稱，且具有極高的經(jīng)濟價值與營養(yǎng)價值[5-6]。近年來，扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐步擴大，受各種不可調控的環(huán)境因素影響，蝦夷扇貝[7]、華貴櫛孔扇貝[8]以及海灣扇貝[9]等貝類，均在度夏與越冬等環(huán)節(jié)出現(xiàn)大規(guī)模死亡，嚴重遏制了扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。目前，關于扇貝對溫度耐受能力方面的研究，已成為眾多學者關注的一個熱點課題。現(xiàn)簡述近年來扇貝響應溫度脅迫的生理生化及分子機制方面的相關研究進展，旨在為進一步開展扇貝耐溫機理的研究和健康養(yǎng)殖，提供參考。

1 溫度脅迫對扇貝生理生化水平的影響

水溫是影響軟體動物生長發(fā)育、能量代謝和免疫功能等生理生化過程的重要環(huán)境因素[10]。溫度過高或過低，均會直接或間接引起貝類生理及生化代謝等功能的紊亂，甚至造成死亡[11-12]。國內外均已出現(xiàn)過由于溫度變化而導致扇貝異常死亡的現(xiàn)象。例如，1995—1996年冬季，在挪威西部海岸，養(yǎng)殖的大扇貝死亡率較高[13]；2014年，由于受到北黃海冷水團的影響，在遼東半島東南長山群島的蝦夷扇貝，出現(xiàn)大批死亡現(xiàn)象[14]；2017年，獐子島水域發(fā)生扇貝死亡事件，黃海北部水域的海洋熱浪，可能是該事件的主要誘因之一[15]；2019—2021年，由于沿海變暖等因素的影響，導致美國東北部科德角地區(qū)的海灣扇貝捕撈率，發(fā)生了顯著性下降[9]。另外，由于我國北部海區(qū)的溫度波動較大，冬季近岸水域和池塘水溫可降至-1 ℃或者更低，對海水貝類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了很大影響，已不適宜海水貝類的養(yǎng)殖[16]。Jiang 等[17]、Chen 等[18]、郝振林等[19]、Hao 等[20]、高振錕等[21]、郝雨[22]研究了溫度變化，對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、華貴櫛孔扇貝的生理或免疫指標的影響，為溫度脅迫因子對扇貝養(yǎng)殖影響的生理生態(tài)學方面的研究提供了理論依據(jù)。

1.1 溫度對扇貝生理的影響

溫度是影響海水貝類生理活動的重要環(huán)境因子[23]，對其攝食、呼吸和排泄等生理代謝均有顯著影響[24]。適宜水溫范圍內，扇貝的代謝速率與溫度的上升成正相關，當超過適宜水溫范圍后，其代謝就會出現(xiàn)異常[25]。在攝食方面，Jiang 等[26]研究了溫度驟變對蝦夷扇貝的影響，結果表明，攝食率在15 ℃時達到最高，但水溫從15 ℃降至5 ℃或升至20 ℃時，攝食率均呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢。在呼吸代謝方面，徐東等[27]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對蝦夷扇貝的呼吸代謝影響顯著，在試驗溫度范圍內，其耗氧率和排氨率隨溫度的升高而增加，15 ℃時達最大值，隨后又降低；表明當海水溫度超過其最適溫度時，易引起貝類生理代謝發(fā)生紊亂。生物鰓作為機體呼吸與免疫調節(jié)的主要器官，具有與周圍水環(huán)境直接接觸的表面積，對養(yǎng)殖海水溫度的改變，可做出快速的響應[10，28]。文獻[10]研究報道，溫度可通過影響鰓的顯微結構，以適應溫度的變化。郝振林等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，蝦夷扇貝鰓絲與絲間隔的寬度，隨著溫度的升高而逐漸變窄，表明溫度對鰓組織結構具有顯著影響。心率作為機體應對水環(huán)境變化的重要生理性指標，可有效評判扇貝生物機體的環(huán)境耐受能力，反映個體的代謝能力以及環(huán)境適應性[29]。郝杰華等[30]研究認為，在水溫變化時，蝦夷扇貝循環(huán)生理性指標與水溫均成正相關，同時機體為了減少自身的能量消耗，從而使扇貝在較低的血流與心臟搏動節(jié)奏下，保持著較高的血流通暢性，維持機體代謝，進而滿足血液循環(huán)的需求，這也與其冷水性的生態(tài)習性相適應；Xing 等[31]研究報道，當水溫從5 ℃上升至30 ℃左右時，櫛孔扇貝的心率以（1.73±0.04）bpm/℃速率增加，在（30.03±0.23）℃達到峰值后，隨著溫度的升高心率急速下降；Zhu 等[32]在海灣扇貝32 ℃的模擬試驗中發(fā)現(xiàn)，心率（HR）、心振幅（HA）、心率振幅乘積（RAP）等，均在24 h 達到峰值，但在第3 天時急劇下降，此時與其死亡率相一致。

1.2 溫度對扇貝抗氧化酶活性的影響

生物機體在環(huán)境脅迫或代謝過程中，體內會產(chǎn)生大量的過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）等活性氧自由基（ROS），ROS 的產(chǎn)生，會對機體（DNA、脂質、蛋白質等）造成一定的損傷，進而導致生物機體的代謝過程紊亂[10]。研究表明[33]，溫度的急劇變化，會直接影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生物機體的抗氧化體系，主要由于水溫的改變，導致機體耗氧量增加，促進ROS 的產(chǎn)生和細胞氧化狀態(tài)的改變，從而引發(fā)一系列與抗氧化劑和氧化酶體系相關的免疫反應[18，34-35]。在正常生理狀態(tài)下，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD），作為生物體抗氧化酶體系的主要防御酶類，是檢測機體免疫防御能力的主要指標[36-37]。其中，SOD 可以將生物體內的ROS 轉化為H2O2，然后由CAT 和POD 分解為水（H2O）和O2，三者相互協(xié)同，可有效清除及平衡體內細胞的ROS[37-38]。同時，總抗氧化能力（T-AOC），能夠反映機體抗氧化酶和非酶促系統(tǒng)，對外界刺激的代償能力及自由基代謝狀況，可作為衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標[39]。在溫度脅迫下，杜可等[40]研究發(fā)現(xiàn)，溫度驟降時，華貴櫛孔扇貝組織內的SOD 和CAT 活性，隨著降溫時間的延長，呈現(xiàn)先增后減的趨勢。Tan 等[41]對華貴櫛孔扇貝的研究表明，在急性冷應激（8 ℃）0～3 h 時，大部分組織中的CAT 含量顯著升高；3～6 h 時，CAT 含量仍保持在峰值；6 h 后，大部分組織中的T-AOC、SOD 和CAT 含量下降或維持在較低水平。郝振林等[42]研究認為，在相同升溫模式下，蝦夷扇貝體腔液中的SOD、CAT、POD 和T-AOC 水平，隨溫度升高，均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。環(huán)境溫度對扇貝生長影響較大，尤其是溫度的急劇改變，顯著影響扇貝機體的免疫能力[11]。扇貝在應對溫度脅迫時，短時間的溫度刺激，可能會誘導機體提高其抗氧化酶的活性，產(chǎn)生防御應激反應。但由于調節(jié)適應溫度的機制有其局限性，在受到持續(xù)性的極限耐受范圍（溫度或時間）時，其抗氧化防御體系的平衡將會被破壞，從而導致其代謝紊亂，生長速率減緩，甚至引發(fā)死亡現(xiàn)象[16，40]。

2 溫度脅迫對扇貝分子機制的影響

近年來，有研究報道，通過RNA-Seq 技術，探索未知基因、分析相關信號通路以及發(fā)掘功能基因，是研究生物機體對環(huán)境脅迫響應分子機制的有效途徑，并且已在扇貝溫度耐受性的研究中得到廣泛應用[29]。如巖扇貝[43]、海灣扇貝[44]、華貴櫛孔扇貝[8]、紫海墨扇貝[45]及蝦夷扇貝[46]等，已完成了不同程度的轉錄測序結果。

2.1 溫度脅迫對扇貝熱休克蛋白基因表達的影響

熱休克蛋白（HSPs），是一類在環(huán)境刺激誘導下生成的一組具有高度保守性的細胞分子伴侶蛋白，能夠幫助非活性蛋白正確折疊，促進受損細胞蛋白降解，并在維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞信號轉導調控中起著關鍵作用[47-48]。該蛋白主要包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 及小分子質量smHSP 家族[49]。其中HSP70 作為一種應激相關蛋白，在正常細胞狀態(tài)下含量較低，而在應激狀態(tài)下會發(fā)生基因表達變化，可作為應激反應和評價組織細胞，是否處于危險狀態(tài)的分子生物標志[16，50]。已有研究證明[16]，溫度脅迫可誘導扇貝HSP70 基因表達。Brun 等[51]研究發(fā)現(xiàn)，海扇貝在熱休克（10～20 ℃）24 h 時，引起體內HSP70的顯著表達，而海灣扇貝則在熱休克（20～30 ℃）3 h后的恢復期內，變化顯著；Jiang 等[17]研究表明，在急性應激25 ℃水溫暴露下，櫛孔扇貝鰓組織中HSP70的表達水平，在3 h 時顯著升高，6 h 時達到最高值。此外，冷休克誘導后，海灣扇貝從20 ℃降至3 ℃3 h 時，HSP70 的表達顯著增加[51]；張旭[8]對華貴櫛孔扇貝的研究表明，鰓組織中HSP70 的表達量，隨著溫度的下降而下降，說明低溫脅迫可能超過了HSP70 對扇貝的保護范圍。因此，HSPs 家族內的HSP70，作為扇貝響應溫度脅迫的關鍵基因，可能參與了扇貝抵御溫度脅迫的過程。

2.2 溫度脅迫對扇貝信號傳導的響應途徑

扇貝在響應溫度脅迫（高溫/低溫）過程中，涉及多種信號傳導代謝途徑，如內質網(wǎng)的蛋白加工、磷脂酰肌醇代謝、NOD 樣受體信號通路等。熱應激即指高溫刺激（超出自身體溫的調節(jié)能力）下，機體所做出的非特異性生理反應的總和[52]。蘇曉盈[45]研究發(fā)現(xiàn)，紫海墨扇貝主要涉及細胞凋亡、內質網(wǎng)蛋白加工、吞噬體、谷胱甘肽代謝、致病性大腸桿菌感染等過程，結果表明，機體在響應高溫脅迫過程中，主要通過合成大量相關蛋白，維持細胞結構功能的正常和機體氧化還原的平衡，增強機體免疫能力。劉陽[43]研究認為，巖扇貝幼貝的差異表達基因（DEGS），在內質網(wǎng)的蛋白加工、NOD 樣受體信號通路、抗原處理等代謝途徑影響較大，同時HSP70 等蛋白應激基因，也呈現(xiàn)高度差異表達；Mao 等[53]通過轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，3 種扇貝上調DEGS 高度富集于幾種免疫和細胞凋亡等相關途徑，此外HSPs也呈現(xiàn)出顯著上調，這可能有助于正確的蛋白質折疊，以促進扇貝適應環(huán)境的改變；Song 等[54]通過轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，在暴露于熱應激組中，墨西哥灣扇貝的DEGs，富集在鈣離子、激酶活性、磷酸酶活性和脂質相關通路中；Li 等[46]在對蝦夷扇貝的研究中發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要參與代謝途徑和蛋白質合成途徑，并對蝦夷扇貝的氧化應激、細胞凋亡、機體代謝和蛋白折疊有顯著影響。

在低溫脅迫下，劉桂龍[44]研究表明，海灣扇貝篩選到一些與熱休克蛋白、細胞凋亡、細胞骨架重排等免疫應答相關的DEGs，其中一些特異表達的DEGs，主要與溶酶體、Notch 以及磷脂酰肌醇等信號通路相關；張傳旭[8]對華貴櫛孔扇貝研究發(fā)現(xiàn)，DEGs 在磷酸酰肌醇信號系統(tǒng)、鞘糖脂代謝、溶酶體和谷胱甘肽代謝等信號通路均有涉及，表明長期的冷脅迫，可能會導致免疫和信號傳導系統(tǒng)異常，同時發(fā)現(xiàn)HSP70 對溫度變化敏感，可考慮將其作為慢性低溫脅迫的分子檢測指標，也可以作為后續(xù)耐低溫選育的分子標記；Song 等[54]通過轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，在暴露于低溫應激組中，墨西哥灣扇貝中，大多數(shù)DEGs 富集于RNA 處理途徑中；Greco 等[55]對南極扇貝耐低溫機制的研究發(fā)現(xiàn)，已鑒定的上調基因（URG），參與mRNA 和蛋白質穩(wěn)態(tài)的維持，以及細胞骨架功能的保存過程。大連海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室基于RNA-Seq 技術進行分析，發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫下，不同殼色海灣扇貝的DEGs主要富集于免疫與信號轉導等相關途徑；在低溫脅迫下，DEGs 主要富集于蛋白加工、代謝、免疫等相關代謝途徑（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。

綜上所述，在溫度脅迫下，扇貝可能通過蛋白加工、細胞過程、代謝、免疫、信號轉導等代謝途徑，調節(jié)適應溫度環(huán)境的壓力。扇貝應對溫度脅迫的響應機制，可能主要表現(xiàn)在抑制應激反應與蛋白合成活動的調節(jié)過程中。不同品種扇貝由于溫度適應性的差異，其對溫度脅迫的適應機制可能具有共同之處和種間特異性。

3 展望

溫度脅迫，是影響扇貝生長發(fā)育的主要環(huán)境誘因之一。為了深入了解扇貝響應溫度脅迫的適應機制，人們對溫度脅迫下扇貝的生理生化和分子機制方面已進行了較多研究。迄今為止，雖然研究已獲得許多突破性的進展，但研究尚未全面。另外，由于扇貝在生長過程中與其逆境脅迫的復雜性，目前關于溫度脅迫對扇貝的影響有待進一步深入。

（1）運用多種環(huán)境因子的綜合作用，對扇貝展開多重適應性的逆境研究，進而了解扇貝生理狀態(tài)及分子響應機制。

（2）深入開展有關扇貝耐溫性的全基因組的破譯、GWAS 分析以及關鍵基因挖掘與調控序列等分子方面的研究，進而從分子層面深入分析扇貝有關環(huán)境適應與生命演化的基本規(guī)律。

（3）進行優(yōu)良品種的選育，使用基因工程等手段，降低溫度對扇貝造成的影響。