豬圓環(huán)病毒3型的鑒定和遺傳演化分析

為了解宜賓市養(yǎng)殖場(chǎng)豬圓環(huán)病毒（PCV）3型的基因組特征和遺傳變異規(guī)律。本試驗(yàn)利用PCR方法從流產(chǎn)母豬血液中鑒定出1株P(guān)CV3，命名為SC-YB2203。經(jīng)過PCR方法擴(kuò)增部分基因組序列，對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示：遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)SCYB2203與廣州株MK142771和美國(guó)株MK496279屬于同一分支3f，與西班牙株MH579746和美國(guó)株MK496280親緣關(guān)系較近，與四川株MZ449244和重慶株KY075990親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。序列分析發(fā)現(xiàn)SC-YB2203與參考序列之間的同源性最高的為重慶株KY075990（98.5%），與湖南株MG372488的同源性為87.7%，與其他國(guó)內(nèi)株同源性較高（97.6% -98.5%）。本研究有助于深入了解和分析四川省PCV3流行毒株的分子特性和遺傳進(jìn)化分析，為后續(xù)PCV3的致病性研究和防控提供參考。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus）屬于圓環(huán)病毒科環(huán)狀病毒屬，是已知最小的動(dòng)物病毒之一。PCV是一種無囊膜，單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒。PCV可分為PCV1、PCV2、PCV3和PCV4 4種不同基因型[1-2]。PCV1可以感染家豬與野豬且呈現(xiàn)無臨床癥狀。PCV2能夠引起宿主機(jī)體的免疫抑制，導(dǎo)致母豬的繁殖障礙，在急性病死母豬中能夠檢測(cè)出PCV3[3-4]。PCV3感染后，使母豬流產(chǎn)率增加，出現(xiàn)產(chǎn)死胎或木乃伊胎現(xiàn)象[5]。2017年3月中國(guó)首次報(bào)道PCV3感染，且隨后呈逐年上升的趨勢(shì)[6]。PCV3的基因組全長(zhǎng)2 000 bp，包含3個(gè)ORF，ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白由297個(gè)氨基酸組成，ORF2編碼衣殼蛋白由214個(gè)氨基酸組成，ORF3編碼的蛋白功能未知由231個(gè)氨基酸組成。本研究從四川省宜賓市某豬場(chǎng)流產(chǎn)母豬血液中鑒定1株P(guān)CV3，命名為SC-YB2203，通過遺傳演化分析，了解該地區(qū)毒株序列的遺傳演化關(guān)系，為PCV3分子流行病學(xué)研究和防控提供參考。

1材料與方法

1.1病料來源

臨床樣本來源于2022年3月四川省宜賓市某養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)病癥狀主要包括母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎等癥狀，血液樣本保存于-80℃。按照DNA提取試劑盒說明書，提取豬的血液DNA備用。

1.2主要試劑

病毒總DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生物科技有限公司；DL2000 marker、Ex Taq酶、均購(gòu)自TAKARA。

1.3引物設(shè)計(jì)

利用豬圓環(huán)病毒3型鑒定引物R-F：5-CC‐GCACCCGAAGCGCAGCGG -3；R-R：5-ATCCACTGCCCGGTATATCCAC-3對(duì)血液進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物由成都擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNA‐STAR軟件將序列拼接后提交NCBI，命名為SC-YB2203。

1.5基因序列分析

利用DNAStar軟件對(duì)SC-YB2203的基因組序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA6.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹分析SC-YB2203序列并繪制遺傳進(jìn)化樹，分析比較SC-YB2203與參考毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果和分析

2.1基因序列比較分析

SC-YB2203與參考序列之間的同源性最高的為重慶株KY075990 （98.5%），與湖南株MG372488的同源性為87.7%，與其他國(guó)內(nèi)株同源性較高（97.6%～98.5%），見圖1。

2.2 SC-YB2203遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA6.0軟件將SC-YB2203與國(guó)內(nèi)外PCV3核酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示SC-YB2203與廣州株MK142771和美國(guó)株MK496279屬于同一分支3f，與西班牙株MH579746和美國(guó)株MK496280親緣關(guān)系較近，與四川株MZ449244和重慶株KY075990親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖2）。

3討論和結(jié)論

本研究通過采集流產(chǎn)母豬血液，進(jìn)行PCR方法檢測(cè)和鑒定，獲得1株P(guān)CV3序列，命名為SC-YB2203。序列分析顯示PCV3沒有明顯的地域性，與國(guó)內(nèi)株P(guān)CV3序列同源性為87.7%～98.5%。

遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)SC-YB2203與廣州株MK142771和美國(guó)株MK496279屬于同一分支3f，與3e分支的西班牙株MH579746和美國(guó)株MK496280親緣關(guān)系較近，與四川株MZ449244和重慶株KY075990親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。SCYB2203與四川株和重慶株相比處于不同分支，說明西南地區(qū)PCV3存在多基因亞型并存現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)分離株基因型較多且呈廣泛分布。SC-YB2203可能來源于國(guó)外引種，PCV3不同基因型存在是否影響致病性需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究鑒定了一株P(guān)CV3，SCYB2203，遺傳分析發(fā)現(xiàn)其與多株國(guó)外毒株遺傳關(guān)系較近，并且與四川株和重慶株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，這有助于了解西南地區(qū)PCV3的流行病學(xué)和基因型特征，為后續(xù)致病性研究和防控提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[5]張永寧，梅琳，張舟，等.豬圓環(huán)病毒3型研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，48（9）：89-96.

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基金項(xiàng)目：宜賓學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2019QD09，2019QD10）

【1四川省宜賓市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局陳燕凌；2四川省宜賓市翠屏區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局王穎旺；3宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，宜賓市動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫工程技術(shù)研究中心楊潞，楊漫漫，李雪梅，張?jiān)?，田志革，胡曉亮（通訊作者）?/p>