茶葉制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽可行性及功能分析

李 麗，陳 潔

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001）

中國(guó)是全球第一大茶生產(chǎn)大國(guó)，2017年度，干茶總產(chǎn)量達(dá)到258萬(wàn)噸。在對(duì)茶進(jìn)行深加工的研究中，茶的深加工范圍也在持續(xù)擴(kuò)大，速溶茶、茶飲料以及茶多酚等茶深加工產(chǎn)品的產(chǎn)量在快速地增加。在我國(guó)，由于我國(guó)茶園的規(guī)模不斷擴(kuò)大，在生產(chǎn)中會(huì)產(chǎn)生大量的殘留物。因此，對(duì)其進(jìn)行高效處理，將其轉(zhuǎn)化為可再生資源，成為當(dāng)前急需突破的技術(shù)難題。

1 研究意義

在全世界范圍內(nèi)，每年都有越來(lái)越多的人患上高血壓，這給衛(wèi)生體系帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。因此，對(duì)高血壓病的預(yù)防和治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。將具有降壓作用的天然植物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有降壓功效的多肽，以其為原料，研制成功能化的藥物已成為當(dāng)前的研究和發(fā)展方向。茶葉活性物質(zhì)是一種具有最大保健作用的天然物質(zhì)，其活性物質(zhì)如茶多酚、茶黃素、茶多糖、茶氨酸等與人體健康有關(guān)的科研報(bào)告也在不斷增多[1]。茶中所含的各種活性物質(zhì)對(duì)身體具有一定的保健作用，對(duì)其進(jìn)行合理的開發(fā)和應(yīng)用已成為國(guó)際上的一個(gè)熱門話題。

中國(guó)是茶的起源地，也是全球首位的種植和生產(chǎn)大國(guó)。近年來(lái)，隨著茶葉的種植面積和產(chǎn)量的不斷擴(kuò)大，每年都會(huì)生產(chǎn)出大量的茶和深加工后產(chǎn)生的廢料，也說(shuō)明了我國(guó)擁有豐富的茶葉蛋白資源。研究者在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)分離純化茶葉中的蛋白質(zhì)，利用酶水解法，從茶葉中分離得到的 ACE抑制多肽，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其降壓效果，闡明其降壓機(jī)理，為進(jìn)一步研發(fā)新型的茶葉降壓多肽產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可以進(jìn)一步拓展茶葉深加工產(chǎn)品種類，降低茶葉資源的浪費(fèi)，提高茶葉的附加值，延長(zhǎng)茶葉產(chǎn)業(yè)鏈，提高人們的體質(zhì)和體質(zhì)，從而推動(dòng)我國(guó)茶葉產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展[2]。

2 ACE抑制肽的來(lái)源及結(jié)構(gòu)

早在1965年，F(xiàn)erreira等人從蛇毒中首次發(fā)現(xiàn)了 ACE抑制多肽，并以其為模式藥物，開發(fā)了一系列的ACE抑制劑，其中包括目前仍然被廣泛應(yīng)用的卡托普利。在1979年，Oshinma等人利用細(xì)菌的膠原蛋白對(duì)明膠進(jìn)行降解，得到了6個(gè)活性很高的ACE抑制多肽。蛋白質(zhì)來(lái)源是決定酶水法合成降壓多肽的活性及收率的重要因素，但因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致其酶水法合成降壓多肽，其降壓作用也不盡相同。多肽的分子質(zhì)量通常低于10kDa，含有不超過(guò)100個(gè)氨基酸，其抗腫瘤作用的強(qiáng)弱與多肽的分子質(zhì)量及氨基酸組成密切相關(guān)。已有研究顯示，分子質(zhì)量小于1kDa的多肽碎片，其降壓效果更好。通常情況下，具有較多的疏水氨基酸，尤其是具有較高的酪氨酸，具有較好的降壓作用。盡管疏水型氨基酸不會(huì)提高多肽在水相中的溶解性，但是卻可以提高多肽在油脂環(huán)境中的溶解性，從而提高多肽的降壓效果。肽段的C端為脯氨酸或芳香族氨基酸，具有良好的降血壓作用，N端為長(zhǎng)鏈或含支鏈的疏水性氨基酸，具有良好的降血壓作用，N端為脯氨酸則具有一定的降壓作用。此外，已有報(bào)道顯示，ACE抑制劑的活性與其結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的相關(guān)性[3]。

3 ACE抑制肽制備方法

3.1 超濾

超濾是一種以高壓為驅(qū)動(dòng)力的膜分離技術(shù)，在多種生物大分子、多種小分子的分級(jí)分離、濃縮以及海水淡化等方面有著重要的應(yīng)用。杜璟等人采用超濾法制備了一種含有3ku分子量的多肽水溶液，其ACE抑制效果最好。前期研究發(fā)現(xiàn)，在3ku的超濾層中，雙低型小白菜的降壓活性顯著增強(qiáng)，其滲透物IC50降低15%。利用10kDa、3kDa的超濾膜對(duì)條斑紫菜降壓肽段進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其ACE抑制活性在3kDa以下，其IC50從0.844mg/mL下降到0.523mg/mL。采用超濾技術(shù)從豇豆中提取降壓多肽，結(jié)果表明，在1kDa以下的超過(guò)濾組分具有較好的降壓效果。

3.2 凝膠色譜

凝膠層析技術(shù)是基于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的特點(diǎn)，依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小和形狀的不同，將蛋白質(zhì)分子從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中分離出來(lái)的一種新方法。目前，凝膠層析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于降壓活性多肽的研究。在大氣壓下，通常使用的是瓊脂糖（SePHadex)G-15、G-25以及聚丙烯酰胺（Biogel）的Bio-gelP-2、P-4、P-6、P-10等多種形式的葡萄糖（gel）作為大氣壓下的凝膠層[4]。

利用凝膠電泳（SePHadex）G-25對(duì)米糠蛋白水解液進(jìn)行了分離，獲得了3個(gè)組分，分別是F2（IC50=0.24mg/mL）和ACE（IC50=32μg/mL），對(duì)DPPH自由基的清除作用最大。使用SePHadexLH-20凝膠過(guò)濾色譜對(duì)牡蠣蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行了分離，得出三個(gè)組分的IC50值分別為1.2mg/mL、0.49mg/mL和0.53mg/mL。使用凝膠過(guò)濾色譜的方法，對(duì)雞蛋水解產(chǎn)物進(jìn)行了分離，從而獲得了高活性的ACE抑制肽，并對(duì)其中一種肽的氨基酸序列進(jìn)行了分析，得出Arg-Val-Pro-Ser-Leu的結(jié)果。

4 茶葉蛋白研究現(xiàn)狀

我國(guó)茶樹資源豐富，茶葉生產(chǎn)歷史悠久。茶葉是中國(guó)的一種傳統(tǒng)和特色的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，茶葉種類繁多，茶葉產(chǎn)地面積廣闊，中國(guó)是全球最重要的茶葉生產(chǎn)國(guó)、出口國(guó)和消費(fèi)國(guó)。茶葉生物化學(xué)組分種類繁多，蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%-30%，但大部分非水溶性，只有1%-2%的蛋白質(zhì)屬于可溶蛋白。從遠(yuǎn)古時(shí)代起，茶就被人類用作藥材，并得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，以及對(duì)茶樹生化、藥理學(xué)等方面的研究，對(duì)茶樹營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的健康作用也日益引起了人們的重視。茶蛋白質(zhì)中約80%為大分子，且谷蛋白與谷蛋白之間存在二硫鍵與疏水性官能團(tuán)的相互作用，導(dǎo)致其不易溶于水，不易被人體吸收，極大地制約了茶蛋白質(zhì)的應(yīng)用[5]。

5 茶葉蛋白的制備

5.1 茶葉蛋白的提取

從植物中分離出蛋白質(zhì)主要有堿法、酸法和酶法。茶葉中含有超過(guò)80%的堿可溶蛋白質(zhì)，堿性溶液可以解離茶素中的極性基，使其表面電荷趨于一致，打破蛋白質(zhì)間的氫鍵，提高其溶解度，提高其萃取效率。在此基礎(chǔ)上，提出了一種新的茶樹籽蛋白萃取方法，其萃取效率可達(dá)61.86%，而在超聲技術(shù)的幫助下，將茶樹籽蛋白萃取效率從單純的堿萃取方法的49.3%提升至86.5%。雖然采用堿法制備的茶樹蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、生產(chǎn)費(fèi)用低廉，但需采用高堿含量時(shí)，才能得到高得率[6]。

在堿性溶液中，高含量的堿性溶液使其營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)改變，并產(chǎn)生賴-丙氨酸等有毒化合物，使其營(yíng)養(yǎng)成分流失。另外，在高密度的堿性溶液中，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)和糖類等產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，造成茶葉蛋白質(zhì)的不可逆變性，并導(dǎo)致了某些非蛋白質(zhì)的溶解，從而增大了蛋白質(zhì)的分離難度。研究結(jié)果顯示，在 PH高于7.0后，茶葉蛋白提取率會(huì)隨著PH升高而提升。但是，鹽析后的蛋白質(zhì)沉淀物并不容易對(duì)其進(jìn)行脫色，而且蛋白質(zhì)容易與茶多酚形成具有較低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的沉淀。

在酶法中，利用到的酶以蛋白酶為主，蛋白酶可以對(duì)茶葉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行改性和降解，從而使得其肽鏈縮短，分子量減小。利用蛋白酶對(duì)茶中蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，并對(duì)與之連接的其他成分進(jìn)行降解，可加快茶中蛋白質(zhì)的溶解速度。相對(duì)于堿浸出，酶浸出工藝要求較低，且不會(huì)造成對(duì)蛋白養(yǎng)分的損傷，能夠最大限度地保持蛋白的營(yíng)養(yǎng)和功能性[7]。

結(jié)果表明，采用堿性蛋白酶對(duì)茶樹中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了萃取，萃取得率可達(dá)34.2%。當(dāng)前，茶樹中蛋白質(zhì)的酶法制備技術(shù)還不夠完善，存在著得率不高、成本高等問(wèn)題，限制了該技術(shù)的工業(yè)化推廣。擬通過(guò)對(duì)茶樹中蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)等方面的深入探索，進(jìn)一步完善茶樹中蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)，為茶樹中蛋白質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

復(fù)合工藝是將酶法和堿法結(jié)合在一起的一種工藝，也就是采用一次用堿液或酶液來(lái)一次提取茶葉蛋白，然后用另外一種工藝來(lái)二次提取茶葉蛋白。該方法僅用少量的堿性溶液，就可以獲得很高的蛋白浸出率，并且保留了茶樹蛋白原有的營(yíng)養(yǎng)和功能性。利用堿溶法、酶水法、酸水法分別對(duì)茶葉蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，得到了茶葉蛋白質(zhì)，具體公式為：

萃取得率=（蛋白質(zhì)質(zhì)量/茶葉質(zhì)量）×100%（1）

5.2 茶葉蛋白的純化

目前，對(duì)茶中蛋白質(zhì)的研究主要集中在三個(gè)方面，即沉淀、脫色和淡化。因?yàn)樵诔恋砗蟮牟枞~蛋白仍然具有較深的顏色，所以在沉淀后，還需要對(duì)茶葉蛋白進(jìn)行脫色，其中的脫色方法主要有：有機(jī)溶劑脫色法、活性炭吸附法和過(guò)氧化氫脫色法等。用水提取法可以除去因茶樹褐色而引起的水溶性黑色素。目前，活性碳雖能對(duì)顏料進(jìn)行有效的吸收，但其對(duì)顏料的選擇能力較差，易導(dǎo)致一些已解離態(tài)的蛋白在其表面被吸附，導(dǎo)致蛋白丟失。而在有機(jī)試劑萃取法中，大多以丙酮為主，通過(guò)丙酮洗脫后，所獲得的茶葉蛋白的脫色效果十分顯著。與此同時(shí)，丙酮還可以被循環(huán)使用，與活性炭脫色的方法相比，丙酮清洗脫色法獲得的茶葉蛋白的提取率也比較高。

5.3 茶葉蛋白的功能性質(zhì)

除了具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之外，還具有其它一些理化特性，例如溶解性，起泡性，乳化性，粘度等。蛋白的功能特性對(duì)食物的感覺品質(zhì)有很大的影響，在食物的制備、加工和儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)中，蛋白的理化性能也會(huì)有很大的改變，這也是蛋白制品在食物中的運(yùn)用的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。很多蛋白質(zhì)的內(nèi)部因素都會(huì)對(duì)其的功能特性產(chǎn)生影響，具體有：蛋白質(zhì)的大小、形狀、結(jié)構(gòu)、疏水性與親水性之比、氨基酸組成與序列、分子的柔性與剛性、靜電荷的分布以及分子之間的相互作用等。

外部環(huán)境也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響，比如溫度、鹽濃度、PH值、壓力、貯存條件等，都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生變化。根據(jù)調(diào)查顯示，在等電點(diǎn)（PH4.0）附近，茶渣蛋白的溶解性是最低的，其乳化性及乳化穩(wěn)定性隨著 PH的變化而與溶解性呈現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，在等電點(diǎn)附近，其起泡穩(wěn)定性也是比較好的，其吸油性為0.85g油/g蛋白，其吸油性比大豆蛋白粉要好，但是比大豆分離蛋白要差。

6 高血壓及其治療方式

高血壓作為一種常見病，并可導(dǎo)致腦、心、腎等多個(gè)靶組織的損傷，是導(dǎo)致心血管病致死的重要因素。不斷增長(zhǎng)的血壓升高對(duì)全球衛(wèi)生體系提出了巨大挑戰(zhàn)，數(shù)據(jù)顯示，2015年世界范圍內(nèi)，高血壓患病人群約為11.3億，而在中國(guó)，高血壓病人數(shù)量更是突破了兩億。所以，對(duì)其防治一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題，對(duì)高血壓的藥物和治療的研究也越來(lái)越多。鈣通道阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β-受體阻斷劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑、利尿劑等都是臨床上比較常見的降壓藥物。這幾種降壓藥的降壓作用都很好，但是它們都有一些不良反應(yīng)，或者是不適合特定的人群，所以它們的持續(xù)使用會(huì)有一些局限性[8]。

比如，β-受體阻斷劑會(huì)引起眩暈、胃腸紊亂、對(duì)糖脂代謝產(chǎn)生影響，所以不適用于鼻竇性心動(dòng)過(guò)緩、重度房室傳導(dǎo)阻滯和支氣管哮喘患者，ACE抑制劑藥物會(huì)引起無(wú)痰干咳或血管性水腫，活動(dòng)性肝炎、肝病患者、高鉀血癥、嚴(yán)重腎功能損傷以及懷孕早期等也都不適用。從植物和動(dòng)物中，開發(fā)出一種安全有效、毒副作用小，可以替代西藥的天然降壓活性物質(zhì)，正日益被研究者們所重視。對(duì)食源性多肽進(jìn)行研究，并開發(fā)出一種能夠幫助或替代高血壓藥物的功能食品，這對(duì)于高血壓的防控具有十分重大的意義[9]。

7 高血壓的抑制機(jī)理

高血壓的發(fā)生與遺傳、環(huán)境及其它多種原因有關(guān)，例如：高鹽攝入，交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，飲食中鉀鈣攝入不足，內(nèi)皮功能受損，RAS活性增高，血管阻力增高，VGF活性增高，VEGF活性升高，血管阻力升高，血管生長(zhǎng)因子活性增高等。自1952年Skeggs LT等人首先闡明Respons-Angiogenesis系統(tǒng)并闡明其在心血管中的重要調(diào)控功能以來(lái)，并對(duì)這一內(nèi)分泌系統(tǒng)的構(gòu)成和功能進(jìn)行了廣泛研究。

AngII作為 RAS系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，可通過(guò)活化 AngII Type1，增加glycine glycin分泌，增加交感神經(jīng)活性，從而引起血壓升高。AngII還可以活化腎臟中的AT1，刺激腎上腺的醛固酮的分泌，或者是通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)口渴，進(jìn)而對(duì)鈉和水的再吸收產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)血壓進(jìn)行調(diào)控[10]。

8 結(jié)語(yǔ)

高血壓作為一種常見病，可促進(jìn)AS進(jìn)展或提高其對(duì)AS的易感，并可導(dǎo)致腦、心、腎等多個(gè)靶組織的損傷，是導(dǎo)致心血管病致死的重要因素。從茶葉開發(fā)出一種安全有效、毒副作用小，可以替代西藥的天然降壓活性物質(zhì)，正日益被研究者所重視。對(duì)食源性多肽進(jìn)行研究，并開發(fā)出一種能夠幫助或替代高血壓藥物的功能食品，這對(duì)于高血壓的防控具有十分重大的意義。