卡介苗通過(guò)抑制大鼠急性脊髓損傷中炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)保護(hù)脊髓的機(jī)制

蒲興魏 歐陽(yáng)北平 陸庭盛 姚書(shū)眈 崔松 羅春山

(貴州省骨科醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550002)

脊髓損傷(SCI)后繼發(fā)的免疫及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致脊髓繼發(fā)損傷的重要因素[1],其產(chǎn)生大量的促炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β及IL-6等,能抑制神經(jīng)功能的恢復(fù),而TGF-β和IL-10等[1-3]抑炎因子具有強(qiáng)烈的炎癥抑制活性,具有神經(jīng)保護(hù)作用?？ń槊?BCG)是結(jié)核桿菌的減毒活疫苗,可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)生成,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng),對(duì)機(jī)體具有免疫保護(hù)作用[8-9]。因此能否通過(guò)BCG誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮對(duì)SCI的保護(hù)性作用,這對(duì)于SCI的早期治療可能具有重要意義。本研究通過(guò)向SCI大鼠模型注射BCG,通過(guò)用BBB評(píng)分、HE染色及檢測(cè)炎癥因子變化情況以探究BCG對(duì)SCI的影響,為BCG在SCI中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組72只SPF級(jí)的健康成年SD大鼠(體重250～300 g),購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,全部為雄性。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和BCG治療組,各24只。

1.2 主要試劑卡介苗佐劑(上海嘉楚生物工程有限公司);4%多聚甲醛(上海嘉楚生物工程有限公司);蘇木素染液(ZLI-9610,中衫金橋);伊紅染色液(G1100,Solarbio);TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、TGF-β試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽鋮⒄誂llen法制作大鼠脊髓損傷模型。用40 g/L戊巴比妥鈉溶液按40 ms/kg行腹腔注射麻醉。固定四肢于手術(shù)臺(tái),定位T10棘突,剔除背部3 cm×4 cm大小周?chē)l(fā),3%絡(luò)合碘消毒皮膚后,鋪設(shè)洞巾,沿脊柱方向在T10水平開(kāi)一長(zhǎng)約3 cm切口,暴露背部肌肉、筋膜組織,剪開(kāi)深筋膜,剝離棘突兩側(cè)肌肉顯露椎板,假手術(shù)組僅去除T10椎板,顯露硬膜囊大小約1 cm×0.6 cm,墊一塑料墊片,模型組和BCG治療組用滅菌后自制的脊髓打擊器—10 g重的打擊桿自25 mm高度自由下落(打擊桿底部直徑2.5 mm),打擊脊髓,觀察大鼠尾巴和雙下肢短暫抽搐,脊髓硬膜囊輕微腫脹,造模成功。大鼠術(shù)后麻醉清醒,模型組和BCG治療組大鼠雙后肢癱瘓,小便功能喪失,每日予以膀胱按摩并擠尿3次,直至恢復(fù)自主排尿功能。實(shí)驗(yàn)組大鼠于建立模型后30 min、24 h、48 h于大鼠腹腔注射BCG(105CFU),共3次,對(duì)照組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,注射時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組,假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。

1.4 術(shù)后大鼠后肢功能評(píng)價(jià)采用Basso,Beattie &Bresnahan locomotor rating scale-BBB評(píng)分系統(tǒng)。評(píng)定方法為將大鼠置于高7 cm、直徑90 cm的平坦不滑的木板上,任其自由爬行,由兩名熟知BBB評(píng)分的非實(shí)驗(yàn)人員觀察記錄,持續(xù)時(shí)間≥4 min,總分21分,0分表示無(wú)運(yùn)動(dòng)功能,21分表示運(yùn)動(dòng)功能正常,分別評(píng)分,取其平均值。在術(shù)后的第1、3、5、7、14天分別對(duì)各組進(jìn)行BBB評(píng)分。

1.5 標(biāo)本采集動(dòng)物麻醉成功后。剖胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管,并以止血鉗固定;剪開(kāi)右心耳,見(jiàn)靜脈血流出,當(dāng)即從灌注針灌入PBS緩沖液約80 mL,待右心耳流出清澈液體后將灌注液體更換為4%多聚甲醛,多聚甲醛灌注速度為先快后慢,快速灌注50 mL后放慢速度,緩慢滴注維持即可,每只大鼠約需100 mL,持續(xù)灌注至大鼠四肢和全身肌肉不停抽動(dòng);將僵硬的大鼠俯臥至手術(shù)臺(tái),沿原切口打開(kāi)皮膚及肌肉,見(jiàn)到原脊髓打擊部位,去除椎管周?chē)錾尺B組織,小心取出損傷中心上下長(zhǎng)約1.5 cm脊髓組織,每組取16個(gè)脊髓標(biāo)本予以制成脊髓勻漿,用于TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10檢測(cè);其余16個(gè)脊髓標(biāo)本作HE染色用。

1.6 HE染色取出脊髓組織塊用PBS反復(fù)沖洗后置于40 g/L多聚甲醛PBS(pH=7.4)中固定12 h后,梯度乙醇脫水、透明、包埋、修剪平齊后連續(xù)切片,制備3 μm組織切片、貼片、烤片,用于HE染色鏡檢。

1.7 免疫酶聯(lián)法(ELISA)檢測(cè)各組脊髓組織中炎癥因子變化將所取脊髓組織放入勻漿器中,以0.1 g∶0.9 mL加入預(yù)冷的等滲鹽水研磨制備腦組織勻漿液,勻漿后以800 r/min離心10 min,取上清液,為10%組織勻漿液,上清液中加入等體積三氯甲烷混勻后,以3 500 r/min離心15 min,取上清液分為3管,采用ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10水平,嚴(yán)格按TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,勻漿中蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,最后標(biāo)本TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10含量以ns/g蛋白質(zhì)表示。

2 結(jié) 果

2.1 肢體功能行為學(xué)對(duì)術(shù)后兩周內(nèi)大鼠脊髓損傷后進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分,發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組沒(méi)有任何運(yùn)動(dòng)障礙,而模型組和BCG治療組在術(shù)后均表現(xiàn)出后肢的癱瘓,BBB評(píng)分趨近于0,模型型組和BCG治療組相比,前者評(píng)分顯著低。見(jiàn)表1。

表1 不同分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后的BBB評(píng)分比較分,n=24]

2.2 大鼠脊髓損傷的組織病理學(xué)變化通過(guò)HE染色觀察大鼠脊髓損傷的組織病理學(xué),結(jié)果顯示假手術(shù)組無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞增生和細(xì)胞空泡變性;模型組可見(jiàn)大量細(xì)胞空泡變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分細(xì)胞核固縮;BCG治療組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞減少、空洞較模型組減小,結(jié)構(gòu)排列較完整。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察大鼠脊髓損傷組織病理學(xué)變化(×400倍)

2.3 Elisa法檢測(cè)脊髓損傷后炎癥因子的表達(dá)模型組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量高于BCG治療組(P<0.05),TGF-β和IL-10含量低于卡介苗治療組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組脊髓組織中炎癥因子含量比較

3 討 論

SCI后經(jīng)歷了穩(wěn)態(tài)被破壞、免疫炎癥反應(yīng)、再生及瘢痕形成和組織重塑四個(gè)階段,免疫反應(yīng)是損傷修復(fù)必經(jīng)的一個(gè)病理生理過(guò)程,也是下一步組織再生的先決條件[6-7]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)SCI后機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)具有神經(jīng)保護(hù)作用[8],主動(dòng)或被動(dòng)用脊髓自身抗原免疫提高動(dòng)物脊髓損傷后自身免疫T細(xì)胞的數(shù)量和活性能明顯增加損傷后神經(jīng)元的存活和神經(jīng)功能的恢復(fù)[9],調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類(lèi)自然產(chǎn)生的能控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群,對(duì)自身抗原有很高的親和力,通過(guò)直接接觸或分泌抗炎因子IL-10、TGF-β等抑制T細(xì)胞的增殖和活化[10]。相關(guān)研究表明[11-12],BCG具有非特異性免疫刺激作用,可誘導(dǎo)Treg生成,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),對(duì)機(jī)體具有免疫保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示,模型組和BCG組的促炎因子IL-1β、TNFα及IL-6均較假手術(shù)組升高,BCG組促炎因子較模型組有下降;在抑炎因子IL-10,TGFβ的表達(dá)上,模型組抑炎因子較假手術(shù)組升高,說(shuō)明BCG具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)SCI后的免疫炎癥反應(yīng)。既往研究[3]表明,SCI后最早參與反應(yīng)的是脊髓固有的小膠質(zhì)細(xì)胞,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由靜息狀態(tài)的高度分枝樣變?yōu)榘⒚装蜆?吞噬清理組織碎片,并分泌多種促炎因子,如IL-1β、TNFα、IL-6等,作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體,刺激炎癥介質(zhì)的表達(dá),募集外周血源性免疫細(xì)胞進(jìn)入損傷區(qū),同時(shí)啟動(dòng)并維持適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13-14]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SCI后給予TNF-α抑制劑或通過(guò)TNF-α的基因敲除可改善運(yùn)動(dòng)功能、減少細(xì)胞凋亡和組織損傷并降低與SCI有關(guān)的炎癥反應(yīng)[15];IL-10與其抗體結(jié)合對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用[9,16-17];IL-6在創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起重要作用,是SCI后急性和亞急性期最常見(jiàn)的促炎細(xì)胞因子之一[18];TGF-β細(xì)胞因子是有效的人類(lèi)免疫調(diào)節(jié)劑,TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)可以將CD4+細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)reg ,早期應(yīng)用TGF-β可拮抗TNF-α的促炎作用,減輕活化的單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷[10]。研究[12]表明,BCG具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中免疫因子變化,抑制相關(guān)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究中,HE染色顯示BCG治療組炎癥細(xì)胞較模型組減少、空洞較模型組減小,結(jié)構(gòu)排列較模型組完整。術(shù)后大鼠后肢BBB評(píng)分結(jié)果也顯示BCG治療組優(yōu)于模型組,充分說(shuō)明BCG可能具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,進(jìn)而對(duì)損傷的脊髓有保護(hù)作用。

綜上所述,卡介苗可通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá),并進(jìn)一步調(diào)節(jié)SCI后的炎癥反應(yīng),可能在一定程度上對(duì)大鼠SCI具有保護(hù)作用。

利益沖突說(shuō)明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準(zhǔn)及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過(guò)貴州省骨科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20220512),為動(dòng)物實(shí)驗(yàn),故知情同意免除。