臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合負(fù)壓封閉引流技術(shù)治療糖尿病足潰瘍的療效觀察

王小飛，高素文，張貞

作者單位：邯鄲市中心醫(yī)院，a燒傷整形科，b內(nèi)分泌二科，c普外六科，河北 邯鄲056001

糖尿病是慢性代謝紊亂疾病，常由胰島素缺乏或胰島素信號(hào)失調(diào)引起［1-3］。糖尿病足潰瘍（DFU）作為糖尿病晚期的主要并發(fā)癥，常合并下肢動(dòng)脈閉塞和（或）感染，具有高致殘率、創(chuàng)口遷延不愈的特點(diǎn)［4-5］。目前，臨床治療過程中感染、代謝紊亂以及缺血等導(dǎo)致的傷口愈合緩慢仍為重大挑戰(zhàn)。負(fù)壓封閉引流（VSD）為目前促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效方法，已廣泛應(yīng)用于DFU病人的治療［6-7］，但是單獨(dú)使用療效仍需提高。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植（UCMSCs）由于免疫調(diào)節(jié)劑自我更新以及低免疫原性等優(yōu)勢(shì)成為近年來臨床研究熱點(diǎn)，在體內(nèi)移植中使用具有較好的有效性及安全性［8-9］。但是目前將其用于治療DFU的相關(guān)研究較少，還需進(jìn)一步明確其效果。因此，本研究使用UCMSCs聯(lián)合VSD治療糖尿病足潰瘍并探究其療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020年5月至2022年5月邯鄲市中心醫(yī)院接收的86例DFU病人，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為引流組（43例）和聯(lián)合組（43例）。其中引流組年齡（62.78±6.35）歲；男25例，女18例；糖尿病病程（10.53±1.15）年；DFU病程（4.12±0.56）月。聯(lián)合組年齡（63.14±6.42）歲；男28例，女15例；糖尿病病程（10.89±1.21）年；DFU病程（4.35±0.61）月。兩組年齡（t=0.89，P=0.378）、性別（χ2=0.44，P=0.506）、糖尿病病程（t=1.41，P=0.16）及DFU病程（t=1.82，P=0.072）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為DFU［10］；（2）符合糖尿病潰瘍分級(jí)Ⅱ～Ⅳ病人；（3）自愿簽署知情同意書病人；（4）患肢創(chuàng)面未累及踝部病人；（5）潰瘍大小為2.5 cm×3.0 cm～6.4 cm×7.6 cm的病人。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重肝腎功能損害病人；（2）合并高滲性昏迷、酮癥酸中毒等糖尿病急性并發(fā)癥病人；（3）足部潰瘍?yōu)榉派湫?、結(jié)核性及癌性病人；（4）不能接受本研究治療方法病人。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20200317）。樣本量計(jì)算，依據(jù)N=［（Zα/2+Zβ）2×σ2］/δ2，Zα/2=1.96，Zβ=1.28，σ=15，δ=10，利用公式計(jì)算得樣本量為24，本研究納入86例，每組43例，可進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 方法 兩組病人均給予改善微循環(huán)、控制血糖等常規(guī)治療。每天進(jìn)行1次清創(chuàng)換藥。引流組：VSD材料（廣州市快康醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：粵械注準(zhǔn)20162641544），關(guān)閉負(fù)壓后可沖洗灌注0.9%氯化鈉注射液（山東威高藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20043629）20～50 mL，注射液經(jīng)引流管流出或充滿負(fù)壓護(hù)創(chuàng)材料（在醫(yī)用透氣膜下）關(guān)閉沖洗管及引流管，保留注射液30 min后將負(fù)壓重新啟動(dòng)，每天1次。一般使用6～8 d拆除負(fù)壓裝置，如若生長良好（肉芽組織），直接將創(chuàng)面縫合，若生長較差，繼續(xù)進(jìn)行VSD至生長良好，進(jìn)而縫合創(chuàng)面。

聯(lián)合組：VSD（同對(duì)照組）+UCMSCs：UCMSCs移植劑量及時(shí)間節(jié)點(diǎn)見表1，結(jié)束后每隔2 d進(jìn)行常規(guī)創(chuàng)面處理及換藥。

表1 UCMSCs移植劑量及時(shí)間節(jié)點(diǎn)

UCMSCs制備方法：采集本院婦產(chǎn)科符合標(biāo)準(zhǔn)的臍帶標(biāo)本并在48 h內(nèi)分離。以棄盡臍帶保存液并沖洗2～3次（PBS），移至培養(yǎng)皿中，截取符合標(biāo)準(zhǔn)的2～4 cm小段，剔除臍動(dòng)脈及臍靜脈，再?zèng)_洗4～8次（PBS）。經(jīng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)、離心、冷凍等方式提取UCMSCs，最后將細(xì)胞混懸液裝至細(xì)胞凍存袋中，以程控降溫儀降溫后將其轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。使用前，在37 ℃恒溫水中復(fù)蘇，恢復(fù)至室溫方可使用。

流式細(xì)胞術(shù)UCMSCs表面標(biāo)志物鑒定：收集P4或P5代細(xì)胞，加入胰蛋白酶（0.25%）進(jìn)行消化處理，時(shí)間為3 min，用DMEM低糖培養(yǎng)基終止消化后收集細(xì)胞，半徑8 cm離心（轉(zhuǎn)速為1 200 r/min）5 min后用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并置于EP管中，于各管細(xì)胞中加入FITC標(biāo)記的CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，放置于4 ℃冰箱中孵育30 min，孵育結(jié)束后加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測UCMSCs表面標(biāo)志物。

1.3 指標(biāo) （1）創(chuàng)面愈合時(shí)間及愈合率，第1次清創(chuàng)至完全愈合為創(chuàng)面愈合時(shí)間。（原始-未愈合）/原始潰瘍創(chuàng)面面積×100%為創(chuàng)面愈合率。（2）足部相關(guān)指標(biāo)，分別于治療前后以下肢動(dòng)脈彩色多普勒檢查病人足背動(dòng)脈血管內(nèi)徑、血流速度，以全自動(dòng)動(dòng)脈硬化檢測儀檢測病人踝肱指數(shù)（ABI）。（3）周圍血管恢復(fù)情況，以密歇根神經(jīng)體征評(píng)分（MNSI）評(píng)估患足周圍血管恢復(fù)情況（分別于治療前后），量表總分最高為10分，＞5分即可診斷為神經(jīng)病變，見表2。

表2 密歇根神經(jīng)體征評(píng)分（MNSI）評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

于治療后進(jìn)行CT血管造影（CTA）檢查，評(píng)估周圍血管情況，使用CT掃描儀（Sensation）（64排，0.5 mm層厚，0.6 mm層距，150 Hu閾值）。出發(fā)點(diǎn)為髂總動(dòng)脈分叉處，靜脈期（延遲25 s）、動(dòng)脈期延遲8 s，平均掃描（長度通過病人情況選?。?2 s。注射歐乃派克［碘海醇，通用電氣藥業(yè)（上海）有限公司，批號(hào)20090811，1.5 mL/kg，4 mL/s］，后注入0.9%氯化鈉溶液（適量），數(shù)據(jù)傳輸至工作站處理。（4）炎癥指標(biāo)，抽取病人空腹靜脈血3 mL（分別于治療前后），以血細(xì)胞分析儀檢測病人C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞百分比（NEU%）水平。（5）腎功能，抽取病人空腹靜脈血3 mL（分別于治療前后），以全自動(dòng)生化分析儀檢測病人尿酸、肌酐水平。（6）臨床療效，標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀、創(chuàng)面無變化或加重為無效；②臨床癥狀改善，30%＜創(chuàng)面愈合率＜70%，為有效；③臨床癥狀明顯改善，創(chuàng)面愈合率≥70%為顯效；④臨床癥狀體征消失，創(chuàng)面基本愈合、愈合，為治愈。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件完成對(duì)本研究數(shù)據(jù)分析。周圍血管恢復(fù)情況、創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合率、炎癥指標(biāo)及腎功能為計(jì)量資料行描述，進(jìn)行獨(dú)立樣本t（組間）和配對(duì)t檢驗(yàn)（組內(nèi)）；臨床療效等計(jì)數(shù)資料行例（%）描述，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs細(xì)胞的鑒定 UCMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示UCMSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD34、CD45，符合鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可用于接下來的研究。

2.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合率 相較于引流組，聯(lián)合組的創(chuàng)面愈合率上升，愈合時(shí)間下降（P＜0.05）。見表3。

表3 糖尿病足潰瘍（DFU）86例創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合率/

表3 糖尿病足潰瘍（DFU）86例創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合率/

組別引流組聯(lián)合組t值P值例數(shù)43 43創(chuàng)面愈合時(shí)間/d 31.46±3.25 27.34±2.76 6.34＜0.001創(chuàng)面愈合率/%52.78±5.35 68.42±6.95 11.69＜0.001

2.3 足部相關(guān)指標(biāo) 與治療前比較，兩組治療后足背動(dòng)脈血管內(nèi)徑、ABI均明顯升高（P＜0.05），且與治療后引流組比較，聯(lián)合組明顯升高（P＜0.05）；兩組血流速度均明顯降低（P＜0.05），且與治療后引流組比較，聯(lián)合組明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病足潰瘍（DFU）86例足部相關(guān)指標(biāo)/

表4 糖尿病足潰瘍（DFU）86例足部相關(guān)指標(biāo)/

注：ABI為踝肱指數(shù)。

組別引流組治療前治療后t，P值聯(lián)合組治療前治療后t，P值兩組比較t，P值例數(shù)43足背動(dòng)脈血管內(nèi)徑/mm血流速度/（cm/s）ABI 1.86±0.17 1.95±0.21 2.18，0.032 52.75±5.32 47.35±4.75 4.96，＜0.001 0.61±0.15 0.87±0.26 5.68，＜0.001 43 0.64±0.17 0.75±0.21 2.67，0.009 2.35，0.020 1.82±0.15 2.10±0.35 4.82，＜0.001 2.41，0.020 52.14±5.26 41.78±4.27 10.03，＜0.001 5.72，＜0.001

2.4 周圍血管恢復(fù)情況 與治療前比較，兩組治療后MNSI評(píng)分均明顯降低，且與治療后引流組比較，聯(lián)合組明顯降低；治療后，聯(lián)合組血管狹窄程度低于治療前；治療后，聯(lián)合組血管狹窄程度低于引流組（均P＜0.05）。見表5。

表5 糖尿病足潰瘍（DFU）86例周圍血管恢復(fù)情況

2.5 炎癥指標(biāo)、腎功能 與治療前比較，兩組治療后CRP、WBC、NEU%水平均明顯降低（P＜0.05），且與治療后引流組比較，聯(lián)合組明顯降低（P＜0.05）。兩組治療前后尿酸、肌酐水平比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表6。

表6 糖尿病足潰瘍（DFU）86例炎癥指標(biāo)、腎功能/

表6 糖尿病足潰瘍（DFU）86例炎癥指標(biāo)、腎功能/

注：WBC為白細(xì)胞，CRP為C反應(yīng)蛋白，NEU為中性粒細(xì)胞百分比。

組別引流組治療前治療后t，P值聯(lián)合組治療前治療后t，P值兩組比較t，P值例數(shù)43 WBC/（×109/L）CRP/（mg/L）NEU%尿酸/（mol/L）肌酐/（mol/L）9.45±1.06 7.58±0.79 9.28，＜0.001 41.78±4.25 35.78±3.62 7.05，0.001 69.72±7.02 64.31±6.53 3.70，＜0.001 350.17±36.12 345.46±35.11 0.61，0.541 55.23±5.61 53.37±5.35 1.57，0.119 43 56.74±5.75 54.23±5.98 1.98，0.051 0.70，0.48 9.12±1.01 6.42±0.67 14.61，＜0.001 7.34，＜0.001 42.14±4.31 29.36±3.02 31.42，＜0.001 8.93，＜0.001 70.54±7.11 58.14±5.86 8.82，＜0.001 4.61，＜0.001 354.23±36.41 343.58±35.36 1.38，0.172 0.25，0.81

2.6 臨床療效 聯(lián)合組總有效率（95.35%）顯高于引流組，聯(lián)合組臨床療效優(yōu)于引流組（P＜0.05）。見表7。引流組和聯(lián)合組病人治療前后典型病例圖見圖1，聯(lián)合組治療前后CTA遠(yuǎn)端供血情況見圖2。

圖1 糖尿病足治療前、治療25 d后病例情況:A為引流組治療前;B為引流組治療25 d后;C為聯(lián)合組治療前;D為聯(lián)合組治療25 d后

圖2 聯(lián)合組糖尿病足潰瘍右側(cè)股動(dòng)脈CTA遠(yuǎn)端供血情況：A為治療前（狹窄，遠(yuǎn)端供血差）；B為治療3個(gè)月后（支架置入術(shù)后，遠(yuǎn)端供血改善）

表7 糖尿病足潰瘍（DFU）86例臨床療效比較/例（%）

3 討論

DFU病人截肢風(fēng)險(xiǎn)較大，大多DFU截肢病人存活時(shí)間不足5年［11-13］。目前，VSD已廣泛用于DFU治療，具有較好的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合效果［14-15］。成體干細(xì)胞UCMSCs具有增殖、分化及自我更新能力，可分化為肌細(xì)胞、脂肪以及神經(jīng)細(xì)胞等（在相應(yīng)環(huán)境下）［16-17］。毛水紅等［18］研究顯示，UCMSCs可通過轉(zhuǎn)化為創(chuàng)面愈合所需的細(xì)胞、增加血管密度等途徑促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但是目前相關(guān)研究較少，尚不明確其具體價(jià)值。

因此，本研究使用UCMSCs聯(lián)合VSD治療DFU，聯(lián)合組總有效率（95.35%）明顯高于引流組（72.09%）；聯(lián)合組創(chuàng)面愈合率明顯高于引流組，創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯低于引流組；與治療前比較，兩組治療后足背動(dòng)脈血管內(nèi)徑、ABI均明顯升高，且與引流組比較，聯(lián)合組明顯升高；兩組血流速度、MNSI評(píng)分均明顯降低，且與引流組比較，聯(lián)合組明顯降低；聯(lián)合組血管輕度狹窄程度明顯低高于治療前及同期引流組，引流組治療前后血管狹窄程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，UCMSCs聯(lián)合VSD治療DFU可有效改善病人癥狀，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，效果較好。分析其原因，可能是因?yàn)閂SD中負(fù)壓環(huán)境使分泌物單向引流、沖洗創(chuàng)面采用多側(cè)孔引流管進(jìn)行，有利于微循環(huán)的改善，促進(jìn)病人創(chuàng)面愈合。而UCMSCs能夠在缺血環(huán)境下促進(jìn)血管形成，增加毛細(xì)血管密度及血流供應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)口愈合；還可通過分泌趨化因子及旁分泌因子促進(jìn)創(chuàng)面；亦可通過強(qiáng)大的抗炎作用及免疫作用分化為角細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合。兩者聯(lián)合使用可優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，進(jìn)一步提高整體療效。

持續(xù)的慢性炎癥能夠降解膠原蛋白，增加蛋白酶活性，破壞創(chuàng)面，抑制組織重塑及細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響創(chuàng)面恢復(fù)。本研究對(duì)病人炎癥水平進(jìn)行探究顯示，與治療前比較，兩組治療后CRP、WBC、NEU%水平均明顯降低，且與引流組比較，聯(lián)合組明顯降低。提示，UCMSCs聯(lián)合VSD可有效減輕炎癥反應(yīng)，可能是因?yàn)閂SD在負(fù)壓環(huán)境的治療基礎(chǔ)上通過藥液滴注對(duì)病人創(chuàng)面進(jìn)行沖洗，使創(chuàng)面生物負(fù)荷以及炎癥反應(yīng)緩解，加速創(chuàng)面愈合，進(jìn)而提高整體療效。而UCMSCs通過對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)進(jìn)而對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行抑制［19］；且MSCs可自行分泌抑炎因子，能夠調(diào)控相關(guān)通路抑制周圍炎癥因子分泌，利于血管新生，促進(jìn)皮膚修復(fù)及重建，與VSD聯(lián)合使用可進(jìn)一步提高抑炎效果。另外，本研究亦顯示，兩者聯(lián)合使用并不影響病人腎功能，較為安全。

綜上所述，UCMSCs聯(lián)合VSD治療DFU療效顯著，可有效減輕炎癥反應(yīng)，改善臨床癥狀，促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)，效果較好。但是本研究隨訪時(shí)間較短，并不清楚其長期療效，還需在以后研究中延長隨訪時(shí)間明確其效果。