灰霉病致病機(jī)理及其防治措施研究進(jìn)展

王方方，付清泉，史學(xué)偉，王 斌

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的一種常見真菌病害，發(fā)生在植物的莖、葉、花、果實和種子等部位[1]，可以引起1 000 多種果蔬發(fā)病，受到侵染的果蔬表面會出現(xiàn)白色或灰色的霉斑，受感染的部位會出現(xiàn)軟腐爛和褐變，在全球范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（超過100 億美元）[2]。B.cinerea 更容易侵染受損或衰老組織，導(dǎo)致植物損傷嚴(yán)重甚至死亡，并且具有傳播速度快、寄主范圍廣和病原菌遺傳變異性高等特點，被稱為世界第二嚴(yán)重植物病原體[3]。研究表明，B.cinerea 通過侵入寄主的表皮進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生一些細(xì)胞降解酶（CWDEs）[4]、毒素[5]、有機(jī)酸[6]等物質(zhì)來調(diào)控灰霉病的發(fā)病，或者通過基因來調(diào)控灰霉病的發(fā)病[7]。針對B.cinerea 引發(fā)的果蔬腐敗有多種防治方法，包括化學(xué)防治[8]、農(nóng)業(yè)防治[9]和生物防治[10]，這些方法均是通過降低菌體感染率來控制灰霉病的爆發(fā)。

本文總結(jié)了植物生長過程中不同部位（葉片、花序和果穗）感染灰霉病的主要癥狀，影響植物灰霉病發(fā)病的重要因素，B.cinerea 致植物灰霉病的分子機(jī)理，以及植物灰霉病防治技術(shù)，旨在為果蔬灰霉病防治相關(guān)研究提供理論參考。

1 灰霉病的癥狀及發(fā)病特征

1.1 癥狀

B.cinerea 對植物的危害分布在植物生長的整個時期，從葉片部位一直到花序、果穗都可能受到危害。首先會侵染葉片，主要表現(xiàn)為葉片多從葉尖或葉邊緣開始發(fā)病，葉片邊緣有棕色“U”或“V”形損傷，出現(xiàn)淡褐色且不規(guī)則病斑，發(fā)病嚴(yán)重時病斑呈現(xiàn)不規(guī)則輪紋，環(huán)境較潮濕時，病葉組織的下側(cè)可以觀察到大量的灰色孢子[11]。對花序、果穗的危害主要分為兩個時期：第一個時期是在開花前及幼果時期，花序被病菌感染初期呈淡褐色水漬狀，后期發(fā)病部位逐漸轉(zhuǎn)為暗褐色，病部組織軟腐，進(jìn)一步發(fā)展至萎蔫甚至壞死[12]。第二個時期是在果實著色至成熟期階段，果穗上的果實呈火柴頭大小時就會染病，產(chǎn)生淡褐色、水浸狀病斑，后病斑變?yōu)楹稚玔13]。漿果在早期受到侵染時會出現(xiàn)圓形的凹陷病斑，雖然果實的硬度沒有受到影響，但果皮上出現(xiàn)的病斑顏色和正常組織的顏色相比較淺[14]。

1.2 發(fā)病特征

B.cinerea 是一種壞死性兼性腐生病菌，對外界環(huán)境的要求不高，其不僅會在田間發(fā)病，還會在貯藏、運輸過程中造成感染，進(jìn)而引起果蔬腐爛，質(zhì)量下降等不良效果[15]。B.cinerea 擁有廣泛的寄主范圍和多種攻擊模式[16]，并對多種水果、谷類、葉菜、豆類產(chǎn)生病害，尤其會影響葡萄、草莓、番茄等農(nóng)作物產(chǎn)量，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[17]。B.cinerea 主要以菌絲體或菌核隨病殘體在土壤中越夏或越冬，病原菌萌發(fā)產(chǎn)生的分生孢子和菌絲，會伴隨空氣、雨水和人類的生產(chǎn)活動等方式進(jìn)行傳播[18]。外界環(huán)境主要是冠層內(nèi)的小氣候條件會影響灰霉病的發(fā)病，其中的溫度和濕度（相對濕度和自由濕度）更是B.cinerea 感染的關(guān)鍵因素[19]。當(dāng)相對濕度低于81%時，分生孢子不能萌發(fā)，在90%～98%時開始大量萌發(fā)，分生孢子在0～30 ℃之間萌發(fā)，最適溫度為20～25 ℃[20]。B.cinerea 是一種適應(yīng)偏低溫度和較高濕度的病原菌，當(dāng)外界環(huán)境持續(xù)低溫、高濕或光照不足時，植物更容易受到感染，導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)病[21]。除了溫度和濕度影響灰霉病的發(fā)病外，各地區(qū)品種的不同[22]、大氣CO2濃度[23]、定植密度過大[24]、施肥不科學(xué)[25]、生長調(diào)節(jié)劑超量使用[26]等因素都對灰霉病的發(fā)病有誘導(dǎo)作用。

2 B.cinerea 的致病機(jī)理

B.cinerea 對宿主的致病過程包括侵入宿主表皮，殺死植物細(xì)胞和引起組織腐爛三個階段[27]。在致病過程由多種毒素、酶、代謝物、基因等因素共同調(diào)控[5]。

2.1 侵入表皮

分生孢子高度豐富且普遍存在，主要通過傷口或自然開口進(jìn)入宿主細(xì)胞[28]。植物細(xì)胞壁是保護(hù)植物細(xì)胞應(yīng)對外來風(fēng)險的一道屏障，主要是由中膠層、初生壁以及次生壁構(gòu)成，其成分主要是多糖和蛋白質(zhì)，如果膠、纖維素和半纖維素等物質(zhì)[29-30]。作為一種壞死性真菌，B.cinerea 附著胞體的強(qiáng)度不足以破壞植物細(xì)胞壁，且由B.cinerea 造成的植物表皮損傷以及機(jī)械損傷現(xiàn)象很少見，但B.cinerea 能分泌一系列細(xì)胞壁降解酶（CWDEs），降解宿主細(xì)胞壁，從而侵入宿主表皮[31]，例如分泌果膠酶和纖維素酶[29]、多酚氧化酶[32]、蛋白酶和磷酸酯酶[33]、木聚糖酶[34]、淀粉酶[35]等物質(zhì)。其中果膠酶和纖維素酶是重要的兩個酶，果膠酶靶向作用于細(xì)胞壁中的大多數(shù)多糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁裂解[29]。果膠酶和纖維素酶在協(xié)同作用下能促使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞與解離，細(xì)胞壁被降解后會引起組織軟化，進(jìn)而使得表皮的保護(hù)屏障受損，由此增加了擦傷的可能性，并為真菌提供了單糖作為碳源的途徑，有利于B.cinerea 的侵入、定殖和擴(kuò)展[3]。此外，B.cinerea 還具有六種不同降解細(xì)胞壁的聚半乳糖醛酸酶（PGs）基因，它們是可以介導(dǎo)宿主相互作用和潛在宿主強(qiáng)化基因的強(qiáng)活性代謝物，其中多聚半乳糖醛酶是主要的降解酶，也是致病因子之一[36]。

2.2 殺死植物細(xì)胞

B.cinerea 裂解宿主細(xì)胞壁以達(dá)到破壞其表皮保護(hù)屏障的效果，在細(xì)胞壁裂解后會進(jìn)一步侵入寄主細(xì)胞組織，破壞植物細(xì)胞，從而加速灰霉病的發(fā)生[37]。

2.2.1 毒素的致病作用

在B.cinerea 侵入植物表皮的過程中，會分泌一些植物毒性代謝物，主要為高倍半萜烯葡萄孢素（Sesquiterpen botrydial）和高取代內(nèi)酯（Botcinolide）[31]。其中高倍半萜烯葡萄孢素是非特異性毒素且毒性最高，可以作用于多種農(nóng)作物和基因，其侵染植物的能力很強(qiáng)，更容易引發(fā)感染[17]。除了這兩種毒素之外，草酸也是重要的植物毒性代謝物[29]?；移咸焰呙狗置诓菟峥梢越档椭参锛?xì)胞內(nèi)pH 值并刺激果膠酶、蛋白酶等真菌酶的產(chǎn)生和活性。此外，草酸積累導(dǎo)致Ca2+螯合，進(jìn)而削弱植物細(xì)胞壁的果膠結(jié)構(gòu)[3]。這些毒素在B.cinerea 侵染中發(fā)揮著重要的作用，能夠破壞細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞的質(zhì)壁分離和細(xì)胞器的損傷，加速B.cinerea 的侵染，同時也會使宿主產(chǎn)生褐色病斑、白化或者枯萎等癥狀，對宿主造成不同程度的危害[38]。

活性氧（ROS） 是公認(rèn)植物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（-OH）和某些非自由基氧化劑如氫過氧化物（H2O2）和臭氧（O3），可以轉(zhuǎn)化為自由基[4]。在水果受到B.cinerea 侵染或生物、非生物因素脅迫時，植物與病原體相互作用會短時間產(chǎn)生大量的活性氧[39]。ROS 對入侵病原體具有直接的細(xì)胞毒性，可能通過促進(jìn)角質(zhì)層聚合物的氧化來滲透宿主細(xì)胞，ROS的過度產(chǎn)生會誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，由此造成大量H2O2的積累，最終可誘導(dǎo)超敏反應(yīng)（HR） 的程序性死亡（PCD），宿主中高濃度的ROS 和隨后的細(xì)胞死亡阻礙了生物營養(yǎng)病原體的傳播[5]。

2.2.2 基因的調(diào)控

親環(huán)蛋白（Cyp）是與真菌形態(tài)發(fā)生和產(chǎn)生毒力相關(guān)的成分[36]。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）已被證明是鑒定致病性相關(guān)基因的方法，通過ATMT 法表明了BcCYP2 是灰霉病菌產(chǎn)生毒力的相關(guān)基因，BcCYP2 的破壞不會損害病原體的菌絲生長、滲透、氧化和細(xì)胞壁的完整性，但會延遲分生孢子的萌發(fā)，改變分生孢子的形態(tài)，以及減少感染墊（IC）的形成，產(chǎn)生毒力降低的效果[40]。低聚半乳糖醛酸酶（Oligogalacturonase）被認(rèn)為是植物防御反應(yīng)的激發(fā)因子，它的分泌減少會降低植物的防御反應(yīng)[41]。通過克隆編碼BcPg1 基因進(jìn)行試驗，表明BcPg1 不會顯著影響初始感染的頻率，但可以觀察到參與試驗的果實和葉片的損傷生長速率有了顯著的降低，表明BcPg1 與灰霉病的毒力有關(guān)[42]。此外富含半胱氨酸的受體樣激酶（CRKs）也是普遍存在的植物受體樣激酶，它在植物抗病中起著重要作用，在灰霉病栽培品種中VaCRK2 接種和茉莉酮酸甲酯處理后，抗灰霉病的葡萄品種中VaCRK2 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，引起致病機(jī)制相關(guān)基因（PR）的上調(diào)和活性氧（ROS）的積累，VaCRK2 能促使植物激活PR 基因的表達(dá)和氧化，從而對灰霉病病菌產(chǎn)生抗性[43]。除此之外還有BcVea[27]、Rho3[44]、Slt2-MAPK[45]、BOSI[46]等基因都是灰霉病病菌生長發(fā)育或致病的相關(guān)基因，都發(fā)揮著不同的作用。而且孢子的生長速率也和基因有著重要聯(lián)系，研究表明BcCYP2 介導(dǎo)B.cinerea 菌核的產(chǎn)生和形態(tài)發(fā)生，但對于孢子的萌發(fā)是必不可少的，bmp1 缺失突變體產(chǎn)生正常的分生孢子和菌絲體，但生長速度降低，說明孢子的生長速率和bmp1 有著不可分割的關(guān)系[47]。

3 防治措施

目前對灰霉病的防治策略為“預(yù)防為主，綜合防治”，主要通過化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治技術(shù)對灰霉病進(jìn)行防治。

3.1 化學(xué)防治

化學(xué)防治主要通過噴灑農(nóng)藥進(jìn)行，是目前國內(nèi)使用最多的防治方法[9]。目前用于化學(xué)控制灰霉病的試劑主要包括苯并咪唑類、對二甲酯亞胺類、甲氧基丙烯酸酯類、環(huán)己酰胺、苯（芐）胺基嘧啶類、N-苯基氨基甲酸酯類等，具有高效、快捷、實用性強(qiáng)等優(yōu)勢，其中最主要的殺菌劑為二甲酰亞胺類和苯胺基嘧啶類殺菌劑[48]。但是長期使用化學(xué)殺菌劑會引起植物的抗藥性，往往通過加大藥劑的使用量達(dá)到效果，而過度使用化學(xué)藥劑會造成藥劑的殘留，對人們健康存在潛在威脅，也會對環(huán)境、土壤造成污染，從而導(dǎo)致多方面的不利影響[49]。

通過對比不同殺菌劑對湖北省各地產(chǎn)區(qū)番茄和草莓采集的B.cinerea 的研究可知，腐霉利抗性菌株對二甲酰亞胺類殺菌劑存在正交互抗性，但對苯吡咯類殺菌劑沒有交互抗性[50]。而不同地區(qū)的草莓對于殺菌劑的抗藥性也不相同，通過對河北、北京、四川等6 個不同地區(qū)的草莓進(jìn)行樣本采集，考察不同的殺菌劑對B.cinerea 的抗藥性頻率，研究表明在灰霉病菌樣本群體為251 時，乙霉威、腐霉利、多菌靈抗藥性頻率分別為67.33%、45.02%和64.94%，同時發(fā)現(xiàn)對以上殺菌劑都具有敏感性的菌株僅有3 株且頻率為1.2%，而且對3 種殺菌劑全部表現(xiàn)抗藥性的菌株為17.53%，以上研究表明樣本草莓B.cinerea出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的多重抗藥性現(xiàn)象[51]。

為解決植物對化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗性這一現(xiàn)象，主要措施是將幾種化學(xué)殺菌劑進(jìn)行復(fù)合調(diào)配來延緩灰霉病的發(fā)病，但需要對殺菌劑的使用量進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)控，且針對不同產(chǎn)區(qū)的植物對不同化學(xué)殺菌劑的抗藥性問題需要分析考察當(dāng)?shù)氐赜蛱卣鳎M(jìn)一步確定合適的藥劑來對灰霉病進(jìn)行有效的控制[52]。

3.2 農(nóng)業(yè)防治

農(nóng)業(yè)防治主要通過選育優(yōu)良的抗病品種，在植物生長期階段清理病殘體[9]、控制溫度和濕度[3]、簇緊密度和稀疏、合理的人工輪作[53]、增加穿過和圍繞植物的光照和氣流[2]、衰老組織的物理去除等方式來降低灰霉病的感染率。

豇豆灰霉病主要通過農(nóng)業(yè)防治來控制灰霉病的發(fā)病，將豇豆與蔥蒜、禾木類植物進(jìn)行2～3 年的輪作或者將播種期提前因此來避開高溫和多雨時期，及時對種植地區(qū)的溫度、濕度、空氣等環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)控和處理，防止灰霉病發(fā)生或控制灰霉病的發(fā)病[54]。河南一地區(qū)通過農(nóng)業(yè)防治、生態(tài)防治建立了綠色防控草莓示范基地，主要對草莓優(yōu)質(zhì)抗病的品種進(jìn)行選育或?qū)Σ葺M(jìn)行脫毒種苗、合理進(jìn)行肥料配比和施肥、及時摘除老葉和病葉，對有效抑制灰霉病的發(fā)病提供了一條綠色、高效、安全、環(huán)境友好的技術(shù)模式。在大棚草莓的灰霉病防治中僅僅只靠化學(xué)防治往往是不夠的，需要結(jié)合物理和生態(tài)的防治，特別是將已經(jīng)發(fā)生病害的葉片或組織及時摘除，防止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散造成更加嚴(yán)重的病害，再加上對大棚內(nèi)濕度的控制、白天和晚上溫度的調(diào)整，實現(xiàn)了對大棚內(nèi)草莓灰霉病的有效控制[55]。

雖然通過農(nóng)業(yè)防治來控制灰霉病的發(fā)生能延緩灰霉病的發(fā)生，但農(nóng)業(yè)預(yù)防局限性仍較大，尤其需要對外界溫度和濕度的要求十分嚴(yán)格，且需要及時地識別病害并且摘除病害，一旦控制不好會導(dǎo)致發(fā)病加劇[56]。

3.3 生物防治

生物防治對于灰霉病的控制具有較好的前景和潛力，因為微生物對環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，且菌種的來源廣泛、安全，表現(xiàn)出低污染、無毒殘留等優(yōu)勢[57]。目前用于生物防治灰霉病的菌種主要為細(xì)菌和酵母菌等，通過不同的菌種來控制不同植物的灰霉病是有效的。拮抗生物的主要作用機(jī)制是通過寄生植物的寄生、營養(yǎng)的競爭、誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）、誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性（ISR）等多種防御機(jī)制的產(chǎn)生來防治灰霉病[58]。

用于生物防治的細(xì)菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等?？莶菅挎邨U菌NSW-3-1 是從黨參中篩選出來的一株具有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌，當(dāng)發(fā)酵液菌種濃度為1×108CFU/mL 時防治的效果最好，并且該菌株不僅有很好的抑制作用，而且可以促進(jìn)黨參的生長，是一株良好的生物防治細(xì)菌[59]?？莶菅挎邨U菌L1-21 可以在植物內(nèi)部組織定殖，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，通過和B.cinerea 共同培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌L1-21 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗作用，且濃度越高疾病的發(fā)生率越低，從而達(dá)到了較好的控制效果[60]。從銀杏組織分離的內(nèi)生細(xì)菌菌株中篩選出來了一株B.cinerea 抑菌活性較好的解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為79.06%，能夠顯著抑制病原菌的菌絲生長。此外木霉DQ-1、貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1、印楝內(nèi)生放線菌R6 等植物中篩選出來的細(xì)菌都可以有效的控制灰霉病的發(fā)生且促進(jìn)植物的生長，是優(yōu)質(zhì)的細(xì)菌生物防治菌[61]。

酵母作為采后灰霉病的生物防治菌株具有很好的抗菌效果。從水果中篩選出來了一株美極梅奇酵母（Metschnikowia zizyphicola）T-2，它可以通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）來減少藍(lán)莓在貯藏期引起的果實腐爛，通過對藍(lán)莓在儲藏期品質(zhì)的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、風(fēng)味指標(biāo)等指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母T-2 不會損害藍(lán)莓的品質(zhì)，且該菌株會誘導(dǎo)藍(lán)莓體內(nèi)的黃酮和酚類物質(zhì)的積累來提高藍(lán)莓的抗性，通過將藍(lán)莓經(jīng)過美極梅奇酵母T-2 的處理后平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其可直接抑制B.cinerea 的菌絲生長和孢子萌發(fā)[62]。白色念珠菌（Candida pseudolambica） 是一種常見于各種環(huán)境中的酵母，用從海洋中分離出來的一株白色念珠菌W-16 處理侵染B.cinerea 桃子的第3 天，發(fā)現(xiàn)灰霉病的發(fā)病率降低了41.2%，說明白色念珠菌W16 對桃子灰霉病的防治有較好的效果，且白色念珠菌W-16 產(chǎn)生的VOCs 抑制了B.cinerea 的菌絲生長和分生孢子的萌發(fā)，并引起了菌絲體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的異常，但其不會對桃子的品質(zhì)產(chǎn)生影響[63]。美極梅奇酵母T-2、白色念珠菌W16 可以通過VOCs 與果實相互作用來提高其抗性和直接抑制B.cinerea 的生長，從兩個方面降低了宿主的發(fā)病率，除此之外還有解淀粉芽孢桿菌BP30、酵母菌KD-16J、間型假絲酵母C410 等多種酵母菌都可以較好的抑制灰霉病的發(fā)病[64]。

4 小結(jié)

灰霉病作為一種危害植物的真菌病害，嚴(yán)重時可以造成80%的減產(chǎn)，受到了人們廣泛的關(guān)注[65]。灰霉病的致病機(jī)制是多方面的，致病菌B.cinerea 通過侵入寄主表皮在植物組織中迅速生長，通過產(chǎn)生酶類、毒素、有機(jī)酸、基因等多方面影響植物生長。目前對灰霉病的控制主要通過化學(xué)、農(nóng)業(yè)及生物防治方法，但化學(xué)試劑的過量使用會造成環(huán)境的污染和農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重危害了環(huán)境及人類健康，農(nóng)業(yè)防治工程量較大且不易控制，相較而言生物防治的安全、無毒無害等優(yōu)勢較明顯，應(yīng)該積極發(fā)展生物方面對灰霉病的防治，加快環(huán)境友好型微生物菌劑的研制、升級和示范推廣。總之利用可替代策略來控制病害的發(fā)生已經(jīng)成為了迫切的需求，安全、綠色、高效、可行的使用無公害綠色的防治手段日益受到了重視，成為今后科研的研究重點。