不同地區(qū)桃樹(shù)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

徐海忠，薛彥華，丁洪發(fā)，戚恒瑞，李天昊，毛偉健*，程凡升*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東天同食品有限公司，山東 臨沂 276000）

人類(lèi)活動(dòng)引起的全球變化包括大氣二氧化碳濃度升高、氣候變暖、降水變化、干旱和大氣氮沉降增加，是全球范圍內(nèi)生物多樣性喪失的主要因素[1]。土壤微生物在維持地下生態(tài)系統(tǒng)的功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2-4]。相較于傳統(tǒng)土壤物理與化學(xué)指標(biāo)，土壤微生物指標(biāo)優(yōu)勢(shì)在于對(duì)土壤環(huán)境變化具有較高的敏感性[5]，可以對(duì)土壤健康進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，是評(píng)價(jià)土壤健康的理想指示生物[6]。土壤的理化性質(zhì)可以影響土壤微生物群落的特征[7]。鮑佳書(shū)等[8]運(yùn)用高通量測(cè)序分析了3 個(gè)不同品種甘薯根際土壤細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)土壤含水率、電導(dǎo)率、總氮與Chao1、ACE、Shannon 和Sobs 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明含水率、電導(dǎo)率、總氮影響土壤微生物群落從而影響甘薯的生長(zhǎng)發(fā)育。邢佳麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH 值是影響細(xì)菌群落最大的環(huán)境因子。而關(guān)于土壤理化性質(zhì)與桃樹(shù)根際微生物群落的關(guān)系研究較少。

桃，薔薇科杏屬，是我國(guó)重要的落葉果樹(shù)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，風(fēng)味宜人，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。根系作為吸收水分、養(yǎng)分和氧氣的重要器官，是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。根系管理是果樹(shù)栽培管理的核心，合理的根系管理是實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵[10]。臨沂市是農(nóng)業(yè)大市，氣候條件適宜桃樹(shù)生產(chǎn)，是全國(guó)果品重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨沂市桃產(chǎn)量自2000 年開(kāi)始一直為全國(guó)地級(jí)市第一位，2009 年被中國(guó)果品流通協(xié)會(huì)授予中國(guó)桃業(yè)第一市的稱(chēng)號(hào)。其中蒙陰、沂水、費(fèi)縣為桃生產(chǎn)大縣[11]。目前，有關(guān)臨沂地區(qū)桃樹(shù)根際土壤微生物多樣性的研究尚無(wú)報(bào)道。為促進(jìn)桃樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和桃果實(shí)的品質(zhì)提升，本試驗(yàn)對(duì)臨沂不同地區(qū)桃樹(shù)根際細(xì)菌進(jìn)行了高通量測(cè)序，了解不同桃樹(shù)根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、物種組成的差異，為臨沂桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地（118.35°E、35.05°N）位于山東省臨沂市沂水縣、湯頭鎮(zhèn)、李官鎮(zhèn)，氣候?yàn)榕瘻貛Ъ撅L(fēng)大陸型氣候，四季分明，雨量充沛，氣侯溫和，全年平均氣溫14.1 ℃，最高氣溫36.5 ℃，最低氣溫-11.1 ℃，年降水量849 mm，全年無(wú)霜期200 d 以上。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1 月10 日進(jìn)行土壤樣品采集，采用5 點(diǎn)取樣法，每個(gè)地區(qū)設(shè)置3 個(gè)采樣點(diǎn)，去除地表0～5 cm 的土壤，取樹(shù)根地表附近的土壤，剔除碎石和植物殘根等雜物，3 個(gè)采樣點(diǎn)土壤混勻后運(yùn)用四分法取樣取500 g 土裝入無(wú)菌袋，帶回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣本去除根系、碎葉和石塊后，過(guò)2 mm的篩子，分成兩部分。一部分土壤樣品保存在-80 ℃進(jìn)行DNA 提取，用于分析土壤微生物群落多樣性；另一部分土壤風(fēng)干，進(jìn)行理化分析。1、2 和3 號(hào)土壤樣本編號(hào)分別為L(zhǎng)G（李官）、TT（湯頭）和YS（沂水）。

1.3 土壤理化指標(biāo)測(cè)定

土壤pH 采用pH 計(jì)測(cè)定，土壤水分含量采用重量分析法測(cè)定，電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀測(cè)定[12]，速效磷含量采用NaHCO3萃取比色法測(cè)定[13]，速效鉀含量采用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定[14]。

1.4 土壤微生物群落測(cè)定

采用土壤DNA 試劑盒提取土壤細(xì)菌總DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總DNA 質(zhì)量，然后將DNA 送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 對(duì)土壤理化性質(zhì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。參考Bokulich 等[15]的方法使用Trimmomatic 0.33、Cutadapt 1.9.1、USEARCH 10、UCHIME 8.1、USEARCH 10.0、QIIME 等軟件進(jìn)行土壤微生物群落分析。參考Desantis 等[16]對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)Silva.138、微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（IMG，Integrated Microbial Genomes）計(jì)算Alpha 多樣性指數(shù)（ACE、Chao1、Shannon 和Simpson），對(duì)門(mén)和屬水平的群落結(jié)構(gòu)分析，以確定各樣品群落組成及預(yù)測(cè)整個(gè)群落的COG 通路情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析

通過(guò)對(duì)9 份取自臨沂湯頭、李官、沂水三個(gè)地區(qū)桃園桃樹(shù)根土壤樣品微生物16S rRNA 基因高通量測(cè)序分析，共得到693 380 條有效序列，經(jīng)過(guò)濾、去除嵌合體后，得到425 267 條優(yōu)質(zhì)序列。其中樣品LG-1 號(hào)樣品獲得最多的序列為58 546 條，LG-3 號(hào)樣品獲得序列最少為39 973 條。統(tǒng)計(jì)各樣品中相應(yīng)長(zhǎng)度范圍內(nèi)的序列數(shù)，發(fā)現(xiàn)序列長(zhǎng)度主要集中在400～450 bp。

如圖1 所示，在維恩圖中，每種顏色代表不同的組，重疊段的編號(hào)表示組間共享的OTU 數(shù)量。

圖1 土壤樣品特征Venn 圖Fig.1 Venn diagram of soil sample characteristics

測(cè)序結(jié)果顯示，LG 組包含1 049 個(gè)OTU，TT 組包含1 666 個(gè)OTU，YS 組包含1 460 個(gè)OTU。三組共享165 個(gè)OTU；LG 和TT 兩組共享417 個(gè)OTU，LG 和YS 兩組共享267 個(gè)OTU，TT 和YS 兩組共享367 個(gè)OTU；LG 組獨(dú)有890 個(gè)OTU，TT 組獨(dú)有1 047 個(gè)OTU，YS 組獨(dú)有991個(gè)OTU。

2.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性由Chao1 與Shannon 指數(shù)共同表示，箱線圖可以直觀地反映組間物種多樣性差異是否顯著。在OTU 水平上對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行分類(lèi)并計(jì)算Alpha 多樣性，根據(jù)T 檢驗(yàn)計(jì)算細(xì)菌群落組間差異性，結(jié)果如圖2所示。兩指數(shù)均證明，TT 組土壤細(xì)菌群落Alpha 多樣性顯著高于LG 組和YS 組（P＜0.01）。數(shù)值方面，TT 組Chao1 指數(shù)集中于800～970，Shannon 指數(shù)集中于9.0～9.4；LG 組Chao1 指數(shù)集中于620～740，Shannon 指數(shù)集中于8.5 ～8.7。YS 組Chao1 指數(shù)集中于670 ～760，Shannon 指數(shù)集中于8.9～9。物種豐富度（Chao1）、均勻度（Shannon 指數(shù)）和觀察到的物種多樣性分析表明，三個(gè)地區(qū)的土壤樣品細(xì)菌種群分布大致相同，且豐富度上存在差異。

圖2 Alpha 多樣性指數(shù)組間差異箱線圖Fig.2 Boxplot of Alpha diversity index differences between groups

在Alpha 多樣性指數(shù)組間差異分析中，香農(nóng)指數(shù)是評(píng)價(jià)樣品中微生物多樣性的指標(biāo)之一。如圖3 所示，土壤樣品的細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)趨于平穩(wěn)，表明增加土壤細(xì)菌的測(cè)序量，其樣品細(xì)菌的多樣性已經(jīng)不再變化。稀疏曲線趨于達(dá)到飽和平臺(tái)，表明樣本的微生物群足夠大，可以在97%的相似性閾值下估計(jì)表型豐富度和微生物群落多樣性。如圖4 顯示，TT 的土樣比另外兩組土樣具有更陡峭的斜率，說(shuō)明TT 的土樣具有更大的遺傳豐富度。

圖3 土壤樣品香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.3 Shannon index curve of soil sample

圖4 土壤樣品稀釋性曲線Fig.4 Dilution curve of soil sample

物種相對(duì)豐度累積曲線圖反映樣本數(shù)量與注釋到的物種數(shù)量之間的關(guān)系。如圖5 所示，在一定范圍內(nèi)，隨著樣本量的加大，紅色累積曲線急劇上升，表示群落中有大量新物種被發(fā)現(xiàn)，最后曲線趨于平緩，此時(shí)土壤中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多；綠色共有量曲線表現(xiàn)為下降，表示樣本中新發(fā)現(xiàn)的共有物種在逐漸減少，當(dāng)曲線趨于平緩，表示土壤中的共有物種趨于飽和。

圖5 土壤樣品等級(jí)豐度曲線Fig.5 Grade abundance curve of soil samples

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)土壤微生物基因組DNA 序列分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，三個(gè)地區(qū)共包含4 175 個(gè)OTU。物種分類(lèi)顯示細(xì)菌種類(lèi)隸屬于25 門(mén)54 綱145 目272 科497 屬577 種（圖6）。

圖6 土壤樣品物種分布圖Fig.6 Species distribution map of soil samples

在門(mén)水平上，將土壤細(xì)菌測(cè)得序列鑒定為疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、粘菌門(mén)（Myxcoccota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、線菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobateria）等。其余為相對(duì)豐度小于1%的微生物群落。三個(gè)不同地區(qū)樣本都以變形菌門(mén)為主，LG、TT、YS 樣本平均相對(duì)豐度為35.04%、41.46%和33.12%。樣本門(mén)水平細(xì)菌集中分布于變形菌門(mén)、線菌門(mén)與酸桿菌門(mén)中，這3個(gè)門(mén)平均相對(duì)豐度之和占總數(shù)的60%以上。從不同地區(qū)看，主要優(yōu)勢(shì)菌群基本保持穩(wěn)定，但相對(duì)豐度具有一定差異。

在屬水平上，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）與酸桿菌屬（RB41）是桃根際土壤微生物中最主要的屬。在LG、TT、YS 三個(gè)土壤樣品中含量分別為10.47%、8.31%和11.55%。遺憾的是，基于數(shù)據(jù)度silva.138 的注釋結(jié)果中，本研究中LG、TT 與YS 三組樣本中分別有78.93%、79.86%與81.74%的樣本未分類(lèi)到屬。然而，3 組樣品中前3 個(gè)屬的微生物組成相同，各屬的豐富度存在差異。

2.4 Beta 多樣性分析

Beta 多樣性分析用于分析時(shí)間、空間尺度上的物種組成變化。從屬水平對(duì)各樣品進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖7 所示，PC1 的貢獻(xiàn)率為49.69%，PC2 的貢獻(xiàn)率為30.58%。LG 組、TT 組和YS 組在PCA 圖上明顯分開(kāi)，表明不同地區(qū)的桃根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，尤其是TT 地區(qū)微生物多樣性高于LG 和YS 地區(qū)。LG 組組內(nèi)距離較大，說(shuō)明這兩個(gè)樣本的組內(nèi)差異較大，原因是該地區(qū)土壤環(huán)境較復(fù)雜，菌屬分布不均勻所致。在同一地區(qū)樣本中，細(xì)菌群落表現(xiàn)出聚集性。而不同地區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

圖7 不同地區(qū)土壤微生物主成分分析結(jié)果Fig.7 Principal component analysis results of soil microorganisms in different regions

2.5 土壤細(xì)菌功能基因預(yù)測(cè)分析

基于COG 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)臨沂不同地區(qū)土壤中獲得的非冗余基因集進(jìn)行了基因功能預(yù)測(cè)。COG 功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)中（圖8）可以看出樣本中土壤細(xì)菌功能基因主要集中于新陳代謝、遺傳信息、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面。LG 組中參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、轉(zhuǎn)錄、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝等功能基因相對(duì)豐度顯著高于YS 組。而YS 組中能量生成和轉(zhuǎn)換細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分裂、細(xì)胞壁/膜/被膜的生物合成相關(guān)功能基因相對(duì)豐度顯著低于LG 組。相較于TT 組，LG 和YS 組的遺傳信息功能基因的表達(dá)更為顯著，總體而言三個(gè)地區(qū)的土壤細(xì)菌功能基因的表達(dá)上大致相同，在不同基因相對(duì)豐富度上有所差異。

圖8 COG 功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖Fig.8 COG functional classification statistical chart

2.6 土壤理化性質(zhì)和微生物群落的關(guān)系分析

研究證明微生物群落構(gòu)建過(guò)程與土壤理化性質(zhì)存在密切關(guān)系[17]。由表1 可知，土壤電導(dǎo)率與Chao1、ACE、Shannon 指數(shù)呈正相關(guān)，而與Simposon 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，速效磷、有機(jī)質(zhì)與Chao1、ACE、Shannon、Simposon 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，pH 和速效鉀與Chao1、ACE、Shannon、Simposon 指數(shù)呈正相關(guān)，土壤pH 和速效鉀與Chao1 和ACE 指數(shù)顯著相關(guān)。

表1 土壤細(xì)菌多樣性與其理化性質(zhì)之間的相關(guān)性Table 1 The correlations between soil community diversity indexes and soil chemical factors

3 討論

根系是植物和土壤之間的紐帶。健康的土壤環(huán)境可以促進(jìn)根系的發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[18]。土壤細(xì)菌的多樣性和組成因土壤管理歷史而異[19]。不同桃樹(shù)根際土壤的細(xì)菌群落的測(cè)序結(jié)果差異明顯，其中李官地區(qū)1 號(hào)樣品獲得最多的序列為58 546 條，三個(gè)地區(qū)樣品獲得的序列長(zhǎng)度主要集中在400～450 bp，其中李官地區(qū)獲得較多的有效序列。

Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)共同表明湯頭地區(qū)土樣具有的細(xì)菌群落多樣性最高。ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)都表明湯頭地區(qū)土樣具有的細(xì)菌群落豐富度最高。PCA分析顯示不同地區(qū)的桃根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，TT 地區(qū)微生物多樣性高于LG 和YS 地區(qū)。

War 等[20]和Zhang 等[21]認(rèn)為，不同植物物種或同一物種不同基因型間由于根系分泌物不同，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。根據(jù)土壤微生物基因組DNA 序列分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，三個(gè)地區(qū)共包含4 175 個(gè)OTU。物種分類(lèi)顯示細(xì)菌種類(lèi)隸屬于25 門(mén)54 綱145 目272 科497 屬577 種。對(duì)不同桃根際土壤分析表明，列出了細(xì)菌所屬的門(mén)和屬不同分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群及其相對(duì)豐度。多數(shù)細(xì)菌為變形菌門(mén)。變形菌門(mén)是細(xì)菌中主要的門(mén)，這與Jangid 等[22]和劉欣等[23]對(duì)農(nóng)田作物土壤細(xì)菌的研究結(jié)果基本一致。變形菌門(mén)適應(yīng)能力強(qiáng)，是自然界最普遍的菌門(mén)。Fierer 等[24]認(rèn)為，在土壤中變形菌門(mén)能夠參與有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和土壤結(jié)構(gòu)形成，可以有效促進(jìn)桃樹(shù)的生長(zhǎng)，對(duì)桃樹(shù)生長(zhǎng)及桃果實(shí)品質(zhì)有益。結(jié)果顯示，根際土壤細(xì)菌在門(mén)水平上的分類(lèi)信息比較明確，而在屬水平上尚未明確的分類(lèi)較多，這可能與測(cè)序序列長(zhǎng)度、測(cè)序期間和比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)[25]。

基于COG 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)臨沂不同地區(qū)土壤細(xì)菌進(jìn)行了基因功能預(yù)測(cè)，COG 功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)中可以看出樣本中土壤細(xì)菌功能基因以新陳代謝、遺傳信息、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)為主。這些細(xì)菌的代謝過(guò)程能夠把一些不能利用的物質(zhì)分解為植物可以吸收利用的物質(zhì)，有助于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高桃樹(shù)果實(shí)品質(zhì)[26]。

土壤因子對(duì)微生物群落組成和多樣性有一定的影響，其中土壤pH 是影響細(xì)菌群落最大的土壤環(huán)境因子。Oehl 等[27]研究指出，酸性土壤細(xì)菌多樣性最低，中性土壤細(xì)菌多樣性最高。速效磷與細(xì)菌多樣性呈負(fù)相關(guān)，Zhao等[28]研究表示，土壤pH 值與細(xì)菌呈正相關(guān)，土壤速效磷的含量與細(xì)菌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。然而，土壤有機(jī)質(zhì)理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物群落的影響復(fù)雜，目前還沒(méi)得出一致的結(jié)論。

4 結(jié)論

16S rRNA 測(cè)序結(jié)果表明，變形菌門(mén)（Proteobectria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）4 個(gè)菌門(mén)是細(xì)菌絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，臨沂不同地區(qū)桃樹(shù)根際土壤樣品中細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)均存在一定差異，細(xì)菌豐富度和多樣性為湯頭最高，其次是沂水，李官最低。細(xì)菌群落中線菌門(mén)和變形菌門(mén)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。土壤細(xì)菌功能基因表達(dá)以新陳代謝、遺傳信息、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)為主，三個(gè)地區(qū)的土壤細(xì)菌功能基因種類(lèi)上大致相同，在不同基因表達(dá)豐度上有所差異。適宜的土壤養(yǎng)分、良好的土壤微生物環(huán)境是桃樹(shù)生長(zhǎng)良好的條件。因此，改善土壤理化性質(zhì)，保證土壤養(yǎng)分平衡，是當(dāng)前促進(jìn)桃子高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的有效措施。