紅曲霉菌的篩選及其在液態(tài)食醋釀造中的應(yīng)用

杜琳琳　趙祥穎　劉麗萍　黃艷紅　王新文　李夢真　劉建軍

摘要：以大米糖化能力為指標(biāo)，從紅曲米醋傳統(tǒng)發(fā)酵劑烏衣紅曲中分離獲得一株紅曲霉ZSM1，研究優(yōu)化了其液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)酶條件和酶特性。以大米為主要原料，酒精發(fā)酵采用釀酒酵母SFH-JM12，研究了以紅曲霉ZSM1發(fā)酵液作為糖化劑對液態(tài)米醋風(fēng)味品質(zhì)的影響，以傳統(tǒng)液態(tài)米醋釀造糖化劑為對照組，研究比較了發(fā)酵米醋中游離氨基酸、有機酸、風(fēng)味化合物等組成與含量，并進行了感官品評。結(jié)果表明，以紅曲霉ZSM1作為糖化劑，提高了產(chǎn)品中有機酸含量，乳酸含量達到1.11 g/dL，琥珀酸含量達到1.81 g/dL；具有鮮味的谷氨酸含量顯著提高，濃度最高達115.97 mg/g，比對照組提高了16.45倍。甜味氨基酸如絲氨酸含量由4.23 mg/g增加到140.17 mg/g，蘇氨酸含量由37.98 mg/g增加到382.34 mg/g；顯著提高了產(chǎn)品中甲酸-2-甲基丁酯、乙酸丙酯、2，3-戊二酮等芳香化合物的含量，且產(chǎn)品酸而不澀，刺激性氣味顯著減弱，香氣濃郁，具有典型的醋香，紅曲霉ZSM1菌株的應(yīng)用改善提升了液態(tài)米醋的風(fēng)味品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：紅曲霉；烏衣紅曲；米醋；風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號：TS201.3文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0033-07

Screening of Monascus Strain and Its Application in Liquid Vinegar Brewing

DU Lin-lin1，2， ZHAO Xiang-ying1，2，3， LIU Li-ping1，2， HUANG Yan-hong1，2，

WANG Xin-wen3， LI Meng-zhen1，2， LIU Jian-jun1，2*

Abstract： With rice saccharification ability as the index， a strain of Monascus ZSM1 is isolated from the traditional starter Wuyi Monascus of red koji rice vinegar， and its liquid culture enzyme production conditions and enzyme characteristics are optimized. Rice is used as the main raw material， and Saccharomyces cerevisiae SFH-JM12 is used for alcohol fermentation. The effect of Monascus ZSM1 fermentation broth as the saccharifying agent on the flavor and quality of liquid rice vinegar is studied. With saccharifying agent of the brewing of traditional liquid rice vinegar as the control group， the composition and content of free amino acids， organic acids and flavor compounds in fermented rice vinegar are studied and compared， and sensory evaluation is carried out. The results show that the content of organic acids in the product increases when using Monascus ZSM1 as the saccharifying agent， the content of lactic acids reaches 1.11 g/dL and the content of succinic acid reaches 1.81 g/dL. The? content of glutamic? acids with umami significantly increases， and the highest concentration is 115.97 mg/g， which is 16.45 times higher than that of the control group. In terms of sweet amino acids， serine content increases from 4.23 mg/g to 140.17 mg/g， and threonine content increases from 37.98 mg/g to 382.34 mg/g; the content of aromatic compounds such as 2-methylbutyl formate， propyl acetate and 2，3-pentanedione in the product significantly increases， and the product is sour but not astringent， the irritant odor is significantly weakened， the aroma is strong， and it has typical vinegar aroma. The application of Monascus ZSM1 strain has improved the flavor and quality of liquid rice vinegar.

Key words： Monascus; Wuyi Monascus; rice vinegar; flavor substances

紅曲作為一種功能性食品添加劑，在我國常被用于生產(chǎn)紅曲酒和紅曲醋等發(fā)酵食品[1]。

紅曲醋是中國最受歡迎的食醋之一，成品紅曲醋呈現(xiàn)鮮紅的顏色，澄清透亮有光澤，有特殊的甜香味[2]。傳統(tǒng)紅曲醋是由大米或糯米拌入紅曲，通過傳統(tǒng)液體循環(huán)工藝制成。工藝程序繁多、陳釀周期長、人工生產(chǎn)效率低阻礙了紅曲醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。液體深層發(fā)酵是一種先進的快速制醋工藝，采用酶制劑液化、糖化后，純菌種發(fā)酵。該工藝生產(chǎn)效率高且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，但風(fēng)味較差。技術(shù)改進后形成的利用紅曲進行液體深層發(fā)酵制醋工藝簡單、出品率高、生產(chǎn)成本低、食醋風(fēng)味層次豐富。主要利用紅曲中紅曲霉（Monascus sp.）等微生物產(chǎn)生α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶等高活性水解酶，催化淀粉轉(zhuǎn)化成糖，產(chǎn)生的糖進一步被酵母利用產(chǎn)酒精[3]；另外，還分泌蛋白酶、酯化酶和其他風(fēng)味代謝物，發(fā)酵的紅曲醋顏色棕紅透亮、風(fēng)味獨特[4]。

烏衣紅曲屬于紅曲的一種，以大米為生產(chǎn)基質(zhì)接種紅曲霉和黑曲霉，通過長周期固態(tài)發(fā)酵制成紅色米曲[5-6]。目前烏衣紅曲大部分通過地面曲室制曲生產(chǎn)，基于人工經(jīng)驗在非無菌條件下自然發(fā)酵制成[7]。制曲中野生雜菌易多量生長繁殖，不同批次制曲質(zhì)量會有所差異，發(fā)酵過程不可控，產(chǎn)品品質(zhì)難以保證[8]。本研究從傳統(tǒng)烏衣紅曲中分離紅曲霉菌株，將純化后的紅曲霉用作生產(chǎn)米醋糖化劑，探尋其在液態(tài)食醋釀造中的作用，有助于保證發(fā)酵過程可控、菌種可控以及產(chǎn)品質(zhì)量可控的“三控”發(fā)酵，也有利于提升液態(tài)食醋的風(fēng)味品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

烏衣紅曲、黑曲霉：由山東玉兔食品有限公司提供；大米：購自七里堡農(nóng)貿(mào)市場；氨基酸與有機酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自上海麥克林生化科技有限公司；液化酶、糖化酶：購自中國諾維信生物技術(shù)有限公司；釀酒酵母SFH-JM12和醋酸桿菌SFC-YT19：由山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院篩選并保藏。

1.2 主要儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；7200分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技公司；氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀 海能未來技術(shù)集團股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

霉菌篩選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：稱取200.0 g馬鈴薯去皮、切塊后加入蒸餾水，煮沸20～30 min，用雙層紗布過濾，加入葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL；YPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%；淀粉瓊脂平板：可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，水1 000 mL；牛奶瓊脂平板：奶粉10%（115 ℃滅菌15 min），瓊脂4%（118 ℃滅菌20 min），分開滅菌后混合；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，葡萄糖1%，無水乙醇6%；大米培養(yǎng)基：稱取5 g大米加入45 mL蒸餾水，在118 ℃條件下高溫蒸煮20 min，制成米液。

斜面保存培養(yǎng)基：配方同以上培養(yǎng)基，118 ℃滅菌20 min后分裝于試管中擺成斜面，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h確認無雜菌，用于保存菌種使用。

以上培養(yǎng)基均采用118 ℃、20 min的滅菌條件。

1.4 霉菌的分離純化

在無菌條件下將10 g固體烏衣紅曲樣品和玻璃珠加入裝有90 mL 0.85% NaCl的錐形瓶中，在恒溫振蕩器上搖勻30 min，再用裝有無菌棉的玻璃漏斗過濾，得到10-1稀釋液，梯度稀釋后取不同濃度稀釋液100 μL涂布于含有0.05%去氧膽酸鈉的PDA固體平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，挑取具有典型紅曲霉菌形態(tài)特征的單菌落，進一步分離純化。最后接種于斜面試管中，放置于4 ℃冰箱中保藏。

1.5 紅曲霉產(chǎn)酶特性分析

1.5.1 霉菌孢子菌懸液的制備

將保存的霉菌斜面用接種環(huán)刮取適量分生孢子，加入50 mL無菌生理鹽水中，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩均勻，用脫脂棉過濾，去除菌絲制成霉菌孢子菌懸液，孢子濃度通過血球計數(shù)板計數(shù)為105～106spores/mL。

1.5.2 淀粉降解實驗

取2 μL孢子菌懸液加入淀粉瓊脂平板中，在30 ℃下培養(yǎng)4 d。用稀碘液淹沒平板來觀察菌落是否變色，判斷菌株是否具有淀粉降解能力。根據(jù)淀粉遇碘變藍的特性，若菌株可以降解淀粉，則菌落周圍的淀粉被消耗會產(chǎn)生明顯的透明圈。記錄菌落直徑（d1）與周圍透明圈直徑（D1）之比Ra（D1/d1），作為菌株產(chǎn)淀粉酶能力的考量指標(biāo)。

1.5.3 蛋白質(zhì)降解實驗

將2 μL霉菌分生孢子菌懸液加入蛋白質(zhì)牛奶瓊脂平板中，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d。若菌株降解蛋白質(zhì)，菌落周圍的蛋白質(zhì)被消耗，觀察到周圍有透明圈產(chǎn)生。菌落直徑（d2）與周圍透明圈直徑（D2）之比Rb（D2/d2）被記錄下來，作為菌株產(chǎn)蛋白酶能力的考量指標(biāo)。

1.5.4 菌種鑒定

使用常規(guī)微生物鑒定方法[9]。

1.5.5 淀粉酶活性的測定[10]

吸取1 mL稀釋好的粗酶液放入試管中，然后加入5 mL 2%可溶性淀粉溶液，在（40±0.2） ℃恒溫水浴中保持5 min。取1 mL反應(yīng)溶液，加入鹽酸和稀碘液，搖勻，在660 nm處測定吸光度，換算為酶液濃度，使用鹽酸溶液和稀碘液作為對照。淀粉酶活性計算公式如下：

X=N×n。

式中：X為淀粉酶活性（U/mL）；N為測定酶液的濃度（U/mL或U/g）；n為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.5.6 蛋白酶活性的測定

根據(jù)李娜等[11]的方法測定蛋白酶活性。以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：y=0.010 5x+0.021 4。

1.6 曲霉液態(tài)培養(yǎng)

將曲霉分生孢子菌懸液接種到大米培養(yǎng)基中，發(fā)酵中的霉菌孢子總數(shù)為6.0×105個/mL菌懸液。在30 ℃下以180 r/min搖床培養(yǎng)。發(fā)酵12 h取樣后，每6 h取樣一次。發(fā)酵結(jié)束后米漿在8 000 r/min下離心5 min，取上清液進行酶活、pH和還原糖的測定，確定最佳發(fā)酵時間。

使用pH計直接插入樣品懸浮液中測量樣品的pH值；根據(jù)國標(biāo)GB 5009.7－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》中的直接滴定法測定樣品中的還原糖含量[12]。

1.7 米醋釀造工藝流程

1.7.1 接種物的制備

曲霉糖化劑：將紅曲霉ZSM1分生孢子菌懸液（5%）接種到冷卻后的大米培養(yǎng)基中，紅曲霉接種后在30 ℃下以180 r/min搖床培養(yǎng)40 h制成紅曲發(fā)酵液；黑曲霉孢子菌懸液按2%的接種量接種到大米培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后制成黑曲發(fā)酵液；最后按4∶1（紅曲霉∶黑曲霉）的比例混合組成大米糖化劑。

酵母種子液的制備：將釀酒酵母JM12活化后接種在YPD培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液以5 000 r/min離心5 min，收集菌體，重懸于無菌生理鹽水中，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度約為1×108 cells/mL。

醋酸桿菌SFC-YT19接種物的制備：接入醋酸菌液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下以200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心5 min，收集菌體，重懸于無菌生理鹽水中，調(diào)整細胞濃度約為1×108 cells/mL。

1.7.2 米醋的釀造

大米和水按照1∶3的比例混合，室溫下浸泡16～18 h后打漿?；旌厦诐{每瓶300 mL分裝到錐形瓶中，118 ℃滅菌20 min。米醪冷卻至60 ℃后，將紅曲霉制備的糖化液以10%的接種量接種到米醪中，充分混合，糖化12 h，然后將釀酒酵母種子液以5%的接種量接種到糖化米醪中。所有樣品在30 ℃下靜置發(fā)酵8 d，制得米酒；對照組1（糖化酶糖化大米）在混合米漿中加入主料12 U/g的α-淀粉酶，在90～95 ℃液化30 min后于118 ℃滅菌，在無菌條件下加入150 U/g糖化酶，糖化2 h得到糖化米醪，接種釀酒酵母后靜置發(fā)酵；對照組2（烏衣紅曲糖化大米）取主料質(zhì)量12%～15%的烏衣紅曲按1∶5的比例在30 ℃下浸泡40～42 h，混合米漿中直接加入泡曲水于30 ℃靜置發(fā)酵。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵米酒醪過濾除掉大米殘渣，上清液加適量的無菌水調(diào)整酒精度為6%～7%，按10%的接種量接入醋酸桿菌SFC-YT19種子液，在30 ℃下以200 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)至酸度達到4～7 g/dL時，加入2% NaCl終止醋酸發(fā)酵。

1.8 分析方法

1.8.1 總酸的測定

總酸（可滴定酸度）參照GB 12456－2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》中的酸堿指示劑滴定法測定。

1.8.2 游離氨基酸的測定[13]

使用ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的高效液相色譜儀（HPLC）分析食醋中游離氨基酸。樣品處理：取2 mL稀釋后的樣品分別加入異硫氰酸苯酯-乙腈溶液和三乙胺-乙腈溶液各1 mL，室溫下放置1 h進行衍生反應(yīng)，向上述衍生后的溶液中加入4 mL正己烷溶液，振蕩1 min分層后，棄去上層溶液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，用于液相色譜測定。色譜條件：UltiMate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；流動相A（1.64 g無水乙酸鈉溶解并加入0.5 mL三乙胺中，用水定容至1 L，用20%乙酸調(diào)節(jié)pH至6.2）；流動相B（80%乙腈）；線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣體積為20 μL；采用UltiMateTM二極管陣列檢測器，氨基酸衍生產(chǎn)物在254 nm處的紫外波長有強吸收峰。

1.8.3 有機酸分析[14]

有機酸采用HPLC分析，發(fā)酵醪液以6 000 r/min離心5 min后，取上清液稀釋至合適的濃度，并通過0.22 μm微孔濾膜過濾去除細胞及不溶物。HPLC分析采用UltiMate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司），配備HPX-87H色譜柱（美國BioRad公司），以0.05 mol/L H2SO4作為流動相。HPLC分析條件：進樣量20 μL，流速0.6 mL/min。采用UV檢測器（UltiMateTM 3000 VWD），檢測波長為210 nm，檢測溫度為35 ℃。根據(jù)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品使用峰面積計算每種化合物的量。

1.8.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定[15]

GC-IMS分析在FlavourSpecGC-IMS設(shè)備（德國G.A.S.公司）上進行。取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵育15 min，在85 ℃下將500 μL樣品用氮氣（純度99.999%）泵入加熱的進樣器中。揮發(fā)性化合物首先通過MXT-5毛細管柱分離（15 mL×0.53 mm）。載氣的初始流速為2 mL/min，持續(xù)2 min，隨后在18 min內(nèi)增加到100 mL/min。揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)（RI）以C4～C9的n-酮為外部參考進行計算。通過RI和漂移時間與GC-IMS NIST 11譜庫中的數(shù)據(jù)進行了比較，鑒定出揮發(fā)性化合物，化合物根據(jù)峰值強度進行定量。

1.8.5 感官評價

選取5位具有專業(yè)感官品評經(jīng)驗的人員對新品米醋進行味道和香氣的評估?！拔兜馈痹u估采用甜味（葡萄糖，20 g/L）、鮮味（谷氨酸鈉，0.6 g/L）、咸味（氯化鈉，2 g/L）、酸味（乳酸，1 g/L）和苦味（L-異亮氨酸，5 g/L）呈現(xiàn)。同時用醋酸（醋香）、乙醇（酒精味）、麥芽酚（焦香）、苯乙醇（花香）和乙酸乙酯（果香）評價“香氣”[16]。每個維度使用0（非常差）～8（優(yōu)秀）等級評分。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析由Origin 2023處理，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的分離和篩選

將篩選出的霉菌進行相關(guān)生理生化特性檢測，基于菌落特征和菌體微觀細胞形態(tài)進行形態(tài)學(xué)鑒定[17]，菌株ZSM1外觀為紅色，其菌落菌體形態(tài)見圖1。菌落生長速度較慢，前期生長白色菌絲體，菌落較大，質(zhì)地疏松，呈現(xiàn)緊皺的蛛網(wǎng)狀，不易挑取。培養(yǎng)2 d時孢子開始生長，產(chǎn)生紅色孢子；在物鏡（×40）的光學(xué)顯微鏡下觀察紅色霉菌菌絲有隔，呈現(xiàn)不規(guī)則的樹枝狀，具有分生孢子，孢子呈橢圓形?；谝陨嫌^察，確定菌株ZSM1為紅曲霉屬。紅曲霉類真菌具有較高的酶活力，可以分解大米中高含量淀粉和蛋白質(zhì)等其他營養(yǎng)成分，代謝產(chǎn)生各種風(fēng)味化合物。分離純化得到的紅曲霉ZSM1表現(xiàn)出較好的淀粉降解能力（Ra=3.2）和蛋白降解能力（Rb=1.2）。

2.2 曲霉液態(tài)培養(yǎng)過程分析

所用大米中均含有7.55%的蛋白和77.99%的淀粉，絲狀真菌能代謝產(chǎn)生各種水解酶，分解原料中大分子物質(zhì)，其酶活力會隨培養(yǎng)時間和培養(yǎng)環(huán)境的變化而有所不同。固態(tài)生產(chǎn)紅曲過程中溫度和濕度不可控，發(fā)酵周期不穩(wěn)定，容易導(dǎo)致紅曲產(chǎn)品批次間質(zhì)量波動；而紅曲液態(tài)法培養(yǎng)周期短，產(chǎn)酶穩(wěn)定[18]。紅曲霉是一種絲狀真菌，通過液態(tài)振蕩能更好促進其生長代謝，觀察以大米為基質(zhì)，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵3 d培養(yǎng)進程。開始米醪液非常黏稠，紅曲霉在生長過程中分泌淀粉酶和蛋白酶，米醪的黏度逐漸下降，發(fā)酵過程中逐漸分泌紅曲色素，液態(tài)培養(yǎng)超過40 h后，紅曲色素開始得到大量積累。

由表1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，液態(tài)紅曲霉中淀粉酶活呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢，在36～48 h之間酶活較高；紅曲霉產(chǎn)蛋白酶活最高在48 h左右，且紅曲霉代謝生產(chǎn)或消耗還原糖得到基本平衡。因此，選取40 h為紅曲霉液態(tài)培養(yǎng)的最佳發(fā)酵時間。

由表2可知，黑曲霉在24 h左右酶活最高，淀粉酶活為281 U/mL，蛋白酶活為14.84 U/mL，且發(fā)酵24 h后黑曲霉液體培養(yǎng)米醪呈現(xiàn)較稀狀態(tài)，無菌絲體出現(xiàn)。因此，選取此時間點作為黑曲霉液態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵時間。

2.3 不同糖化工藝對米醋風(fēng)味的影響

2.3.1 有機酸分析

有機酸是食醋中關(guān)鍵風(fēng)味代謝物，對米醋的風(fēng)味有較大影響[19]。分析了各樣品的總酸以及醋酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸和乳酸等有機酸含量。總酸是評價食醋質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，米醋醋酸發(fā)酵結(jié)束時，以紅曲霉糖化后發(fā)酵的米醋（曲霉+JM12）總酸含量為4.62 g/dL；經(jīng)糖化酶糖化后發(fā)酵的米醋（糖化酶+JM12）總酸含量為4.68 g/dL；傳統(tǒng)固態(tài)烏衣紅曲發(fā)酵的米醋總酸含量為4.98 g/dL，總酸度均＞3.5 g/dL，符合國家生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

由圖2可知，相比于糖化酶糖化組，添加紅曲霉糖化樣品中琥珀酸和乳酸等有機酸含量相對較高（乳酸1.11 g/dL，琥珀酸1.81 g/dL），醋酸含量較低，為3.41 g/dL，可以緩和醋酸刺激性，使食醋的味道更柔和豐富。

2.3.2 游離氨基酸分析

樣品中游離氨基酸主要來自微生物對原料中蛋白質(zhì)的降解，不同氨基酸可以提供不同的風(fēng)味，脯氨酸、纈氨酸、精氨酸和亮氨酸等被稱為苦味氨基酸，谷氨酸和丙氨酸等可以提供甜味和鮮味[20]。氨基酸是米醋中主要的調(diào)味物質(zhì)，由圖3可知，通過高效液相色譜法檢測米醋中含有的游離氨基酸，其中以糖化酶糖化后發(fā)酵的米醋（糖化酶+JM12）氨基酸種類和含量明顯低于其他兩組，測得發(fā)酵米醋的氨基酸總量為345.02 mg/g。相比之下，紅曲霉糖化后發(fā)酵的米醋鮮味氨基酸如谷氨酸含量顯著升高，濃度最高達115.97 mg/g，比對照組提高了16.45倍。甜味氨基酸如絲氨酸含量達140.17 mg/g，蘇氨酸含量達382.34 mg/g，氨基酸總含量為2 597.68 mg/g；而與傳統(tǒng)烏衣紅曲發(fā)酵米醋相比，紅曲霉糖化后發(fā)酵的米醋降低了苦味氨基酸的比重，賦予米醋更好的味道。

2.3.3 不同糖化劑對米醋揮發(fā)性物質(zhì)的影響

采用GC-IMS分析了糖化階段采用紅曲霉液體培養(yǎng)物、糖化酶和烏衣紅曲3種不同糖化劑發(fā)酵的米醋樣品中揮發(fā)性物質(zhì)組成，共檢測出52種已知化合物。由表3可知，糖化階段，使用紅曲霉ZSM1液態(tài)培養(yǎng)物作為糖化物，可以產(chǎn)生更高的甲酸-2-甲基丁酯、乙酸丙酯、2-辛酮、2，3-戊二酮等芳香化合物，環(huán)己酮、甲酸丁酯、丙酸甲酯、丁酸乙酯、己醛、壬醛等在以糖化酶為糖化劑的米醋中含量最高，醛類和酮類物質(zhì)占比較大。酯類物質(zhì)是米醋中的主要風(fēng)味成分，由酸和醇酯化后形成，通過分離得到的紅曲霉進行糖化發(fā)酵的米醋酯類物質(zhì)含量較高，呈現(xiàn)出花香和果香，可能與紅曲霉自身分泌代謝的各種酯化酶和豐富的化合物有關(guān)。

由圖4可以直觀看出樣品間揮發(fā)性化合物的差異，與傳統(tǒng)烏衣紅曲發(fā)酵米醋相比，采用紅曲霉糖化的米醋風(fēng)味化合物的種類和含量差異不大。由圖5中PCA分析可以看出，3組樣品之間有顯著差異。糖化階段采用糖化酶的樣品組與紅曲霉制備的糖化劑或烏衣紅曲有顯著分離。結(jié)果表明在米醋發(fā)酵過程中，紅曲霉ZSM1不僅具有分解糖化大米淀粉的能力，而且能夠利用原料中各種物質(zhì)代謝風(fēng)味化合物。

2.3.4 米醋感官評價

食醋的味道主要以酸味為主，其次為甜味和鮮味，帶有微弱的咸味和苦味。由圖6可以看出各種風(fēng)味物質(zhì)相互作用，協(xié)調(diào)了食醋的口感。較高的鮮味和甜味氨基酸的存在使米醋顯示出更好的鮮味和甜味特征。糖化階段采用紅霉菌糖化的醋產(chǎn)品聞起來酸味純正，無異味；嘗起來無刺激感，無酸澀味，稍有甜味；看起來醋體澄清，呈現(xiàn)明亮的琥珀色。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)烏衣紅曲中含有豐富的、直接影響米醋風(fēng)味品質(zhì)的功能微生物，本文通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法篩選出一株紅曲霉ZSM1，評估了分離菌株的產(chǎn)酶特性，發(fā)現(xiàn)ZSM1顯示出較好的α-淀粉酶和蛋白酶活性。紅曲霉ZSM1液體發(fā)酵40 h時酶活力最高，且紅曲色素產(chǎn)量最佳。后續(xù)將ZSM1與黑曲霉液態(tài)培養(yǎng)物制備糖化劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)雙酶法糖化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可增加米醋中乳酸或琥珀酸等不揮發(fā)酸含量，消減食醋的刺激性。增加米醋中甜味、鮮味氨基酸的種類和含量，提升米醋中乙酸丙酯、2-辛酮和2，3-戊二酮等芳香化合物含量。相比于采用烏衣紅曲發(fā)酵米醋，有利于提升米醋的工藝穩(wěn)定性，確保不同批次產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，為提高液態(tài)發(fā)酵米醋的風(fēng)味品質(zhì)提供了理論參考。

參考文獻：

[1]LYU X C， HUANG Z Q， ZHANG W， et al. Identification and characterization of filamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing[J].Journal of General and Applied Microbiology，2012，58（1）：33-42.

[2]鄭平，覃先武，張彥，等.高產(chǎn)開環(huán)型Monacolin K紅曲霉菌株的篩選及其在紅曲酒釀造中的應(yīng)用[J].中國釀造，2023，42（3）：129-134.

[3]黃玲玲，程凱森，張美芳，等.黑曲霉和紅曲霉釀造黃酒理化成分及揮發(fā)性物質(zhì)的比較分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019，10（15）：4896-4904.

[4]CHEN L H， WANG S X， LIU B， et al. Flavor characteristics of hulless barley wine fermented with mixed starters by molds and yeasts isolated from Jiuqu[J].Food Bioscience，2023，52：102349.

[5]VAN WYK N， GROSSMANN M， WENDLAND J， et al.The whiff of wine yeast innovation： strategies for enhancing aroma production by yeast during wine fermentation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（49）：13496-13505.

[6]毛青鐘，屠小夫，嘉曉勤，等.傳統(tǒng)烏衣紅曲的制作工藝技術(shù)及秈米黃酒的釀制[J].江蘇調(diào)味副食品，2011，28（2）：28-31，40.

[7]徐新金，徐文慧.烏衣紅曲黃酒發(fā)酵酸敗因素分析及工藝調(diào)控[J].中國釀造，2013，32（7）：117-118.

[8]ZHAO Y Z， LIU S P， YANG Q L， et al. Effects of simultaneous inoculation of non-Saccharomyces yeasts and Saccharomyces cerevisiae Jiangnan 1# on overall quality， flavor compounds， and sensory analysis of Huangjiu[J].Food Bioscience，2023，53：102539.

[9]黃艷，周其洋，高庭，等.一株根霉菌在提高米醋風(fēng)味方面的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品，2021，46（11）：57-59.

[10]胡曉龍，馮大鴻，田瑞杰，等.中溫大曲產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].中國釀造，2023，42（1）：78-85.

[11]李娜，附俊杰，劉軍，等.一株產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2023，44（1）：189-199.

[12]國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定：GB 5009.7－2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[13]張麗娟.恒順香醋醋酸發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化分析[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[14]王韋崗，唐雙雙，朱新生.高效液相色譜法測定食醋中糖含量與差異性分析[J].食品科技，2014，39（7）：300-303.

[15]WANG J， WEI B C， WANG X， et al. Aroma profiles of sweet cherry juice fermented by different lactic acid bacteria determined through integrated analysis of electronic nose and gas chromatography-ion mobility spectrometry[J].Frontiers in microbiology，2023，14：1113594.

[16]CHEN Y， HUANG Y， BAI Y， et al. Effects of mixed cultures of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum in alcoholic fermentation on the physicochemical and sensory properties of citrus vinegar[J].LWT-Food Science and Technology，2017，84：753-763.

[17]周康熙，陳穎，倪莉.紅曲霉分離純化、分類和鑒定研究進展[J].中國釀造，2021，40（1）：7-13.

[18]袁國興.紅曲米中蛋白酶、酯化酶的活性研究[D].濟南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012.

[19]史玉，黃一承，曾承，等.三種黑蒜醋揮發(fā)性風(fēng)味和有機酸成分分析[J].中國調(diào)味品，2022，47（2）：154-159.

[20]YUAN H W， ZHANG C， CHEN S Y， et al. Effect of different moulds on oenological properties and flavor characteristics in rice wine[J].LWT-Food Science and Technology，2023，173（2）：114201.

收稿日期：2023-07-06

基金項目：山東省鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動計劃項目（2022TZXD0029）；齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項（2022JBZ01-08）

作者簡介：杜琳琳（1998－），女，碩士，研究方向：微生物分離與發(fā)酵技術(shù)。

*通信作者：劉建軍（1962－），男，教授，博士，研究方向：資源微生物與新型發(fā)酵制品的研究開發(fā)。