氣溶膠微生物粒子本征熒光計數儀器設計*

賈紋紋，譚 軍，張 秦，黨 磊，徐 溢，陳 李

（1.重慶大學光電工程學院光電技術與系統(tǒng)教育部重點實驗室，重慶 400044；2.重慶大學新型微納器件與系統(tǒng)技術重點學科實驗室，重慶 400044；3.航天神舟生物科技集團有限公司北京市空間生物工程研究中心，北京 100080）

0 引 言

大氣溶膠顆粒物帶來的影響愈發(fā)受到人們重視，當氣溶膠中含有細菌、病毒、霉菌孢子以及寄生蟲卵等致病微生物時，會給人類健康帶來巨大威脅［1，2］。已有論文研究表明，氣溶膠中的細菌、真菌能明顯增加患肝部、肺部、及過敏性疾病的幾率［3］，給人類健康帶來了諸多負面影響，因此對其濃度進行實時監(jiān)測十分必要。

自1968年被報道激光誘導熒光技術以來，科研人員對生物氣溶膠的實時監(jiān)測技術開展了系列研究。2015 年，日本海洋地球科學技術廳Taketani F等人［4］研發(fā)了一種氣溶膠混合粒子實時監(jiān)測系統(tǒng)，在環(huán)境中成功探測到具有熒光成分的顆粒；2018年，中國科學院上海光學精密機械研究所對生物氣溶膠監(jiān)測進行了系列研究，實現了生物氣溶膠實時檢測裝置［5］；2020 年，Jeong Y S等人［3］采用紫外發(fā)光二極管誘導熒光，研制了手持式生物氣溶膠實時監(jiān)測系統(tǒng)，通過測量熒光和散射光強度，確定目標生物粒子。上述研究的基本思路類似，但對微生物本征熒光特性研究較少。

本文在光路整形設計研究基礎上［6］，對微生物含有的熒光活性物質及幾種典型細菌的激發(fā)和發(fā)射光譜進行了測試，進一步對儀器的氣路、光檢測結構進行優(yōu)化設計，完成儀器系統(tǒng)的設計和搭建，并完成對儀器性能的初步測試。

1 粒子計數原理分析

1.1 光散射粒子檢測原理

粒子對光的散射可以分為瑞利散射和米氏（Mie）散射兩種。如圖1所示，當粒子直徑遠小于入射光波長λ時，表現為瑞利散射，前向和后向散射光分布比較對稱；當粒子直徑與入射光波長λ相當時，表現為Mie散射，此時前向散射光更強，方向性比較明顯［7］，隨著粒子粒徑進一步增大，前向散射光會更強。

由于氣溶膠生物粒子直徑通常在0.5 μm以上，與激發(fā)光波長相比主要表現為Mie 散射［8］。散射模型如圖2 所示，若散射角為θ，則沿著散射角θ方向的散射光強度表達式如式（1）［9］所示

圖2 均勻球形粒子的光散射

式中s1（θ），s2（θ）為關于粒子粒徑d的函數，由此可推導出散射光強度I（θ）與粒徑d及散射角θ有關［10］。當散射角度固定時，即可通過探測散射光的強度，實現對不同粒徑的粒子進行分類計數。

1.2 微生物粒子本征熒光特性分析

絕大部分微生物粒子含有色氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）、核黃素等熒光活性分子［11，12］。如圖3所示，當這些活性分子受到特定波長入射光照射時，部分處于基態(tài)的電子吸收光子能量躍遷至高能級的激發(fā)態(tài)，并發(fā)生振動弛豫而以熱能形式消耗掉一部分能量后，處于激發(fā)態(tài)的最低振動能級；再躍遷回基態(tài)能級，并輻射出熒光。這個過程中由于熱能消耗，導致輻射光子能量低于吸收的光子能量（ΔV′＜ΔV），即熒光發(fā)射波長大于入射波長。而大部分非生物粒子，則不具有熒光發(fā)射特性。

采用瓦里安Cary Eclipse分子熒光光譜儀，對熒光活性物色氨酸、NAD＋和核黃素進行了測試，結果如圖4所示。

處于3種熒光物質激發(fā)波長范圍的激光器典型波長有280，355，405 nm等。其中，280 nm的光源可對Tryptophan激發(fā)，355，405 nm 可對NAD＋和黃素腺嘌呤二核苷酸（flavinadenine dinucleotide，FAD）激發(fā)。280，355 nm連續(xù)輸出的小體積紫外激光器功率較低（10～20 mW）；而405 nm 的連續(xù)輸出的小體積紫外激光器功率可達100 mW 以上，對提高儀器的靈敏度十分有利。選取較為常見的微生物進行熒光光譜測試實驗，測試結果如圖5 所示。可見幾種微生物的熒光譜峰范圍非常接近，峰值位置約為485 nm。

圖5 微生物熒光光譜

2 微生物粒子計數儀器設計

2.1 裝置整體結構設計

微生物粒子計數裝置如圖6 所示。激發(fā)光出射后，經整形得到均勻的光束并進入檢測腔［6］；檢測腔主要由激光輸入通道、光陷阱、氣溶膠輸入輸出通道和凹面反射鏡組成，粒子與光束相互作用產生熒光和散射光，由檢測腔下方凹面反射鏡收集；再通過二向色鏡，將熒光信號分離，然后采用光電倍增管對兩路光信號進行探測。信號處理電路完成探測器輸出電信號的模／數（A／D）轉換、數據緩存、峰值鑒別及分類計數功能，最后將結果上傳至上位機進行顯示。

圖6 計數儀整體結構示意

2.2 氣路結構設計

氣流裹挾待測粒子進入裝置內光檢測區(qū)，完成粒子檢測。若氣路設計不合理，則檢測腔區(qū)域內容易產生湍流現象，導致氣流裹挾的粒子出現漏檢及重復檢測的問題。因此對進氣、出氣通道進行了優(yōu)化，當進氣口相距6 mm、內徑為3 mm時結果最優(yōu)，仿真結果如圖7（a）所示。從仿真結果可以看出，氣流的發(fā)散程度較小，湍流強度較弱。對進入腔體內的粒子進行軌跡追蹤，結果如圖7（b）所示，只有極少部分粒子產生偏移。統(tǒng)計數據如表1 所示，粒子的偏移率不超過3.2%，處于較低的水平。

表1 粒子軌跡分布統(tǒng)計數據

圖7 氣路結構仿真結果

2.3 光探測結構設計

檢測腔內氣流與激光束垂直交叉，交點處即為光檢測核心區(qū)，產生的熒光與散射光通過光學元件進行收集。通常對光信號的收集分為前向和側向2 種方式，前向收集方式將聚焦透鏡放置在散射光前向，透鏡前設置光陷阱，消除入射光對散射收集的影響；側向收集方式將球面反射鏡結構裝配于光路氣路交叉平面的90°側向，通過球面反射對光信號進行會聚收集。

為選擇一種更好的收集方式，采用定量方法對上述2種方式在0.5 ～5.0 μm范圍內粒子的散射光收集量進行積分計算，計算模型如圖8所示，對不同粒徑粒子在同一位置進行相同收集面積的積分運算。側向收集選用球形模型，而前向收集方式采用聚焦透鏡，因此可近似于矩形模型。

圖8 2 種收集方式仿真

由于此處并不是對實際收集的光通量進行計算，因此對比考察2種方式相對收集量的變化趨勢，將其繪制成曲線如圖9所示。通過仿真結果可以看出，隨著粒子粒徑的不斷增大，前向和側向收集方式的散射光收集量均出現增加，但前向收集方式增加趨勢較為緩慢，側向收集方式增加趨勢更迅速，側向收集方式具有更好的線性。除此之外，前向收集方式收集裝置與入射光同軸，因此散射光的收集極易受入射光影響產生誤差。而側向收集方式收集裝置位于入射軸正交方向，有效避免了入射光的干擾，因此檢測腔設計中選用側向光收集結構更為合理。

圖9 相對收集量變化趨勢

3 性能測試與分析

組裝完成的儀器裝置如圖10所示。

圖10 微生物粒子計數裝置

對氣溶膠樣本進行采樣，圖11 為熒光通道和散射光通道的檢測信號，通過設計的算法對脈沖信號進行統(tǒng)計，即可獲得不同粒子的數量。將其中較為明顯的特征信號進行分析，圖12（a）為一個普通塵埃粒子經過檢測區(qū)時，散射光通道產生了一個光脈沖信號，而熒光通道無信號；圖12（b）為一個微生物粒子通過檢測區(qū)時，散射光通道和熒光通道均產生一個光脈沖。測試結果證明，本文檢測裝置可以完成微生物粒子的檢測，并實現微生物粒子與普通塵埃粒子的區(qū)分。

圖11 熒光和散射光檢測信號

圖12 單個粒子檢測信號

4 結 論

本文通過對色氨酸、NAD ＋、核黃素等熒光活性分子的光譜測試，獲得了激發(fā)波長和熒光發(fā)射波長，選定了405 nm的激發(fā)光。通過對金黃色葡萄球菌等微生物粒子的光譜測試，進一步證實了405 nm激發(fā)光可以有效地激發(fā)微生物粒子的熒光信號。對儀器整體結構、光學檢測腔等進行了設計，完成了檢測裝置的構建。初步測試結果表明，該裝置可以實現對空氣中各種粒子的散射光信號和微生物粒子的熒光信號探測。下一步將對該裝置進行標定，為進一步研制氣溶膠微生物粒子濃度監(jiān)測儀器奠定基礎。