發(fā)酵稻殼通過增強(qiáng)氮代謝途徑影響煙草幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育

張 斌,袁志輝,彭陸軍,周向平,周德英,王錫春,*

(1.湖南科技學(xué)院 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心,湖南 永州425199; 2.永州市思源農(nóng)業(yè)科技有限公司,湖南 永州 425000; 3.湖南省煙草公司永州市公司,湖南 永州425000)

育苗是煙葉生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié),而漂浮育苗是當(dāng)前我國(guó)育苗的主要方式之一[1]。煙草漂浮育苗技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了煙草育苗工廠化。炭化稻殼具有容重小、質(zhì)量輕、孔隙度高、通氣性好和保水力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),目前已成為煙草漂浮育苗基質(zhì)的主要成分[2],僅永州市每年就需要5 000 m3。然而,制備炭化稻殼的煅燒過程中會(huì)產(chǎn)生大量煙霧,近來(lái)引起了環(huán)保部門關(guān)注,因此,尋找煙草漂浮育苗基質(zhì)中炭化稻殼的替代物成為集約化煙草育苗急需解決的問題。近年來(lái),我國(guó)各大煙區(qū)開展了一些利用農(nóng)業(yè)廢棄物開發(fā)漂浮育苗基質(zhì)的研究,如蔗渣[3]、花生糠[4]、藥渣[5]等,并取得到了較好的效果,但由于原料的產(chǎn)地限制難以進(jìn)行大面積推廣。

稻殼的主要成分為纖維素、木質(zhì)素和硅[6],對(duì)離子具有良好的吸附能力[7],它能夠提高土壤透氣性,具有改良土壤結(jié)構(gòu)的功能。我國(guó)稻殼資源豐富,取材方便,卻未得到充分利用[8]。稻殼發(fā)酵后可消除致病菌,且含有豐富的有機(jī)質(zhì)和礦質(zhì)元素,理論上可以作為育苗基質(zhì),有較大的推廣價(jià)值。陳雪嬌等[9]對(duì)稻殼和油枯進(jìn)行發(fā)酵,認(rèn)為添加40%磷石膏的基質(zhì)更適合用于作物栽培;于艷輝等[10]研究表明,發(fā)酵后稻殼營(yíng)養(yǎng)元素含量變化不明顯;尚秀華等[11]研究表明,稻殼經(jīng)過腐熟處理后容重和持水量等理化性能有所改良,其有機(jī)物得到不同程度的降解;韓道杰等[12]研究了基質(zhì)中發(fā)酵稻殼添加量對(duì)西瓜幼苗生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)添加50%(體積分?jǐn)?shù))的發(fā)酵稻殼可達(dá)到優(yōu)秀基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn);謝曉梅等[13]研究表明,發(fā)酵稻殼對(duì)Fe2+和S2-具有較好的吸附能力和環(huán)境適應(yīng)性,吸附態(tài)Fe2+和S2-穩(wěn)定性好,不易再釋放;徐經(jīng)年等[14]研究表明,發(fā)酵稻殼、高溫消毒熟土和膨化珍珠巖按體積比6.0∶2.5∶1.5混合制成的基質(zhì)可以替代煙漂浮育苗的商品基質(zhì);徐昱松等[15]研究表明,腐熟稻殼、蛭石和珍珠巖體積比為6∶2∶2時(shí)適宜黃瓜育苗。雖然周德英等[16]研究發(fā)現(xiàn),含40%(體積分?jǐn)?shù))發(fā)酵稻殼的基質(zhì)對(duì)煙苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)效果,但是,有關(guān)發(fā)酵稻殼對(duì)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育影響的相關(guān)分子機(jī)理研究還鮮有報(bào)道。本研究以發(fā)酵稻殼為材料,對(duì)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育與相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,對(duì)相關(guān)代謝途徑進(jìn)行分析,鑒定了代謝通路中的關(guān)鍵基因,并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證,研究結(jié)果可為發(fā)酵稻殼的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試供煙草品種為湘煙7號(hào);發(fā)酵助劑由永州市煙葉生產(chǎn)技術(shù)中心提供;發(fā)酵稻殼為自制,將稻殼、尿素、玉米粉、發(fā)酵助劑按質(zhì)量比1 000∶5∶5∶4配制發(fā)酵液,稻殼粉碎后過3目篩,摻水達(dá)60%后拌勻發(fā)酵液,用塑料膜覆蓋,堆垛發(fā)酵30 d,其間翻堆3次,待稻殼呈棕褐色即可。漂浮育苗基質(zhì)由永州市思源農(nóng)業(yè)科技有限公司按照表1生產(chǎn)。

表1 基質(zhì)組成

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年12月至2022年3月在湖南省煙草公司永州公司技術(shù)中心基地玻璃鋼架育苗棚內(nèi)進(jìn)行,共設(shè)置6個(gè)處理(基質(zhì)配方見表1),每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)育苗盤(100孔穴),每穴基質(zhì)用量為10 cm3。將飽滿種子在室溫浸泡4 h后播種至育苗盤(每孔穴1粒),漂浮育苗。除栽培基質(zhì)外進(jìn)行常規(guī)管理,其他環(huán)境條件保持一致。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

栽培60 d后,參照YC/T142─2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法》的方法,每個(gè)處理隨機(jī)取15株苗,測(cè)量株高、根長(zhǎng)、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重。株高為幼苗根部至主莖頂點(diǎn)的距離,根長(zhǎng)為最長(zhǎng)根的長(zhǎng)度,用0～10 cm的直尺測(cè)量。莖粗為栽培基質(zhì)處莖的直徑,用游標(biāo)卡尺測(cè)量。幼苗洗凈吸干水分后測(cè)量地上部鮮重和地下部鮮重;120 ℃烘干至質(zhì)量不變,用萬(wàn)分之一電子天平測(cè)量地上部干重和地下部干重。根冠比=根鮮重/地上部分鮮重;壯苗指數(shù)=(莖粗/株高+根干重/地上部干重)×全株干重。按照試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)的方法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量;采用中晶科技掃描儀(MRS-9600TFU2L)測(cè)定根系指標(biāo)。按照硝酸還原酶(NR)活性檢測(cè)試劑盒和亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(合肥萊爾生物科技有限公司)測(cè)定NR和NiR活性;在連續(xù)流動(dòng)分析儀上測(cè)定根系總氮含量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

1.4.1 樣品處理

以CRH處理為對(duì)照,選擇FRH1處理進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)隨機(jī)采集6株幼苗根系,快速混合均勻,標(biāo)記為FRH1-1、FRH1-2、FRH1-3和CRH-1、CRH-2和CRH-3。用鋁箔紙包扎后放入液氮,送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;剩余樣品保存在-80 ℃,測(cè)定SOD、CAT、NR和NiR活性,以及Pro、MDA和總氮含量。

1.4.2 測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

使用百邁客云平臺(tái)提供的分析流程分析測(cè)序后的數(shù)據(jù)。參考基因組為(Nicotiana_tabacum.Ntab_K326),采用HISAT 2.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)?；虮磉_(dá)量采用FPKM值,用DEseq 2軟件篩選顯著差異表達(dá)基因,參數(shù)設(shè)定為差異倍數(shù)|log2(fold-change)|≥1.5且Pvalue≤0.05。利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行顯著差異表達(dá)基因功能注釋。

1.4.3 關(guān)鍵基因qRT-PCR驗(yàn)證

采用試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)提取剩余樣品RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。在NCBI網(wǎng)站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計(jì)基因特異引物,內(nèi)參基因?yàn)棣挛⒐艿鞍谆?基因ID為gene_1665)(表2),在美國(guó)伯樂CFXConnect上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL:上下游引物各0.4 μL,1 μL cDNA,SYBR greenMix 5 μL,ddH2O 3.2 μL;反應(yīng)程序:94 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù),采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR分析的基因與引物

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件(2019版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵稻殼對(duì)幼苗生長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)指標(biāo)的影響

不同處理煙草幼苗栽培60 d時(shí)的生長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)指標(biāo)見圖1。相同處理的煙草幼苗生長(zhǎng)比較齊整,6個(gè)處理間整齊度差異不大,但FRH處理的煙草生長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于CRH處理(圖1-A);FRH處理的幼苗高度、根冠比和壯苗指數(shù)優(yōu)于CRH處理。與CRH處理相比,FRH1、FRH2、FRH3、FRH4和FRH5處理的幼苗高度分別提高了51.7%、37.9%、34.5%、20.7%、31.0%,除FRH4的株高外,其他處理都顯著性高于CRH處理(圖1-B)。各處理中根冠比和壯苗指數(shù)排序?yàn)镕RH1>FRH3>FRH4>FRH2>FRH5>CRH處理,FRH1和FRH3的根冠比和壯苗指數(shù)顯著大于CRH處理(圖1-C和圖1-D)。綜合比較,FRH1處理在株高、根冠比和壯苗指數(shù)方面優(yōu)于其他處理。

A,生長(zhǎng)勢(shì)。CRH,炭化稻殼;FRH,發(fā)酵稻殼。柱上無(wú)相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A, Growth potential. CRH, Carbonized rice husk; FRH, fermented rice husk. Bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.

2.2 發(fā)酵稻殼對(duì)幼苗一級(jí)側(cè)根和根系生理指標(biāo)的影響

如表3所示,FRH1處理的煙草一級(jí)側(cè)根的數(shù)量、長(zhǎng)度、直徑和表面積分別為292根、39.7 mm、0.066 mm和4.9 cm2,除直徑外,其他指標(biāo)都顯著(P<0.05)高于CRH處理。與CRH處理相比,FRH1處理的煙草脯氨酸含量顯著下降33.5%,CAT和SOD活性分別顯著(P<0.05)上升13.6%和68.5%,根系MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量

經(jīng)過凈化和質(zhì)量過濾后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)如表4所示,所有樣品堿基百分比(Q30)≥94.29%,GC含量不低于43.12%,測(cè)序質(zhì)量較高。測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)率和單一比對(duì)率分別為95.29%～93.89%和93.21%～91.68%,比對(duì)質(zhì)量比較高。

表4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

2.4 樣本中基因表達(dá)一致性檢驗(yàn)

主成分分析顯示,2個(gè)處理的特征向量分別為75.71%、15.46%和8.04%,不同處理之間具有一定的差異(圖2-A);相關(guān)性分析顯示,處理內(nèi)樣本間相關(guān)系數(shù)r超過0.90,處理間相關(guān)系數(shù)低于0.20,樣本CRH-1、CRH-2和CRH-3聚在一起,FRH1-1、FRH1-2和FRH1-3聚在一起,說(shuō)明處理內(nèi)樣本間生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性較強(qiáng),處理之間具有一定的差異(圖2-B)。

A,主成分分析圖;B樣品相關(guān)性分析圖。A, Principal component analysis chart; B, Sample correlation analysis chart.

2.5 顯著差異表達(dá)基因功能注釋、關(guān)鍵基因鑒定和驗(yàn)證

對(duì)2個(gè)處理進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,共有476個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中311個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、165個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖3-A)。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出294個(gè)基因,它們參與20個(gè)代謝通路(圖3-B)。其中氮代謝途徑(ko00910)數(shù)據(jù)以鮮重計(jì)。

A,火山圖;B,KEGG富集分析。A, Volcano diagram; B, KEGG pathway enrichment analysis.

富集差異最顯著(Qvalue=2.01×10-8),含有12個(gè)基因;其次是戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑(ko00040)(Qvalue=0.004);參與異喹啉生物堿生物合成、酪氨酸代謝等代謝途徑的差異性也比較大。

在氮代謝途徑中6個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、3個(gè)亞硝酸鹽還原酶基因、2個(gè)硝酸還原酶基因和1個(gè)谷氨酸脫氫酶基因獲得了顯著富集(表5)。RNA-Seq結(jié)果表明,下調(diào)表達(dá)基因FPKM比值的log2(fold-change)在-1.06～-1.89,上調(diào)表達(dá)基因FPKM比值的log2(fold-change)在0.60～1.16。qRT-PCR結(jié)果表明,關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致,下調(diào)基因相對(duì)表達(dá)量比值(FRH1/CRH)為0.29～0.43,上調(diào)基因相對(duì)表達(dá)量比值(FRH1/CRH)為1.56～2.28?；騨ewGene_31743在2個(gè)處理中的相對(duì)表達(dá)量都比較高,而且CRH處理高于FRH1處理。基因newGene_21354、newGene_24233和newGene_26504的表達(dá)量在FRH1處理中高于CRH處理,其余基因表達(dá)量在FRH1處理中均低于CRH處理。

表5 氮代謝途徑差異基因表達(dá)水平

2.6 根系中硝酸還原酶活性、亞硝酸還原酶活性和總氮含量

由圖4可知,FRH1處理中煙苗根系硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性分別比CRH顯著提高8%和7%,煙苗根系氮含量提高1.7%,但未達(dá)到顯著差異。

圖4 根系硝酸還原酶活性、亞硝酸還原酶活性和總氮含量Fig.4 Nitrate reductase activity, nitrite reductase activity and total nitrogen content of root

3 討論

稻殼具有改良土壤結(jié)構(gòu)的功能,我國(guó)稻殼資源豐富,卻未得到充分利用。本研究結(jié)果顯示,煙草漂浮育苗基質(zhì)中用發(fā)酵稻殼替代炭化稻殼可增加幼苗一級(jí)側(cè)根的數(shù)量、長(zhǎng)度和表面積,提高煙草幼苗株高、根冠比、生長(zhǎng)勢(shì)和壯苗指數(shù),還提高了幼苗根系的CAT和SOD活性,降低了脯氨酸的含量,這與已有研究結(jié)果一致[16]。稻殼深施土壤后可以降低土壤容重,提高土壤孔隙度和通透性能,增加土壤有機(jī)碳、速效氮、磷、鉀等的含量[17-18]。土壤理化性質(zhì)的改變會(huì)影響微生物群落特征[19]。研究還表明,增施稻殼可以提高土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性,對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的后發(fā)效應(yīng)[20]。

土壤理化性狀對(duì)煙草碳氮代謝有很重要的影響[21-22],稻殼施入土壤后可以釋放氮素。FRH1和CRH處理共有476個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中294個(gè)在氮代謝途經(jīng)得到顯著富集。張玉寧等[23]認(rèn)為,氨基酸、碳氮代謝途徑是響應(yīng)不同氮營(yíng)養(yǎng)條件的重要代謝途徑。在氮代謝途經(jīng)中挖掘到12個(gè)關(guān)鍵基因,其中6個(gè)為硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因。高等植物有4類硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體家族負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽外,還負(fù)責(zé)氨基酸、多肽、硫配糖體、生長(zhǎng)素和脫落酸等轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)家族基因存在多個(gè)成員,目前,主要對(duì)NRT1.1、NRT1.2、NRT2.1進(jìn)行了功能研究[25]。此外,煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NtNRT 1.7在非生物脅迫條件下參與硝酸鹽的再利用[26];NtNRT1.5基因在煙草氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要功能[27]。硝酸還原酶是植物氮同化和根系結(jié)構(gòu)重塑的關(guān)鍵酶之一,在一氧化氮穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[28-29],水稻硝酸還原酶基因OsNR2的等位基因可以提高水稻氮素利用效率和產(chǎn)量[30]。亞硝酸還原酶是一氧化氮介導(dǎo)翻譯后修飾的靶標(biāo)[31],一氧化氮可以通過誘導(dǎo)水稻側(cè)根形成來(lái)提高氮吸收能力[32]。此外,12個(gè)關(guān)鍵基因中還含有2個(gè)硝酸還原酶基因、3個(gè)亞硝酸鹽還原酶基因和1個(gè)谷氨酸脫氫酶基因;與CRH處理相比,FRH1處理中根系硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性和氮含量上升。植物吸收的銨態(tài)氮可直接與有機(jī)物結(jié)合生成氨基酸或者其他含氮化合物,而硝態(tài)氮需經(jīng)硝酸還原酶、亞硝酸還原酶和谷氨酸脫氫酶的催化作用才能形成含氮化合物[33]。凡聰?shù)萚34]研究表明,增施氮肥能提高煙葉硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性和總氮含量。綜上,筆者認(rèn)為基質(zhì)中發(fā)酵稻殼的降解,促進(jìn)了煙草對(duì)氮素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化,影響了幼苗的氮代謝途徑,從而促進(jìn)煙苗生長(zhǎng)。本研究的不足之處是缺少栽培基質(zhì)中發(fā)酵稻殼的降解研究、各氮源轉(zhuǎn)運(yùn)體如何相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用,以及12個(gè)關(guān)鍵基因的功能研究。

4 結(jié)論

用發(fā)酵稻殼替換漂浮育苗栽培基質(zhì)中的炭化稻殼后,可以有效改善湘煙7號(hào)煙苗生長(zhǎng)勢(shì),幼苗株高、根冠比和壯苗指數(shù)更優(yōu),根系脯氨酸含量顯著降低,CAT和SOD活性顯著升高。294個(gè)顯著差異表達(dá)基因參與了氮代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等20個(gè)KEGG代謝通路,并挖掘出參與氮代謝的12個(gè)關(guān)鍵基因。FRH1處理中煙苗根系硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性顯著高于CRH處理,氮含量無(wú)顯著差異。