臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭組培繁育及其假鱗莖的化學(xué)組成分析

孫 健,任江劍,王海閣,江建銘,王志安,俞旭平

(浙江省中藥研究所有限公司,浙江 杭州 310023)

臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭(PleioneformosanaHayata) 是蘭科(Orchidaceae)獨(dú)蒜蘭屬(Pleione)植物,作為重要的觀賞及藥用植物,市場(chǎng)對(duì)獨(dú)蒜蘭屬植物資源的需求很大。臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭分布于臺(tái)灣、福建西部至北部、浙江南部和江西東南部[1],主要生長(zhǎng)在林下或林緣腐殖質(zhì)豐富的土壤或巖石上,生長(zhǎng)的小環(huán)境條件苛刻。臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭可以通過種子繁殖和假鱗莖增殖的方式繁育。但自然群體中,臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭結(jié)實(shí)率極低,且種子無(wú)胚乳,萌發(fā)率極低,同時(shí),通過假鱗莖無(wú)性繁殖的比率也很低。低繁殖率和苛刻的生存環(huán)境使得臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭自然居群生存極易受到威脅。目前,獨(dú)蒜蘭屬所有物種被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ和 2021 年版《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》的二級(jí)保護(hù)植物。

同屬的植物獨(dú)蒜蘭[P.bulbocodioides(Franch.) Rolfe]和云南獨(dú)蒜蘭[P.yunnanensis(Rolfe) Rolfe]被《中華人民共和國(guó)藥典》作中藥材“山慈菇”的基原植物。獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭以假鱗莖入藥,被稱為“冰球子”,具有清熱解毒、化痰散結(jié)、平喘止咳、消炎、鎮(zhèn)痛、止血等功效,用于治療癰腫疔毒、瘰疬痰核、淋巴結(jié)結(jié)核、蛇蟲咬傷、氣管炎、百日咳、哮喘、咳血、跌打損傷和化膿性骨髓炎等疾病[2]。近二十年,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)獨(dú)蒜蘭屬植物假鱗莖的化學(xué)成分進(jìn)行了系列分離鑒定,包括聯(lián)芐類、菲醌類、木脂素類、黃酮類和簡(jiǎn)單酚類等化合物,這些次生代謝產(chǎn)物或提取物具有抗癌、保肝、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抗氧化等活性[2-4],其中所含的芐酯類是一類存在于蘭科植物中且結(jié)構(gòu)較新穎的化學(xué)成分,具有益智、延緩衰老、保護(hù)神經(jīng)等作用[5]。但目前云南獨(dú)蒜蘭資源急劇減少,以致面臨枯竭,而臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭和獨(dú)蒜蘭是同屬的近緣物種,具備潛在的近似功效的藥用價(jià)值。但是目前未見有關(guān)臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭藥用方面的報(bào)道,本研究通過分析栽培臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭假鱗莖化學(xué)組成,以臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的果莢為材料,探索臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的組培繁育技術(shù)體系,同時(shí)應(yīng)用代謝組學(xué)和HPLC技術(shù)分析臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的主要成分組成,并應(yīng)用組培技術(shù)繁育得到臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的植株,對(duì)擴(kuò)大“冰球子”的入藥材料來源有一定指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器

Exactive-UltiMate 3000超高壓液相超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司),ACQUITY UPLC BEH C18色譜分析柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國(guó)沃特世公司);Agilent 1100液相色譜(美國(guó)安捷倫公司),ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm,美國(guó)波士頓公司);AB204-S型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);Heraeus Fresco17離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試劑和材料

臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的果莢于2019年8月上旬采集于浙江省景寧自治縣東坑鎮(zhèn)。培養(yǎng)20個(gè)月,選取大于0.5 g的假鱗莖,60 ℃烘干,獲得干燥藥材。1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司(Must-22021511,純度≥99.85%);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)賽默飛世爾科技公司),其他化學(xué)試劑為分析純。

1.3 組織培養(yǎng)條件

1.3.1 外植體消毒

臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭蒴果置于濃肥皂水中刷洗干凈,在超凈工作臺(tái)上將洗滌后的蒴果用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇表面消毒處理1 min,再用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的HgCl2消毒20 min,用無(wú)菌水沖洗6次,用無(wú)菌濾紙吸干蒴果表面的水分。

1.3.2 種子接種和原球莖培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上縱向剖開蒴果,將種子均勻撒播在培養(yǎng)基上。然后將其置于25 ℃暗培養(yǎng),此階段培養(yǎng)基為:1/2MS+活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6.8 g·L-1),pH值5.8。在播種20 d后種子明顯萌發(fā),形成圓球狀莖。待種子萌發(fā)出原球狀莖后更換培養(yǎng)基并采用光照培養(yǎng),溫度為25 ℃,光照時(shí)間12 h·d-1,光照強(qiáng)度1 200 lx。換用原球狀莖繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+6-BA(1 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)+活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6.8 g·L-1),pH值5.8。

1.3.3 假鱗莖分化增殖

原球狀莖經(jīng)增殖培養(yǎng)60 d后長(zhǎng)出第1片葉芽,但叢生芽數(shù)量相對(duì)較少,葉片細(xì)弱,此時(shí),需對(duì)繼代增殖原球狀莖進(jìn)行葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖,選擇大小適合的原球狀莖接種于添加不同激素配比(表1)的培養(yǎng)基上,基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6 g·L-1),pH值5.8,培養(yǎng)100 d左右繼代培養(yǎng)1次。采用光照培養(yǎng),溫度為25 ℃,光照時(shí)間12 h·d-1,光照強(qiáng)度1 200 lx。

表1 不同激素處理對(duì)球狀莖的影響

1.3.4 壯苗培養(yǎng)

將叢芽增殖的小苗接種于不同激素種類和濃度的生根培養(yǎng)基上,所選材料為大小和長(zhǎng)度,以及生長(zhǎng)狀況一致的帶葉的叢芽小苗。完成接種后將材料移至培養(yǎng)室中,采用光照培養(yǎng),溫度為25 ℃,光照時(shí)間12 h·d-1,光照強(qiáng)度1 200 lx。培養(yǎng)100 d左右繼代培養(yǎng)1次。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6 g·L-1),pH值5.8,不同激素及濃度組合的處理見表2。

表2 不同激素及濃度組合對(duì)壯苗的影響

1.4 HPLC色譜分析

柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;流動(dòng)相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈溶液(B),梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm;進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序:0～36 min,A為90%～83%;36～48 min,A為83%～76%;48～60 min,A為76%～73%;60～62 min,A為73%～69%;62～80 min,A為69%～60%;80～81 min,A為60%～10%;81～85 min,A為10%;85～86 min,A為10%～90%;86～91 min,A為90%。理論板數(shù)按1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

樣品制備:稱取50 ℃烘干的假鱗莖粉末約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率300 W,頻率45 kHz)30 min,取出,放冷,再穩(wěn)定質(zhì)量,用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。3次重復(fù)。

1.5 代謝組分析

質(zhì)譜條件:液相條件為,進(jìn)樣量為4 μL,柱溫35 ℃,流速為0.4 mL·min-1。采用的流動(dòng)相為A相:水(0.1%甲酸);B相:乙腈(0.1%甲酸)。液相梯度設(shè)置為0～0.5 min 5% B;0.5～7 min 5%～100% B;7～8 min 100% B;8～8.1 min 100%～5% B;8.1～10 min 5% B。應(yīng)用Q-Exactive (Thermo Scientific) 高分辨質(zhì)譜儀,正、負(fù)離子檢測(cè)模式,噴霧電壓3.5 kV,毛細(xì)管溫度350 ℃,霧化室溫度 320 ℃,鞘氣流速 45 arb,輔助氣流速 15 arb,掃描模式為Full MS/dd-MS,Full MS分辨率 70 000,dd-MS分辨率 17 500,掃描范圍為m/z70～1 050。MS/MS模式時(shí)所用碰撞能量為 30 eV。

樣品制備:稱取假鱗莖粉末100 mg,向樣品加入 120 μL 50%甲醇,震動(dòng)充分混勻,提取樣品中的代謝物,常溫靜置10 min;提取液放-20 ℃過夜,沉淀樣品中的蛋白質(zhì);4 000×g離心20 min,轉(zhuǎn)移上清液代謝物提取液。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用CD3.1軟件處理本研究所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù),應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù) https//www.genome. jp/kegg/pathway.html和HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù) https//hmdb.ca/metabolites 進(jìn)行代謝物代謝通路注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭組培體系構(gòu)建

臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭種子培養(yǎng)基上播種15～20 d,發(fā)芽率超過90%。經(jīng)過60 d的原球狀莖培養(yǎng),獲得長(zhǎng)有1個(gè)葉尖的原球狀莖。然后進(jìn)行假鱗莖誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)200 d,此階段以6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的激素配比繼代培養(yǎng)效果最佳,增殖倍數(shù)達(dá)到5.7,臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭組培苗球狀莖生長(zhǎng)粗壯(表1)。

假鱗莖生根壯苗培養(yǎng)以添加NAA 0.5 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+2.4-D 0.01 mg·L-1的培養(yǎng)基生根壯苗的效果最佳,生根率最高,為100%,獨(dú)蒜蘭組培苗生長(zhǎng)粗壯(表2)。本研究接種5個(gè)臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭蒴果,平均每個(gè)蒴果可以得到1 050個(gè)含有1個(gè)葉片的假鱗莖幼苗,即通過組培條件繁育可以達(dá)到快速繁育臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的目的。

2.2 臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭假鱗莖化學(xué)成分分析

通過非靶向代謝組數(shù)據(jù)分析鑒定出不同單株假鱗莖材料的共有化合物1 229種(圖1),包括羧酸及其衍生物236種、苯及取代衍生物110種、有機(jī)氧化合物106種、脂肪酰基化合物94種、黃酮類化合物43種、甾體及甾體衍生物42種,其中以化合物1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(C34H46O17)為代表的芐酯類化合物在諸多蘭科藥用植物假鱗莖中發(fā)現(xiàn),如白及、手參、竹葉蘭等[6-8],具有肺A549細(xì)胞損傷功效[9]。

A、B,主要化合物類型組成;C,依據(jù)KEGG注釋和文獻(xiàn)檢索確定的芐酯類化合物。A, B, Composition of major compound types; C, Benzyl esters identified according to KEGG annotations and published articles.

鑒于芐酯類化合物為具有近似功效蘭科植物所特有的標(biāo)志性化合物,因此,構(gòu)建臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭假鱗莖化學(xué)成分檢測(cè)的HPLC檢測(cè)體系(圖2),該體系獲得特征峰13個(gè),同時(shí)對(duì)其代表性物質(zhì)1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯進(jìn)行定量分析。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為:y=15 409.22x+9.03,R2=0.999 9,在0.034 028～0.136112 μg·mL-1線性關(guān)系良好。臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭假鱗莖部位的1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯含量為0.53%±0.01%。

A, 標(biāo)準(zhǔn)品1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯圖譜;B,臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭樣品圖譜。A, Standard 1,4-bis[4-(glucooxy)benzyl]-2-isobutyl malate pattern; B, Atlas of P. formosana samples.

3 討論

獨(dú)蒜蘭屬植物果實(shí)為蒴果,透水透氣性較差,同時(shí)獨(dú)蒜蘭種子細(xì)小,無(wú)胚乳,種子沒有貯藏足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在自然條件下很難萌發(fā)成苗,有性繁殖率較低。獨(dú)蒜蘭的組培繁育一般需要經(jīng)過種子萌發(fā)、原球狀莖增長(zhǎng)、假鱗莖增殖、生根壯苗4個(gè)階段。本研究利用臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭種子進(jìn)行組培發(fā)芽,不需要添加激素,接種2周后種子萌發(fā);其他研究亦發(fā)現(xiàn)獨(dú)蒜蘭屬植物種子可以在MS、B5、VW等培養(yǎng)基上萌發(fā),萌發(fā)率通常高于90%[10]。原球狀莖增長(zhǎng)、假鱗莖增殖、生根壯苗培養(yǎng)需要激素的干預(yù),在種子萌發(fā)形成原球狀莖后適當(dāng)添加6-BA和NAA有利于原球莖的發(fā)育和假鱗莖的增殖。陳光芬[11]研究表明,在使用6-BA和NAA的基礎(chǔ)上配合使用KT有利于原球狀莖的發(fā)育;王躍華等[10]研究表明,在假鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中使用TDZ和KT可以誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生苗,后續(xù)可以進(jìn)一步嘗試應(yīng)用苯基噻二唑基脲(TDZ)和激動(dòng)素(KT)等激素提高臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的繁殖系數(shù)。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于獨(dú)蒜蘭化學(xué)成分的研究主要集中在獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭兩種植物,分離鑒定的化合物主要包括菲類、萜類、甾體類和聯(lián)芐類化合物[2,4-5,12-13],聯(lián)芐類化合物在蘭科植物中分布較多,具有抗腫瘤、降血糖等功效[2]。獨(dú)蒜蘭屬植物在世界范圍約有33種,我國(guó)為該屬植物的分布中心,約有29種,其中16種為特有種[14]。諸多近緣的物種與獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭含有近似的化學(xué)成分組成[15]。本研究發(fā)現(xiàn),臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭的假鱗莖含有萜類、甾體類和聯(lián)芐類化合物,表明其可能與同屬其他植物具有近似的藥理作用。臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭中1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯的含量為0.53%,與已報(bào)到的獨(dú)蒜蘭的假鱗莖中的同一物質(zhì)含量近似。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步開展藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獨(dú)蒜蘭屬其他植物的藥理作用,擴(kuò)大“冰球子”的入藥材料來源,結(jié)合快速繁育和人工栽培,緩解藥材對(duì)于瀕危植物的原料需求壓力。