“山茱萸—菟絲子”治療慢性腎小球腎炎作用機制探討*

孟令裕，王圣治

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 遼寧沈陽 110847

2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧沈陽 110032

慢性腎小球腎炎（ chronic glomerulonephritis，CGN），以蛋白尿（0.3～3.4g/d）、血尿、高血壓和水腫為基本臨床表現(xiàn)，常見于多種病理類型，發(fā)生于任何年齡，但以中青年為主，男性多見。多數(shù)起病緩慢、隱匿。早期病人可有倦怠乏力、腰部疼痛和食欲缺乏，伴或不伴有輕度浮腫，實驗室檢查多為輕度尿異常，腎功能正?；蜉p度受損這種情況可持續(xù)數(shù)年，甚至數(shù)十年，腎功能逐漸惡化，最后進入終末期腎衰竭，是我國終末期腎衰的首要病因。CGN的治療以防止或延緩腎功能進行性惡化、改善或緩解臨床癥狀及防治心腦血管并發(fā)為主要目的。目前CGN的治療主要包括積極控制高血壓和減少尿蛋白；限制食物中蛋白及磷的入量；糖皮質(zhì)激素和細胞毒藥物以及避免加重腎臟損害的因素。2021年KDIGO指南[1]指出減少蛋白尿?qū)刂颇I小球原發(fā)疾病、減少腎小球高灌注、減輕足細胞損傷、腎小球瘢痕形成、減少血清白蛋白流失進而降低血栓栓塞和感染的風(fēng)險以及減輕患者癥狀和代謝并發(fā)癥從而提高生活質(zhì)量都有至關(guān)重要的作用。其中以腎素-血管緊張素抑制劑（renin-angiotensinsystem inhibitors RASI）為首選藥物，尿蛋白較多的患者可考慮糖皮質(zhì)激素和細胞毒藥物。

CGN為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所定義的疾病，中醫(yī)對CGN沒有確切的病名，但從臨床表現(xiàn)和病位關(guān)系來看，CGN與中醫(yī)學(xué)中的“腎風(fēng)”“風(fēng)水”“虛勞”“水腫”“腰痛”等疾病中的某些證型無論是病因病機還是證候都極為相似。本病病因病機以肺，脾，腎虛為本；以風(fēng)、寒、濕、熱、濁毒、瘀血交阻腎絡(luò)為標?？梢娬撔皯偈窃摬“l(fā)病的核心環(huán)節(jié)，因此，中醫(yī)在治療上，應(yīng)堅持“治本”與“治標”并重。尤其在緩解蛋白尿方面，近年來有大量研究證實，RASI聯(lián)合中醫(yī)自擬方或中成藥其減輕蛋白尿、保護腎臟的療效明顯高于單純RASI治療[2-3]。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細胞乃至整個人體的物質(zhì)基礎(chǔ)，這與中醫(yī)所說的“精”相對應(yīng)，屬于人體內(nèi)精微物質(zhì)，因此蛋白尿所對應(yīng)的中醫(yī)概念是“精氣外泄”，當(dāng)治以開源節(jié)流。一方面補充精氣，腎虛是發(fā)為本病的基礎(chǔ)，而從五行相生理論來看，腎屬水，肝屬木，水能生木，肝為腎之子，從位置上，肝腎同屬下焦，乙癸同源，經(jīng)脈相通，故補子而壯母；腎病日久，精氣外泄，精血虧虛，而在生理功能上腎藏精，肝藏血，肝腎同源，精血同源，故補肝腎以益精養(yǎng)血。另一方面固攝精氣減少流失。因此選擇既能補肝腎又能固精的藥物成為治療CGN的關(guān)鍵，山茱萸：味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)、主入肝，補益肝腎，收澀固脫；菟絲子：味辛、甘，性平，歸肝、腎、脾經(jīng)，補益肝腎，固精縮尿。在郭恩綿[4]教授治療CGN的用藥規(guī)律中，得出山茱萸-菟絲子這一藥對，為這一理論提供了有力的事實根據(jù)，然而，關(guān)于山茱萸-菟絲子這一藥對減少蛋白尿作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于生物網(wǎng)絡(luò)的藥物-靶點-疾病關(guān)聯(lián)分析的新技術(shù)，通過構(gòu)建“多基因-多靶點-多通路”交互網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)藥物作用機理的可視化[5-6]。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法，尋找“山茱萸-菟絲子”對治療CGN的作用靶點，并從整體、細胞和分子水平闡明“山茱萸-菟絲子”對改善 CGN蛋白尿的干預(yù)機制，以期為臨床應(yīng)用提供新思路。

資料與方法

1 山茱萸-菟絲子藥對有效活性成分的篩選和靶點預(yù)測

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（網(wǎng)址：https：//www.tcmsp-e.com/）分別對山茱萸和菟絲子中的全部化學(xué)成分進行檢索（以口服生物利用度（oral bioavai-lability，OB）≥30%并且類藥性指數(shù)（drug like index，DL）≥0.18為篩選條件），得到山茱萸和菟絲子中的有效活性成分和相應(yīng)的基因靶點，并通過 Uniprot數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//www.uniprot.org/）對相應(yīng)的基因名稱標準化（檢索時設(shè)定篩選條件：基因來源物種為“Human”）[7]。

2 CGN疾病靶點預(yù)測

在 GeneCards的數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//genealacart.genecards.org/）中，輸入“Chronic Glomerulonephritis”作為關(guān)鍵字，收集與CGN相關(guān)的基因靶點。通過Venny2.1.0（網(wǎng)址：https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點，即山茱萸-菟絲子藥對治療CGN的潛在靶點。

3 山茱萸菟絲子藥對-CGN成分靶點-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.9.1構(gòu)建中藥有效成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

4 蛋白質(zhì)互相作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點預(yù)測

將1.2中得到的山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//cn.stringdb.org/），以基因來源為“homo sapiens”并且中等置信度數(shù)值為0.4為條件去除不符合標準的靶點，獲得了PPI網(wǎng)絡(luò)，并將其以 TSV格式存儲起來。將此文件導(dǎo)入到Cytoscape3.9.1中構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖，在此基礎(chǔ)上，利用 MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進一步篩選。

5 基因富集分析

將1.2中得到的山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點入到 Metascape數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：http：//metascape.org/）中，進行GO與KEGG通路富集分析[8-14]。以P＜0.05為篩選條件對山茱萸-菟絲子藥對對CGN的作用機制進行分析，并將其結(jié)果在微生信網(wǎng)絡(luò)平臺（網(wǎng)址：http：//www.bioinformatics.com.cn/）上進行可視化分析。

6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從1.5篩選出的KEGG通路中以P的數(shù)值大小為條件，篩選出排名前20的通路，通過Cytoscape 3.9.1構(gòu)建山茱萸-菟絲子治療CGN的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

1 山茱萸-菟絲子藥對有效成分及靶點篩選

從 TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到了226個山茱萸成分和29個菟絲子成分。再通過ADME參數(shù)篩選并且刪去重復(fù)值之后，得到了30個活性成分，其中20個來自山茱萸，11個來自菟絲子，β-谷甾醇（beta-sitosterol）是二者共有的成分。

山茱萸萸-菟絲子藥對的組成在表1中有說明；在此基礎(chǔ)上，以TCMSP為基礎(chǔ)，進行了相應(yīng)的篩選，最終得到了235個藥物潛在靶點。

表1 山茱萸-菟絲子藥對部分成分信息

2 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵字“Chronicglomerulonephritis”，我們發(fā)現(xiàn)CGN有1874個潛在靶點。利用在Venny2.1.0網(wǎng)站上獲得的27個藥物-疾病交集靶點，見圖1。基于藥物-疾病交集靶點，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選山茱萸-菟絲子藥對對應(yīng)的活性成分，采用 Cytoscape3.9.1構(gòu)建山茱萸-菟絲子藥對活性成分與藥物-疾病交集靶點所構(gòu)成的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

圖1 藥物-疾病交集靶點

圖2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵成分、靶點分析

將Venny2.1.0中得到的27個藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入 STRING數(shù)據(jù)庫，得到一個包含22個節(jié)點和64條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將相應(yīng)的 PPI網(wǎng)絡(luò)圖從 STRING數(shù)據(jù)庫中以TSV格式下載，然后導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中，獲得 PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。利用 MCODE插件對其進行集群分析，獲得了 AR，BAX，CASP3，JUN，NOS2，PPARG，PRKCA，PTGS2，TGFB1，9個核心靶點，并得到核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。并找到核心靶點所對應(yīng)的藥對活性成分包括槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦參堿、豆甾醇、甘露醇、羥基芫花素、四氫鴨腳木堿，并用Cytoscape3.9.1構(gòu)建核心成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

4 GO與KEGG通路富集分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入27個山茱萸-菟絲子藥對治療CG的潛在靶點，以P＜0.01為篩選條件，在（Gene Ontolog，GO）數(shù)據(jù)庫中獲得細胞組分（cellular component，CC）24條、生物過程（biological process，BP）394條、分子功能（molecular function，MF）38條，以-LogP為篩選條件從大到小排序，各選取前10條信息繪圖，見圖6。以P＜0.01為篩選條件，在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫中獲得信號通路82條以-LogP為篩選條件從大到小排序，選取前20條通路繪圖，見圖7。

圖7 KEGG信號通路分析

5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape3.9.1構(gòu)建“信號通路-靶點-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。其中度值最高的3個成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚；度值前8的靶點：CASP3、BAX、BCL2、CASP8、JUN、 PRKCA、 NOS2、TGFB1。

圖8 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

現(xiàn)階段臨床對于CGN的治療可概括為兩方面。一方面是依據(jù)腎活檢病理結(jié)果予免疫抑制治療，抑制免疫反應(yīng)對腎小球的損傷，長期用藥不良反應(yīng)較多，如骨質(zhì)疏松、肥胖、股骨頭壞死等；另一方面是針對以蛋白尿、血尿、高血壓和水腫為臨床表現(xiàn)的腎炎綜合征的對癥治療，最佳治療策略尚不清楚。中醫(yī)對CGN的治療以證為辨證要點，認為CGN蛋白尿關(guān)鍵在于腎虛失于封藏，陰精外泄。治法上應(yīng)采取平補肝腎，固攝陰精的基本治療原則以治本。方選滋腎露，山茱萸：味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)、主入肝，補益肝腎，收澀固脫，為君藥；菟絲子：味辛、甘，性平，歸肝、腎、脾經(jīng)，補益肝腎，固精縮尿，為臣藥。兩者乃平補肝腎，固精止遺之藥要。山茱萸與菟絲子兩藥君臣相伍，補陽固精與滋陰益精并施，藥味雖少但功效顯著，陰陽同調(diào)，既補充腎精又減少腎精流失，以達到固腎填精的作用。

細胞及動物相關(guān)實驗研究已證實山茱萸、菟絲子中的活性成分，如山茱萸多糖、菟絲子多酚等具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制免疫因子釋放、降低炎癥水平、抑制細胞凋亡作用。丁國明等[15]用胃嘌呤溶液灌胃制備慢性腎功能衰竭大鼠模型，證實山茱萸提取物通過下調(diào)慢性腎衰竭大鼠的炎癥因子包括TNF-α、IL-6 水平；通過降低慢腎衰大鼠體內(nèi)織 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、NOX1、活性氧（ROS）及 p-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）的水平抑制 對氧化酶（oxidase）/ROS/ERK信號通路在慢性腎衰竭中誘導(dǎo)凋亡的水平，進而抑制腎臟的纖維化，起到腎臟保護的作用。菟絲子中的槲皮素可通過上 調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達，抑制腎損傷小鼠腎臟細胞凋亡，并降低炎性因子IL-1β和IL-6的釋放，發(fā)揮其對LPS誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護作用；石柳柳等研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可降低炎性因子IL-1β和IL-6的釋放，通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達[16]。

以上研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、Venny2.1.0網(wǎng)站等網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究工具，篩選出30個山茱萸-菟絲子藥對活性成分，235個藥物潛在靶點，27個與CGN的疾病靶點取交集后得到的交集靶點。交集靶點在Cytoscape3.9.1中的MCODE插件篩選出9個核心靶點，包括AR、BAX、CASP3、JUN、NOS2、PPARG、PRKCA、PTGS2、TGFB1，并找到核心靶點所對應(yīng)的藥對活性成分包括槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦參堿、豆甾醇、甘露醇、羥基芫花素、四氫鴨腳木堿。β-谷甾醇是一種植物甾醇，與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗腫瘤等作用[17]，對腎臟有保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過激活NRF-2的抗氧化酶調(diào)節(jié)活性保護腎毒性小鼠模型的腎臟功能，并清除其體內(nèi)產(chǎn)生的過量過氧化物和有毒物質(zhì)[18]。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物[19]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、控制血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用[20]。有研究表明槲皮素可抑制2型糖尿病大鼠的腎臟肥大[21]；通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和INOs（誘導(dǎo)型一氧化氮合酶）/p38MAPK 信號通路，緩解腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰大鼠模型血管鈣化；調(diào)節(jié)輔助T細胞水平 即提高Th1細胞比例，減少TH2細胞比例，增強系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠細胞免疫功能，起到保護腎功能的作用[22]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇、保護神經(jīng)、鎮(zhèn)痛、抗糖尿病等作用，在治療糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎、黑色素瘤等疾病中的作用機制得到部分驗證[23]，但其在CGN中的作用尚未得到證實。

GO分析中BP注釋表明山茱萸-菟絲子藥對可能通過參與血液循環(huán)、細胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)、磷酸化的正向調(diào)控等生物過程作用于CGN；CC注釋表明山茱萸-菟絲子藥對可能通過參與血液微粒、膜筏、膜微域、絲氨酸型內(nèi)肽酶復(fù)合物、絲氨酸型肽酶復(fù)合物等細胞組分調(diào)控上述過程。

KEGG pathway富集分析顯示山茱萸-菟絲子活性成分治療CGN的靶點主要富集在IL-17 信號通路、鈣信號通路、細胞凋亡、p53 信號通路，在生理條件下，p53是一種通過抑制細胞分裂，促進細胞衰老甚至凋亡，抑制異常細胞增殖的因子，參與到細胞周期的調(diào)控中。有研究表明腎臟病理中，腎臟組織中細胞周期蛋白P53陽性率越高，蛋白尿、高血壓的嚴重程度就越高，對腎功能的損害也越大[24]。

白介素-17（interleukin-17，IL-17）是一個重要的促炎癥細胞因子，是由CD4+T淋巴細胞中除輔助T細胞1（Th1）和輔助T細胞2（Th2）亞群以外的第三亞群——輔助T細胞17（Th17）分泌的特征性細胞因子[25]，包含6個結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞因子，即IL-17A到IL-17F，其中以IL-17A最為多見[26]。在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，多方面研究證實CGN發(fā)病與 CD+4T細胞 Th1/Th2細胞平衡紊亂、Th17功能改變密切相關(guān)[27-32]。其在腎小球腎炎中的作用也得到越來越多的證實[33]。有動物研究證實，抗腎小球基底膜腎小球腎炎的動物腎的Th17占活化T細胞的比率升高[34]；又臨床研究指出，抗中性粒細胞胞漿抗體 （antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關(guān)性血管炎患者的血清IL-17A水平及髓過氧化物酶（myeloperocidase，MPO）和PR3特異性的Th17數(shù)均增高[35-36]?？梢奍L-17的異常增高與自身免疫相關(guān)腎小球腎炎的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。 Huh JR等，用IL-17A 缺陷的小鼠制成的抗MPO腎小球腎炎模型證實了 IL-17A的作用。IL-17A缺陷的小鼠腎病變輕，IL- 17A能促進中性粒細胞向腎小球聚集，提高對MPO的獲得性自身免疫[37]。有力的證實了IL-17A確實是介導(dǎo)自身免疫性腎炎的關(guān)鍵因素。由此可推測抑制Th17細胞的分化、減少IL-17的分泌，研發(fā)IL-17A或IL-17R的抗體可成為治療CGN的新思路。

綜上，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)深入挖掘得到“山茱萸萸-菟絲子”治療 CGN的藥物有效成分、其對CGN的潛在作用靶點以及藥物可能發(fā)生作用的分子通路，這為揭示中藥治療CGN多靶點-多通路的復(fù)雜作用機理提供了理論依據(jù)，未來可對其中的關(guān)鍵成分和核心靶點進行體內(nèi)和體外實驗驗證。