當歸活性成分抗阿爾茨海默病網(wǎng)絡(luò)藥理作用機制探究*

曾慶濤，蘭美華，李桂云，王雅樂，黃海，吳紅彥

廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院 廣東羅湖 518000

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以老年人為主體，慢性的中樞神經(jīng)性退行性疾病，以認知障礙、記憶衰退為主要表現(xiàn)，伴隨一系列腦功能障礙[1]。該病目前機制不明確，大多數(shù)學(xué)者認為與β淀粉樣蛋白（βA）的沉積有關(guān)[2]。隨著全球人口老齡化的逐年遞增，預(yù)估2050年AD患者將增至約1.38億[3]。目前，臨床主要以乙酰膽堿酯酶抑制劑和谷氨酸受體阻滯劑等藥物治療，但療效欠佳、毒副作用頗多[4]。因此，迫切需要在AD藥物開發(fā)方面取得突破性進展，以治療潛在的疾病，并阻止伴隨而來的最終導(dǎo)致癥狀惡化的細胞損傷。然而，目前進行了所有艱苦的研究工作，還沒有有效的最佳治療藥物。

本品為傘形科植物當歸的干燥根。主產(chǎn)于甘肅。秋季末采挖，除去須根及泥沙，待水分稍蒸發(fā)后，捆成小把，上棚，用煙火緩緩熏干。切薄片，生用或酒炙用，中藥藥理揭示，該藥具有改善AD小鼠記憶缺失[5]、抗炎抗衰老[6-7]、調(diào)節(jié)機體神經(jīng)遞質(zhì)[8]等作用，對AD具有防治作用。當歸常與其他中藥按組分配伍治療AD，可見當歸治療AD具有一定潛力。然而，目前當歸治療AD的研究以臨床及動物研究為主[9]，尚未揭示AD靶點與當歸的相互作用機制，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過篩選當歸主要有效活性成分、作用靶點，構(gòu)建“成分-靶點-疾病”[10]網(wǎng)絡(luò)圖，為揭示當歸主要有效成分多成分-多靶點-多通路等特點，便于進一步探究當歸的具體作用機制。

資料與方法

1 活性成分篩選

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)[11]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacolo-gy Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），篩選當歸有效成分，通常以藥代動力學(xué)參數(shù)（Absorp-tion and Distribution and Metabolism and Excretion，ADME）為依據(jù)，設(shè)置口服生物利用度（Oral Bioavail-ability，OB）≥30，藥物類似度（Druglikeness，DL）≥0.18設(shè)為篩選條件[12]，篩選主要有效活性成分。

2 疾病相關(guān)靶點基因獲取

以“Alzheimer disease”為檢索詞，運用GeneCards[13]（ https： / /www.genecards.org /） 、OMIM[14]（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數(shù)據(jù)庫，檢索AD的靶點，將2次檢索的AD靶點重合，剔除重復(fù)的相關(guān)靶點。運用R軟件，將藥物和疾病靶點獲取交集，獲取治療AD的靶點，并繪制韋恩圖。

3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將藥物主要有效活性成分與AD靶點取交集，獲得治療AD的關(guān)鍵靶點。利用Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點（Node）代表基因、蛋白或活性成分；邊（Edge）代表活性成分與相互作用靶點之間的聯(lián)系。運用網(wǎng)絡(luò)圖可深入探究當歸治療AD的作用機制。

4 構(gòu)建PPI（Protein- ProteinInteraction）

將當歸治療AD的靶點，上傳STRING[15]（https：//string-db.org）中，設(shè)置篩選物種為“Homo Sapiens”，得到蛋白的相互作用，以txt文件儲存。運用Cytoscape 3.7.1[16]軟件，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)，對PPI圖進行可視化處理，獲得當歸治療AD靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

5 GO注釋及KEGG通路分析

在R軟件中安裝生物包Bioconductor，用于分析GO注釋信息。ClusterProfiler包為基因數(shù)據(jù)最常用包之一，安裝于R軟件中，可搜索GO 注釋和KEGG（http：//rest.kegg.jp/link/hsa/pathway）進行通路分析，其可視化功能特點突出。以篩選條件P＜0.05進行篩選，進行通路分析，同時將分析的結(jié)果進行可視化處理。

結(jié) 果

1 活性成分篩選

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選當歸活性成分為125個，設(shè)置OB≥30和DL≥0.18為篩選條件，篩選出主要有效活性成分2個，見表1。

表1 當歸主要有效活性成分

2 當歸治療AD的作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選出當歸主要有效活性成分為2個。通過GeneCards、OMIM庫搜索AD靶點合并，剔除重復(fù)靶點，獲得735個靶點。運用R軟件前，須安裝“VennDiagram”程序包，獲得治療AD的靶點34個，同時繪制韋恩圖（圖1），揭示了當歸可調(diào)節(jié)多個靶點發(fā)揮治療AD的作用。

圖1 當歸-AD作用基因

3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape軟件對當歸有效活性成分及其治療AD作用靶點進行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖繪制，經(jīng)分析，當歸發(fā)揮重要作用的生物活性成分與對應(yīng)作用靶點的相互關(guān)系見圖2。不同顏色及形狀代表不同的物質(zhì)，其中紅色代表AD，藍色代表當歸，綠色代表藥物主要有效成分，黃色代表作用靶點，而邊則代表成分與靶點的關(guān)系。不同的靶點可對應(yīng)同活性成分，相靶點也可對不同的活性成分，揭示了當歸治療AD具有多成分、多靶點的特點。

圖2 當歸治療AD的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

4 當歸治療AD的靶點

登陸STRING庫，導(dǎo)入當歸治療AD的靶點，將篩選條件設(shè)定為＞0.9，將游離網(wǎng)絡(luò)圖外的蛋白予隱藏，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。該圖，節(jié)點共38個，平均值4.518，圖中的“節(jié)點”代表藥物靶點，“邊”表示靶點之間的相互作用關(guān)系。邊數(shù)越多表示該節(jié)點對應(yīng)的靶點在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。運用R軟件，得到關(guān)鍵靶點的信息條形圖（見圖4）。結(jié)果揭示了，ADRA2A、CASP3、MAOA、JUN、SLC6A4、ADRA1A、CHRM2等蛋白的度值較高，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶。

圖3 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點信息

5 GO注釋功能及KEGG通路分析

R軟件為生物信息常用軟件之一，使用前安裝Bioconductor包。GO、KEGG庫進行通路分析。GO通路揭示：當歸治療AD的關(guān)鍵靶點富集顯著的前10個生物學(xué)功能主要為表明當歸G蛋白偶聯(lián)胺受體活性（8個靶點），突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個靶點），神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個靶點），跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（6個靶點），G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（5個靶點），乙酰膽堿受體活性（5個靶點），蛋白質(zhì)異二聚活性（5個靶點），金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（5個靶點）。藥物主要有效成分可通過多靶點調(diào)控而發(fā)揮治療AD的作用（圖5）。KEGG通路分析，獲得15條通路，P值＜0.01為篩選條件，獲取3條主要信號通路。設(shè)置P值和相關(guān)基因的數(shù)量為篩選條件，見表2。富集分析發(fā)現(xiàn)，基因顯著富集在（AGE/RAGE、Ca2+、p53）等通路上。

圖5 關(guān)鍵靶點基因生物功能注釋信息

討 論

AD的發(fā)病機制與抗炎、機體代謝和免疫系統(tǒng)等有一定關(guān)聯(lián)[17]。有人研究發(fā)現(xiàn)[18]神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣的損傷，可致AD發(fā)展，主要是神經(jīng)細胞內(nèi)鈣信號是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，Ca2+的神經(jīng)元缺失可加速記憶機體衰退，增加淀粉樣變和tau病變，同時Ca2+超載可促進超氧化物的產(chǎn)生、代謝紊亂和細胞凋亡而促進AD的進展神經(jīng)細胞死亡，這些結(jié)果提供了鈣失調(diào)和AD的代謝功能障礙假說，Ca2+信號通路上有AD的潛在治療靶點。Ca2+的調(diào)節(jié)對神經(jīng)細胞的正常生長至關(guān)重要，鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)是致許多神經(jīng)退行性疾病的重要因素，包括AD，在AD的大腦中，其他類型的細胞也被破壞了Ca2+通道和腔室參與了可能成為潛在靶點的疾病機制[19]。

p53可補償或防御機制的基礎(chǔ)防止神經(jīng)元退化，具體包括維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥，控制突觸功能，減少淀粉樣蛋白β肽和抑制神經(jīng)元細胞周期的重新進入，因此，p53依賴性代償機制的失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[20]。AD大腦中，核外和p53介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)明顯減少，控制大腦呈現(xiàn)健康的DNA損傷反應(yīng)，提示AD核p53功能的喪失可能與p53有關(guān)聚集和/或與tau低聚物的相互作用。鑒于p53在細胞生理學(xué)中的重要作用這一關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的破壞可能導(dǎo)致AD患者神經(jīng)退行性變的不可逆轉(zhuǎn)過程[21]。

有人研究發(fā)現(xiàn)[22]，對于1424個DEGs（620個基因表達上調(diào)，804個基因表達上調(diào)）AD組與正常對照組間差異有顯著性（P＜0.05）。功能性注釋結(jié)果顯示，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、雌激素信號通路和notch信號通路比較四種活性成分的靶基因，共發(fā)現(xiàn)16個共有基因。其中HTR2A和ADRA2A也在神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑中富集。海馬神經(jīng)元的丟失是一個早期AD的形態(tài)學(xué)癥狀，我們發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型中，海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元的死亡AD的發(fā)生依賴于BECN1和CASP3基因的過度表達腦缺血后早期。我們的觀察結(jié)果表明腦損傷的關(guān)鍵作用缺血再灌注在AD發(fā)展中的作用通過原發(fā)性海馬神經(jīng)變性，包括CA3區(qū)隨著認知功能的逐漸退化以及延長生存期。因此，損害上述區(qū)域?qū)е铝谁h(huán)境惡化短期記憶，導(dǎo)致無法創(chuàng)造新的記憶，腦缺血再灌注損傷的共同遺傳機制研究促進對這兩種疾病的新病理途徑的了解，并指導(dǎo)今后的研究腦缺血或AD研究的新方向[23]。

綜上，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究當歸治療AD相關(guān)作用機制，研究作用機制初步篩選當歸有效成分治療AD的作用機制，揭示其臨床治療過程涉及了多個有效活性成分、作用靶標及多個信號通路，其作用機制十分復(fù)雜，并非僅通過單個成分、作用單個靶標或調(diào)控單條通路發(fā)揮作用，與中藥治療疾病的多靶點特點相吻合。為進一步從當歸藥中提取有效活性成分治療AD提供了參考依據(jù)。但僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面來探究當歸藥物有效活性成分治療AD的作用機制，只是一種理論的預(yù)測探討，仍需通過相關(guān)實驗來進一步驗證當歸作用的具體機制，為臨床應(yīng)用提供支撐。