一株源自傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中納豆菌株的分離鑒定與分析

徐林通，張冬鶴，侯進慧，李寧寧，談晟含，文 宇

（徐州工程學院，江蘇徐州 221018）

0 引言

納豆菌，又名納豆枯草芽孢桿菌，屬枯草芽孢桿菌納豆菌亞種，是革蘭氏染色陽性菌，芽孢的形狀是柱狀或者橢圓形[1]。納豆菌在不同生長時期的生長形態(tài)具有差異，在延滯期時，菌體結構如長鏈形狀一般；在對數(shù)生長期末期，菌體開始斷裂，結構形似短桿[2]。納豆菌具有提高記憶力、促進代謝、軟化血管、調(diào)整腸道功能及提高免疫力等方面的功效[3]。據(jù)記載，在抗生素還沒有被發(fā)現(xiàn)之前，普通百姓就是通過以納豆為食，治療消化道方面的疾病[4]。這是因為納豆菌是好氧菌，被人體食入，耗盡腸道內(nèi)的氧氣，氧氣全無，一些有害的好氧菌就無法生存，對志賀氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等都能有很好的抑制作用。Hsu M F 等人[5]研究了用納豆菌發(fā)酵黃芪產(chǎn)品在保健美容等領域的應用，研究結果證實，這種乳酸菌產(chǎn)品能夠提高人類皮膚中成纖維細胞內(nèi)膠原蛋白的生物合成，進而減少了細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)由于年齡而增加的損失。

納豆發(fā)酵時，可通過枯草桿菌（Bacillus subtilis） 產(chǎn)生納豆激酶。纖溶活力是納豆激酶最明顯的特征[6]。我國研究人員對納豆激酶展開了研究，并且在納豆激酶的基因克隆和表達上取得了一定的進展[7]。從體外試驗可得出以下結論，溶解纖維蛋白凝塊需要納豆激酶和纖維蛋白酶一起作用。在動物試驗中通過靜脈注射操作后，血纖維蛋白溶酶的纖溶能力低于納豆激酶[8]。在臨床試驗中，服用納豆激酶可使健康人群血栓溶解面積提升。納豆激酶除了可靜脈注射，直接服用的藥效也很好[9]。納豆激酶在眾多溶栓劑中有溶栓效果好、原料容易獲取、價格便宜等優(yōu)點，備受消費者喜愛，更是各國溶栓劑研究的熱點。試驗對分離自我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中的納豆菌進行了分析。

1 材料與方法

1.1 使用的試劑及設備

研究所選用的生化試劑均是分析純試劑。主要試劑有蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂粉、DNA Marker、T 載體、加樣緩沖液（6x）、0.25% 溴酚蘭、40%蔗糖、瓊脂糖、溴化乙錠（EB），購自國藥集團等試劑公司。

液體LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，用ddH2O 定容至1 L；固體培養(yǎng)基中再加入瓊脂粉20 g，高壓滅菌后備用。

所使用的儀器設備主要有分析天平、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、電泳儀、凝膠觀察儀、常溫離心機、搖床、數(shù)顯恒溫水浴鍋、移液器等。

1.2 菌株分離與純培養(yǎng)

通過固體培養(yǎng)基上劃線純培養(yǎng)方法，獲得純的微生物菌種。將接種的培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)24 h 后，觀察菌種分離效果。

1.3 生理生化性質(zhì)分析[10]

通過分析菌株的生理生化性質(zhì)，分析菌株的分類地位，所采用的分析方法主要有以下幾種。

1.3.1 觸酶試驗

用無菌接種環(huán)挑取菌種純培養(yǎng)物，小心地放在已滅菌的培養(yǎng)皿上，用移液槍吸取適量新鮮配制3%的H2O2滴在菌株上，立即觀察是否產(chǎn)生氣泡，若立刻產(chǎn)生大量氣泡，則該菌為過氧化氫酶陽性，無氣泡則為陰性。

1.3.2 淀粉水解試驗

采用魯哥氏碘液檢測，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則該菌為陽性，反之則為陰性。

1.3.3 吲哚試驗采用吲哚試劑和乙醚進行檢測，試管溶液反應后，出現(xiàn)玫瑰紅色為陽性，無玫瑰紅色為陰性。

1.3.4 乙酰甲基甲醇試驗（V-P 試驗）

將菌種在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)24~48 h。培養(yǎng)結束后，搖勻試管。吸取體積分數(shù)為6%α-萘酚酒精溶液1 mL，振蕩均勻，吸取加入質(zhì)量分數(shù)為40%的KOH 溶液0.4 mL，用無菌玻璃棒蘸取微量肌酸，伸入培養(yǎng)基混合均勻，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。若培養(yǎng)液產(chǎn)生紅色為陽性，如無紅色則為陰性。

1.3.5 甲基紅試驗（M.R 試驗）

將菌株在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)24~48 h。培養(yǎng)結束后，將甲基紅指示劑沿試管內(nèi)壁滴入。如培養(yǎng)液發(fā)生紅色反應則為陽性，無紅色反應則為陰性。

1.3.6 硫化氫試驗

將菌種在醋酸鉛培養(yǎng)基培養(yǎng)24~48 h。培養(yǎng)結束后，觀察培養(yǎng)基上菌株周圍是否變黑，判斷該菌株能否生成硫化氫。

1.3.7 檸檬酸鹽試驗

將菌種在檸檬酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)基取出觀察是否發(fā)生顏色變化。

1.3.8 葡萄糖發(fā)酵試驗

將菌種接種于以葡萄糖作為碳源的發(fā)酵液中，振蕩使菌種在培養(yǎng)基中均勻分布，培養(yǎng)24~48 h。培養(yǎng)結束后觀察紫色發(fā)酵液有無變化，如果培養(yǎng)基變黃說明該菌種可產(chǎn)酸。

1.3.9 明膠水解試驗

用接種針挑取菌種穿刺接種到明膠培養(yǎng)基，于21 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)7 d 或更長時間，每天觀察穿刺培養(yǎng)部分的狀態(tài)。記錄明膠培養(yǎng)基是否仍然凝固，穿刺培養(yǎng)周圍有無出現(xiàn)液化。

1.4 基因組DNA 提取與電泳檢測

采用苯酚-氯仿有機溶劑抽提的方法[11]，提取菌株基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳方法分析DNA的提取情況。

1.5 菌株16S rDNA 序列分析

通過PCR 擴增的方法獲得菌株16S rDNA，引物序列是F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[12]。擴增后，將PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，分析目的條帶擴增情況。將無雜質(zhì)的目的基因擴增產(chǎn)物送上海生工進行測序。使用生物信息學軟件對菌株16S rDNA分子序列進行分析，做出演化樹，確定菌株分類地位。

1.6 菌株納豆激酶基因和酶蛋白分析

利用在線數(shù)據(jù)庫中納豆激酶基因序列特征，設計擴增引物，所采用的納豆激酶引物如下：

以菌株基因組DNA 為模板，擴增納豆激酶基因序列。利用生物信息學軟件進行分析。分析獲得基因?qū)陌被嵝蛄?，在Swiss 網(wǎng)站上進行在線分析，確定其三維結構[13]。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化與菌落特征分析

從我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中，分離多株菌株。對其中納豆激酶活性較高的1 株菌株SD1 進行了研究。利用劃線純培養(yǎng)方法獲得菌株單菌落，其菌落顏色呈現(xiàn)灰白色，菌落表面干燥，邊緣有褶皺，中心無突起，整體平滑，呈現(xiàn)出芽胞桿菌的菌落特征。

菌株SD1 的菌落特征見圖1。

圖1 菌株SD1 的菌落特征

2.2 菌株生理生化特征分析

通過試驗分析獲得菌株的生理生化特征，將其特征與納豆菌和枯草芽孢桿菌的特征相比較。納豆菌與枯草芽孢桿菌的分類地位接近，因此其生理生化特性大多一致。所分析的SD1 菌株與納豆菌的生理生化特性一致，特別是葡萄糖產(chǎn)氣方面，呈現(xiàn)陰性?？莶菅挎邨U菌的葡萄糖產(chǎn)氣結果則是陽性。

生理生化試驗結果見表1。

表1 生理生化試驗結果

2.3 菌株16S rDNA 擴增與分子分類特征

通過有機溶劑抽提的方法，提取菌株SD1 的基因組DNA 作為模板，擴增其16S rDNA 分子序列。在PCR 擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出1 條符合預期結果的特異性條帶。

PCR 方法擴增菌株16S rDNA 分子的電泳結果見圖2。

圖2 PCR 方法擴增菌株16S rDNA 分子的電泳結果

2.4 菌株SD1 的16S rDNA 序列及分析

將該16S rDNA 送生物公司進行測序，利用重疊序列進行拼接，獲得了1 條長度為1 394 bp 的DNA序列。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的相關序列，制作菌株分子演化樹。

菌株SD1 的16S rDNA 序列見圖3，菌株SD1 的16S rDNA 演化樹分析結果見圖4。

圖3 菌株SD1 的16S rDNA 序列

圖4 菌株SD1 的16S rDNA 演化樹分析結果

利用BLAST 程序，在NCBI 網(wǎng)站上比較分析該序列，確定菌株SD1 屬于芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 的1 個種。

2.5 菌株SD1 納豆激酶基因PCR 擴增與分析

以菌株SD1 基因組DNA 為模板，利用納豆激酶引物進行PCR 擴增，可擴增出1 條特異性的納豆激酶目的條帶。結果顯示，擴增出1 條明顯的特異性條帶，大小在1 200 bp 左右，符合預期。將菌株SD1 納豆激酶基因PCR 樣品送到生物公司進行測序，獲得了長度為1 174 bp 的基因序列。將菌株SD1 的納豆激酶基因序列翻譯成氨基酸序列。

菌株SD1 納豆激酶基因PCR 電泳結果見圖5，菌株SD1 的納豆激酶氨基酸序列見圖6。

圖5 菌株SD1 納豆激酶基因PCR 電泳結果

圖6 菌株SD1 的納豆激酶氨基酸序列

2.6 菌株SD1 納豆激酶三維空間結構模擬與分析

將菌株SD1 的納豆激酶氨基酸序列在https：//swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站上進行在線分析，模擬其三維空間結構，推測氨基酸位點的空間結構。預測三維結構中，含有6 個α- 螺旋，12 個β- 折疊。在6 個α- 螺旋中，每2 個一組形成αα超二級結構，共有3 個αα超二級結構，分別位于三維結構的左、中、右。12 個β-折疊中，有4 個與圖中右側的αα超二級結構接近，有8 個與中間的αα超二級結構接近。

菌株SD1 納豆激酶模擬三維空間結構見圖7。

圖7 菌株SD1 納豆激酶模擬三維空間結構

3 結論

通過平板劃線分離法，獲得多株產(chǎn)納豆激酶菌株，對其中納豆激酶活性較高的菌株SD1 進行了分析。由菌落形態(tài)可以看出，菌株SD1 的菌落顏色是白色，菌落表面干燥，邊緣有褶皺，中心無突起，整體平滑，呈現(xiàn)出芽孢桿菌的菌落特征。在NCBI 網(wǎng)站利用BLAST 程序?qū)闟D1 的16S rDNA 分子序列和數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，結果顯示菌株SD1 是枯草芽孢桿菌屬，結合生理生化性質(zhì)分析，初步確定菌株SD1 是納豆菌。利用設計的納豆基因引物，以菌株SD1 基因為模板，擴增出納豆激酶基因1 174 bp 條帶。以DNA 序列為基礎，通過生物信息學軟件推導出氨基酸序列，在Swiss 網(wǎng)站上進行在線分析，獲得納豆激酶三維空間結構。預測的三維結構中，含有6 個α-螺旋，12 個β-折疊，在空間上形成3 個αα超二級結構，分別位于三維結構的左、中、右。12 個β-折疊中，有4 個與右側的αα超二級結構接近，有8 個與中間的αα超二級結構接近。對于納豆菌株SD1 的研究，為新型納豆菌和納豆激酶的開發(fā)應用提供了研究基礎。