基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討中藥調(diào)節(jié)卵巢癌鉑耐藥用藥規(guī)律研究

陳芯媛,林小惠,陳吶敏,陳家鑫,游翠芳

在我國(guó),卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其病死率位于女性生殖道惡性腫瘤之首,是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤[1]。由于卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)困難,癥狀隱匿,多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期[2]。目前一線化療包括術(shù)后輔助化療和新輔助化療,而鉑類藥物是一線化療方案的主要藥物。然而,隨著化療周期的增加,患者易發(fā)生鉑類藥物的耐受,癌細(xì)胞會(huì)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)、遷移,普遍預(yù)后極差[3]。針對(duì)卵巢癌鉑類耐藥,目前采取的非鉑類化療藥物、靶向藥物治療、內(nèi)分泌治療、免疫治療等手段在臨床應(yīng)用中仍存在治療效果不理想、藥物毒性反應(yīng)大等問(wèn)題,且耐藥機(jī)制尚未明確[4]。因此,卵巢癌對(duì)鉑類藥物的耐藥性是目前臨床治療面臨的重要挑戰(zhàn)。對(duì)卵巢癌鉑類耐藥機(jī)制的研究以及新的治療方案的開(kāi)發(fā)也成為了當(dāng)前卵巢癌治療的熱門研究領(lǐng)域。

在疾病治療領(lǐng)域,傳統(tǒng)中醫(yī)藥的治療效果得到了充分證實(shí)。隨著中醫(yī)中藥在癌癥治療中的廣泛應(yīng)用,尋找具有高效、低毒、可增強(qiáng)或逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥性的天然化合物,對(duì)于卵巢癌鉑耐藥患者的治療具有極其重要的價(jià)值。同時(shí),也有助于推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化發(fā)展以及二次開(kāi)發(fā)利用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科,從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā),解析藥物與治療對(duì)象之間的分子關(guān)聯(lián)[5]。在中藥藥理機(jī)制研究、新藥發(fā)現(xiàn)、藥物重新定位、老藥新用以及不良反應(yīng)、毒副作用研究等方面取得了良好成效。本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥的核心靶點(diǎn)、化合物和中藥進(jìn)行篩選和探究,借助分子對(duì)接驗(yàn)證并分析中藥的作用機(jī)制,為卵巢癌鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌鉑耐藥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)分別以“ovarian cancer”“cisplatin resistance”“platinum resistance”為檢索詞進(jìn)行檢索,物種設(shè)置為“Homo sapiens”獲取的數(shù)據(jù),借助Hiplot繪制韋恩圖,其交集靶點(diǎn)定義為卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)Uniport蛋白質(zhì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一靶點(diǎn)基因/蛋白信息,R軟件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.2 候選化合物及中藥的篩選 以卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點(diǎn)為關(guān)鍵詞,通過(guò)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)獲取可干預(yù)靶點(diǎn)的活性化合物,定義為潛在治療卵巢癌鉑耐藥的候選化合物。根據(jù)TCMSP平臺(tái)建議的藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18、半衰期(HL)>4、分子量(MW)≤500Da、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(RBN)≤10、拓?fù)錁O性表面積(TPSA)≤600?2。

1.3 中藥挖掘及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建 通過(guò)TCMSP平臺(tái)構(gòu)建的“藥物靶點(diǎn)—活性化合物—中藥”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,映射出含有候選化合物的中藥,參考標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版一部)規(guī)范統(tǒng)一中藥名稱,挖掘出可治療潛在靶點(diǎn)的中藥。應(yīng)用Cytoscape 3.6.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化及拓?fù)浞治?構(gòu)建“潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。對(duì)具有潛在治療作用的中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)的分析,統(tǒng)計(jì)各個(gè)中藥在四氣五味、歸經(jīng)的頻次,并按頻次進(jìn)行排序。

1.4 分子對(duì)接 為驗(yàn)證“潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥”網(wǎng)絡(luò)中候選化合物與潛在靶點(diǎn)相互作用,選擇度值>4的候選化合物作為配體,度值排名前5位的核心靶點(diǎn)作為受體進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載受體結(jié)構(gòu)、ChemOffice結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換及幾何優(yōu)化,收集候選化合物的三維結(jié)構(gòu);通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB),收集合適的靶點(diǎn)蛋白三維結(jié)構(gòu);應(yīng)用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接及結(jié)果評(píng)估?；诮Y(jié)合構(gòu)象和結(jié)合親和力選擇最優(yōu)配體—受體結(jié)合構(gòu)型,采用PILP工具分析分子間作用力,PyMol軟件對(duì)分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 潛在靶點(diǎn)獲取 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“ovarian cancer”為檢索詞,獲得卵巢癌疾病靶點(diǎn)8 929個(gè),取TOP 500個(gè)靶點(diǎn)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“cisplatin resistance”及“platinum resistance”為檢索詞,分別獲得4 082個(gè)和1 862個(gè)靶點(diǎn),以score>10為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得202個(gè)與鉑耐藥相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)卵巢癌靶點(diǎn)與鉑耐藥靶點(diǎn)取交集,共獲得卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點(diǎn)111個(gè),定義為干預(yù)卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 卵巢癌鉑耐藥靶點(diǎn)的Venn圖

2.2 候選化合物獲取及構(gòu)建潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥網(wǎng)絡(luò) 將潛在靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找可匹配的候選化合物及中藥,其中可結(jié)合的靶點(diǎn)23個(gè),候選化合物235個(gè),中藥406種。利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖2。紅色箭頭節(jié)點(diǎn)為潛在靶點(diǎn),藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)為候選化合物,黃色三角形節(jié)點(diǎn)為中藥,節(jié)點(diǎn)越大,度值越高,關(guān)聯(lián)性越高。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果,度值排名前5的核心靶點(diǎn)分別為PGR、AR、MAPK14、TNF、CASP3;度值>4的核心化合物分別為皂素(diosgenin)、玫瑰樹(shù)堿(ellipticine)、丹參酮ⅡA(tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、苦參堿(matrine),詳見(jiàn)表1。以上化合物與卵巢癌鉑耐藥靶點(diǎn)具有較強(qiáng)相關(guān)性,可進(jìn)一步研究。

表1 干預(yù)卵巢癌鉑耐藥的潛在核心化合物(度值>4)

圖2 潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 潛在靶點(diǎn)GO功能和KEGG通路富集分析 通過(guò)R包c(diǎn)lusterProfiler進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析(P<0.05),見(jiàn)圖3。GO功能列出富集結(jié)果前10的條目,生物過(guò)程(BP)主要涉及上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)等;細(xì)胞組分(CC)主要在膜筏、膜系統(tǒng)微域、轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體等表達(dá);分子功能(MF)主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG通路列出富集結(jié)果前30的條目,潛在靶點(diǎn)可能參與調(diào)控PI3K-Akt路、MAPK通路、FoxO通路、HIF-1通路、p-53通路及癌癥、腫瘤及耐藥性疾病相關(guān)的通路。

圖3 潛在靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

2.4 與靶蛋白的分子對(duì)接 通過(guò)分子對(duì)接研究核心化合物與主要靶點(diǎn)之間的相互作用,結(jié)合親和力<-5.0 kcal/mol,表明具有良好的相互作用。分子對(duì)接自由能熱圖(圖4)結(jié)果表明核心化合物皂素、玫瑰樹(shù)堿、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、β-谷甾醇、苦參堿與主要靶標(biāo)蛋白AR(PDBID：1z95)、CASP3(PDBID：3kjf)、MAPK14(PDBID：1wbo)、PGR(PDBID：3g8o)、TNF(PDBID：2az5)對(duì)接結(jié)果,對(duì)接得分最高-6.2 kcal/mol,最低為-10.4 kcal/mol,具有良好的結(jié)合效應(yīng)和可靠的相互作用,卵巢癌鉑耐藥潛在靶點(diǎn)與化合物分子對(duì)接示意圖見(jiàn)圖5,分子間作用力包括氫鍵、鹽橋。

圖4 卵巢癌鉑耐藥潛在靶點(diǎn)與化合物分子對(duì)接自由能熱圖

注：A：AR-玫瑰樹(shù)堿;B：CAPS3-丹參酮ⅡA;C：MAPK14-皂素;D：PGR-苦參堿;E：TNF-隱丹參酮;F：PGR-β-谷甾醇

2.5 中藥性味歸經(jīng)功效分析 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版一部)所收錄品種,保留度值>4,共收集到75種中草藥,部分中藥見(jiàn)圖6。統(tǒng)計(jì)中藥基本信息(圖7),分析中藥的性味歸經(jīng),其中藥性以寒性(34.67%)出現(xiàn)頻次最高,如半枝蓮、關(guān)黃柏。藥味以苦味(37.39%)藥物居多,如吳茱萸、丹參。歸經(jīng)入肝經(jīng)(20.44%)、肺經(jīng)(17.68%)藥物居多,如三棱、苦參。

圖6 潛在靶點(diǎn)—候選化合物—中藥網(wǎng)絡(luò)度值前20位的中藥

圖7 逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥候選中藥的性味分布及歸經(jīng)分析

3 討 論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),探討中藥在增敏卵巢癌化療藥物相關(guān)耐藥中的作用,利用相關(guān)拓?fù)浞治鰠?shù)篩選核心靶點(diǎn)、化合物和中藥,并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)所納入靶點(diǎn)和化合物的藥理活性。

經(jīng)過(guò)分析,我們發(fā)現(xiàn)度值上排名較為靠前的核心靶點(diǎn)包括PGR、AR、MAPK14、TNF、CASP3等。這些靶點(diǎn)可能通過(guò)某種作用機(jī)制,對(duì)化療藥物產(chǎn)生增敏效果。TNF是一種具有抗腫瘤和促炎活性的細(xì)胞因子,通過(guò)與其受體TNFR1和TNFR2結(jié)合,降低某些化療藥物的敏感性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥、促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移、激活保護(hù)性信號(hào)通路和誘導(dǎo)免疫耐受[6]。TNF能誘導(dǎo)NF-kB信號(hào)通路對(duì)卵巢癌的多種細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生影響,調(diào)節(jié)增殖、侵襲、黏附和血管生成有關(guān)的下游基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程[7]。值得注意的是,TNF具有雙重作用,在腫瘤化療中的應(yīng)用需要考慮其劑量、途徑、時(shí)間和靶向等因素,以及不同類型和階段的腫瘤,通過(guò)干預(yù)TNF來(lái)克服化學(xué)耐藥性并增加治療反應(yīng)仍需深入研究。MAPK14是p38 MAPK在人體中常見(jiàn)亞型之一,激活p38 MAPK途徑并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA),前列腺素—內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2),早期生長(zhǎng)反應(yīng)1(EGR1)和缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIFI1A)發(fā)揮作用,從而促進(jìn)卵巢癌的惡性生物學(xué)行為和抵抗力[8]。miR-433的過(guò)表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療的耐受性[9],且通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出了與細(xì)胞衰老相關(guān)的miR-433靶基因包括CDK6,MAPK14,E2F3和CDKN2A。因此,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的潛在靶點(diǎn)參與鉑類藥物耐藥的調(diào)控,可為后續(xù)研究提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn),潛在靶點(diǎn)—候選化合物中隱丹參酮(CPT)是一種從中藥丹參中分離的脂溶性二萜醌類化合物。CPT已被證實(shí)具有良好的抗腫瘤作用,在消化系統(tǒng)腫瘤如胃癌、肝癌、腸癌,在生殖系統(tǒng)腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和前列腺癌,在造血系統(tǒng)腫瘤白血病等腫瘤細(xì)胞都具有抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用[10]。同時(shí),CPT還具有增敏化療療效或逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。CPT通過(guò)下調(diào)P-gp表達(dá)增加抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累從而逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥[11];產(chǎn)生的活性氧在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用,還通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)激,對(duì)順鉑、依托泊苷和氟尿嘧啶等多種抗腫瘤藥物具有增敏作用;通過(guò)減弱腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)順帕的耐藥性[12];通過(guò)下調(diào)Nrf2途徑逆轉(zhuǎn)人肺癌A549細(xì)胞的順鉑耐藥性[13]。這些研究結(jié)果表明,CPT不僅具有廣泛的抗腫瘤作用,在協(xié)同化療藥物抗腫瘤耐藥方面亦可能存在巨大潛力。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗炎、抗菌、抗真菌和降低膽固醇等多種生理活性,已被報(bào)道對(duì)纖維肉瘤和結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌具有抗癌作用。Bae等[14]在卵巢癌細(xì)胞研究中,β-谷甾醇主要對(duì)線粒體產(chǎn)生不利影響,通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體軸來(lái)增強(qiáng)ROS的產(chǎn)生和鈣的內(nèi)流,導(dǎo)致線粒體膜電位減少和線粒體功能障礙從而抑制腫瘤的發(fā)展。EMT與腫瘤發(fā)生、侵襲性、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性有關(guān),β-谷甾醇可通過(guò)下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標(biāo)志物Snail和vimentin的表達(dá),增加E-cadherin的表達(dá),從而減少胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[15]。此外,分子對(duì)接結(jié)果顯示多個(gè)化合物與潛在靶點(diǎn)顯示出良好的結(jié)合能力,進(jìn)一步驗(yàn)證了靶點(diǎn)與化合物相互作用研究的可靠性,這也為針對(duì)卵巢癌鉑耐藥的新藥研發(fā)提供了新的思路和研究方向。

本研究中,旨在挖掘出與逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥的中藥。如半枝蓮是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛使用的抗腫瘤中藥,對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用[16]。Xue等[17]評(píng)估了半枝蓮植物中分離得到27個(gè)新克羅烷型二萜類化合物對(duì)人乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用,發(fā)現(xiàn)其中四個(gè)化合物(11、14、16和18)比經(jīng)典的P-gp抑制劑維拉帕米具有更好的逆轉(zhuǎn)能力,可能是通過(guò)抑制P-糖蛋白表達(dá)克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性,這也是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的重要策略。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物流出也是腫瘤細(xì)胞中常見(jiàn)的耐藥機(jī)制之一。吳茱萸中提取的生物堿吳茱萸次堿能下調(diào)ABCB1的蛋白表達(dá)水平,增強(qiáng)ABCB1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株MCF-7/ADR及A549/Taxol對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,吳茱萸次堿是通過(guò)上調(diào)E3泛素連接酶MARCH8來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)MDR的逆轉(zhuǎn)[18]。另一成分吳茱萸堿可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來(lái)改善卵巢癌細(xì)胞的化療耐受性,降低A2780/PTXR細(xì)胞中多藥耐藥蛋白(MDR-1)的表達(dá)和功能,目前已證實(shí)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇治療的敏感性,且不引起細(xì)胞毒性,但在鉑類藥物中的增敏作用還需深入研究[19]。以上可推測(cè)本次研究可挖掘出可能逆轉(zhuǎn)或增敏鉑類藥物的中藥,可設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

綜上所述,我國(guó)中草藥在抗腫瘤及其耐藥性方面的研究顯示出廣闊的應(yīng)用前景和潛能,其抗腫瘤作用和逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步探討,以開(kāi)發(fā)更加高效、低毒、安全的抗腫瘤藥物,為開(kāi)發(fā)更加高效、低毒的抗腫瘤藥物提供了新的思路和方法。

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