結球甘藍CBF家族特征分析及低溫誘導基因BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3表達分析

張 偉, 余方偉, 李建斌, 于 利, 王神云

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

結球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitataL.),是十字花科蕓薹屬蔬菜,可形成葉球,含有豐富的維生素C和礦物質(zhì),營養(yǎng)極為豐富。甘藍常被烹食或者生食,是追求健康飲食人群喜愛的食物之一;由于其具有較強的適應性和抗逆性,全國各地均有種植,年種植面積約9×105hm2[1],是中國重要的保障供應蔬菜之一。

低溫是影響作物產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的一種非生物脅迫[2]。結球甘藍喜溫和冷涼氣候,種子發(fā)芽適宜溫度為20～25 ℃,結球期適宜溫度為15～20 ℃。結球甘藍的適應能力較強,但過低的溫度仍然會減緩其生長速度,降低營養(yǎng)品質(zhì);特別是在1～4 ℃低溫條件下,植株很容易通過春化作用發(fā)生“先期抽薹”[3];0 ℃以下的凍害溫度會導致幼苗或葉球凍傷或是直接凍死,嚴重影響產(chǎn)量[4-5]。結球甘藍植株不同生長時期的耐寒性也不同,具有6～8片葉的幼苗其耐寒性比較強,能忍耐-5～-2 ℃的低溫凍害;經(jīng)過低溫馴化的幼苗,能忍耐短期-12～-8 ℃的低溫嚴寒;成熟期的葉球耐寒性雖不如幼苗時期,但早熟品種的葉球能忍耐短期-5～-3 ℃的低溫,中、晚熟品種的葉球能忍耐短期-8～-5 ℃的低溫[6]。

低溫信號途徑是依賴于CBF(C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子的ICE1-CBF-COR信號轉(zhuǎn)導途徑。在低溫脅迫下,ICE1轉(zhuǎn)錄因子可直接與3個低溫響應基因(CBF1、CBF2、CBF3)基因啟動子區(qū)域結合[7],被激活的CBF轉(zhuǎn)錄因子與冷誘導基因(COR)啟動子區(qū)域CRT/DRE元件結合,誘導COR基因的轉(zhuǎn)錄,使其迅速響應低溫脅迫,從而提高植株的耐冷性[8]。AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因在擬南芥4號染色體上串聯(lián)排列,不依賴ABA信號轉(zhuǎn)導,受低溫脅迫誘導表達,在響應低溫脅迫的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9-10]。而AtCBF4與AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3成員的基因功能不同,依賴ABA信號轉(zhuǎn)導,不受低溫脅迫誘導表達,但在抗旱過程中發(fā)揮一定的作用[11]。有研究結果表明過量表達AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因能大幅提高擬南芥植株的抗凍性,其下游大量的COR基因被誘導表達[9-10]。與野生型擬南芥相比,cbf1/cbf2/cbf3 3突變體在冷馴化后表現(xiàn)出強烈的凍敏感表型,且AtCBF基因的突變影響了擬南芥全轉(zhuǎn)錄組中10%～20%的COR基因表達[12-13]。此外,在油菜、番茄、大麥、玉米及水稻等作物中也發(fā)現(xiàn)CBF基因具有冷誘導表達特征[14-18]。單子葉植物和雙子葉植物的CBF基因均與低溫脅迫響應密切相關,說明植物中CBF基因在低溫信號途徑中發(fā)揮的作用相對保守。

本研究為了探索與擬南芥同為十字花科的結球甘藍作物中CBF基因是否也存在冷誘導特性,對結球甘藍全基因組中CBF家族成員進行鑒定,并分析其編碼的蛋白特征、基因結構、系統(tǒng)發(fā)育、不同器官/組織表達量以及2 ℃低溫脅迫下的基因表達模式等,挑選出候選低溫誘導基因,為進一步開展BoCBF基因響應低溫脅迫的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 結球甘藍CBF家族成員鑒定

擬南芥AtCBF蛋白氨基酸序列(AtCBF1-AT4G25490、AtCBF2-AT4G25470、AtCBF3-AT4G25480、AtCBF4-AT5G51990)從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取。結球甘藍和大白菜全基因組序列分別參考結球甘藍923[19]和大白菜Chiifu-401-42 V3.0[20]基因組。將AtCBF蛋白氨基酸序列用BLASTP分別搜索結球甘藍和大白菜全基因組序列,獲取候選結球甘藍BoCBF和大白菜BrCBF蛋白氨基酸序列。利用Pfam 35.0和SMART數(shù)據(jù)庫分析候選BoCBF和BrCBF蛋白的保守結構域,剔除不含AP2(PF00847)結構域的候選蛋白質(zhì),確定BoCBF和BrCBF家族成員。

1.2 BoCBF蛋白理化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ProtParam工具分析BoCBF蛋白的理化特征,包括氨基酸序列長度、相對分子質(zhì)量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性等特征。采用MEGA v7.0.26軟件對BoCBF、BrCBF和AtCBF蛋白氨基酸序列進行聚類分析,選擇最大似然法(Bootstrap值設定為1 000)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 BoCBF基因結構、物理位置及亞細胞定位預測分析

在結球甘藍923全基因組數(shù)據(jù)庫中分別獲取BoCBF基因的gDNA和CDS序列,利用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制外顯子-內(nèi)含子結構圖。根據(jù)BoCBF基因的物理位置,使用MapChart v2.3軟件繪制BoCBF基因染色體位置圖。采用在線軟件BaCelLo和Plant-mPLoc[21-22]對BoCBF蛋白的亞細胞定位進行預測。

1.4 CBF基因進化約束值分析和基因組加倍事件發(fā)生時間估計

通過DnaSP v6軟件[23]計算結球甘藍和擬南芥CBF基因之間的進化約束值(非同義替換率Ka/同義替換率Ks)。非同義替換率計算公式為非同義替換的SNP數(shù)/非同義替換位點數(shù),同義替換率計算公式為同義替換的SNP數(shù)/同義替換位點數(shù)。利用同義替換率來估算結球甘藍和擬南芥之間全基因組加倍事件發(fā)生的時間。估算公式為加倍事件發(fā)生時間(T)=Ks/2λ[擬南芥每年每個同義替換位點發(fā)生替換的速率(λ)為1.5×10-8][24]。

1.5 不同器官/組織及低溫脅迫下BoCBF基因表達量分析

選取耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9為試驗材料,將其種子播種在32孔穴盤中,放進人工氣候室中正常管理,環(huán)境條件設置:白天溫度為25 ℃,光照時間14 h,夜晚溫度為18 ℃。待結球甘藍長至五葉一心,轉(zhuǎn)移至春化室進行2 ℃低溫脅迫,處理不同時間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)后進行取樣,將葉片放入錫箔紙并立即于液氮中冷凍,在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選擇低溫脅迫處理0 h、6 h、24 h的葉片樣品送廣州基奧迪生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。此外,從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載了結球甘藍02-12正常生長條件下7個不同器官/組織(芽、愈傷組織、花、葉、根、角果和莖)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42891,GSE42891數(shù)據(jù)集)用于BoCBF基因不同器官/組織的表達量分析。以結球甘藍923基因組作為轉(zhuǎn)錄組分析的參考基因組,以FPKM值來表示結球甘藍BoCBF基因在不同器官/組織及低溫脅迫下的表達量,利用Excel軟件計算平均值和標準差,繪制柱形圖。

1.6 BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因相對表達水平分析

將上述保存的低溫處理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h的葉片樣品分別提取植物總RNA,并合成第一鏈cDNA。參照結球甘藍923基因組[19]序列,利用Beacon Designer 7.7軟件分別設計BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3基因和內(nèi)參基因BoActin2的特異引物序列(表1)。利用SYBR Green染料法在羅氏熒光定量PCR儀器上進行PCR反應,試驗采取3次技術重復,通過2-△△Ct計算方法計算基因的相對表達水平和標準差[25]。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 結球甘藍CBF家族成員鑒定、理化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對結球甘藍和大白菜全基因組數(shù)據(jù)庫BLASTP搜索以及AP2保守結構域的在線驗證,分別鑒定到7個BoCBF蛋白和6個BrCBF蛋白(表2)。BoCBF蛋白的氨基酸序列長度為203～283 aa,相對分子質(zhì)量為2.25×104～3.11×104。BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2c、BoCBF3、BoCBF4a、BoCBF4b理論等電點為4.58～6.14,為弱酸性蛋白質(zhì);BoCBF2b理論等電點為7.63,為弱堿性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為45.78～68.32,均超過臨界值40。此外,BoCBF蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為56.78～73.20,總平均親水性指數(shù)為-0.598～-0.314,均為親水性蛋白質(zhì)。

表2 結球甘藍CBF家族成員理化特征

采用MEGA v7.0.26軟件對結球甘藍、大白菜和擬南芥17個CBF蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。CBF蛋白被分成2個亞組,亞組Ⅰ包含12個CBF蛋白,亞組Ⅱ包含5個CBF蛋白。其中亞組Ⅰ包括5個結球甘藍CBF蛋白(BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c和BoCBF3),4個大白菜CBF蛋白和3個擬南芥CBF蛋白。亞組Ⅱ包括2個結球甘藍CBF蛋白(BoCBF4a和BoCBF4b),2個大白菜CBF蛋白和1個擬南芥CBF蛋白。相比擬南芥CBF家族成員,結球甘藍和大白菜CBF家族成員之間的親緣關系更近。

圖1 結球甘藍、大白菜和擬南芥CBF蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 BoCBF基因結構、物理位置及其編碼蛋白質(zhì)的亞細胞定位預測分析

BoCBF2b基因包含3個外顯子和2個內(nèi)含子,BoCBF2c基因包含2個外顯子和1個內(nèi)含子,BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3、BoCBF4a和BoCBF4b均只有1個外顯子,沒有內(nèi)含子(圖2)。此外,本研究還分析了7個BoCBF基因在結球甘藍染色體上的物理位置分布,其中BoCBF2b和BoCBF2c串聯(lián)分布在3號染色體上,BoCBF2a位于7號染色體上,BoCBF1和BoCBF3串聯(lián)分布在8號染色體上,BoCBF4a和BoCBF4b串聯(lián)分布在9號染色體上(圖3)。

圖2 BoCBF基因外顯子-內(nèi)含子結構圖

圖3 BoCBF基因在染色體上的物理位置分布

為了預測BoCBF蛋白亞細胞定位信息,分別利用BaCelLo和Plant-mPLoc工具在線進行預測(表3)。結果表明,結球甘藍BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c、BoCBF3和BoCBF4a蛋白均被預測定位于細胞核中,BoCBF4b被預測可能定位在細胞質(zhì)或細胞核中。

表3 BoCBF蛋白亞細胞定位預測

2.3 CBF基因進化約束值分析和基因組加倍事件發(fā)生時間估計

除AtCBF4與BoCBF4b同源基因?qū)ν?其余6個CBF直系同源基因?qū)Φ倪M化約束值(Ka/Ks)均遠小于1(0.156～0.294),表明進化中CBF基因以純化選擇作用為主(表4)。在結球甘藍和擬南芥的直系同源基因?qū)χ?同義替換率為0.490～0.815。以擬南芥每年每個同義替換位點發(fā)生替換的速率(λ)為參考,利用結球甘藍和擬南芥的直系同源基因?qū)Φ耐x替換率(Ks)估算,結球甘藍和擬南芥之間全基因組加倍事件發(fā)生的時間大致發(fā)生在1.63×107～2.72×107年前。由表4可知,相比同源基因AtCBF2,BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c基因可能發(fā)生了全基因組三倍化事件(WGT),且它們的發(fā)生時間為1.63×107～1.97×107年前,這與蕓薹族物種與擬南芥進行分化后經(jīng)歷了一次額外的全基因組三倍化事件的時間(1.30×107～1.70×107年前)相符合[26]。

表4 結球甘藍和擬南芥CBF基因進化約束值及基因組加倍事件發(fā)生時間預測

2.4 結球甘藍不同器官/組織及低溫脅迫下BoCBF基因表達量分析

本研究分析了5個BoCBF基因在結球甘藍7個不同器官/組織中的表達量(圖4)。其中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在甘藍多個器官/組織中基本不表達(FPKM<1),僅在愈傷組織、根和莖中有較低的表達量。BoCBF4a基因僅在愈傷組織、根和莖中有中等表達量,BoCBF4b基因在莖中表達量中等,在根中表達量較高。

圖4 轉(zhuǎn)錄組測序分析結球甘藍02-12不同器官/組織中BoCBF基因表達量

本研究還分析了5個BoCBF基因在低溫脅迫下的表達模式(圖5),耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2b和BoCBF2c基因的表達量均為0。在未進行低溫處理時(0 h),BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中的表達量幾乎為0,BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量較低。低溫脅迫處理0～6 h,BoCBF1和BoCBF2a基因迅速響應,表達量上升,其中不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2a基因表達量急劇升高;低溫脅迫6 h后至24 h,耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1和BoCBF2a基因的表達量急劇下降。此外,低溫脅迫0～24 h,耐寒結球甘藍923中BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量基本沒有變化,說明BoCBF4a和BoCBF4b基因不受低溫誘導表達。不耐寒結球甘藍D9中BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量在低溫脅迫0～6 h下降,在低溫脅迫6 h后至24 h表達量急劇上升。

根據(jù)前期擬南芥響應低溫信號途徑的研究結果[27],可知擬南芥中響應低溫脅迫的AtCBF基因家族成員主要為AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3,且基因快速響應的時間為低溫脅迫0～3 h。結合圖5的分析結果,本研究選取BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因,通過實時熒光定量PCR分析兩個不同耐寒性結球甘藍品種在低溫脅迫0 h、3 h、6 h、12 h和24 h后這3個基因的相對表達量。如圖6所示,不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因的相對表達量在低溫脅迫3 h達到最大值;耐寒結球甘藍923中BoCBF2a和BoCBF3基因的相對表達量在低溫脅迫3 h達到最大值,BoCBF1基因相對表達量在低溫脅迫6 h達到最大。BoCBF1、BoCBF2和BoCBF3基因的相對表達量達到峰值后急劇下降,在24 h降至最低。

圖5 轉(zhuǎn)錄組測序分析BoCBF基因在2 ℃低溫脅迫下的表達量

圖6 實時熒光定量PCR分析2 ℃低溫脅迫下BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因相對表達水平

3 討 論

低溫對結球甘藍栽培有較大影響,產(chǎn)量及品質(zhì)均受到嚴重影響。依賴于CBF(C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子的ICE1-CBF-COR信號轉(zhuǎn)導途徑是植物響應低溫脅迫信號的重要途徑之一[7-8]。此外,擬南芥、大麥、玉米、水稻、小麥、葡萄和番茄等作物CBF基因的功能已經(jīng)被廣泛研究[10,16-18,28-30]。本研究探究了與擬南芥同屬十字花科的結球甘藍BoCBF基因的低溫誘導特性,對進一步解析BoCBF基因響應低溫脅迫具有重要的意義。

AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因串聯(lián)排列在擬南芥4號染色體上。在結球甘藍中,僅BoCBF1和BoCBF3串聯(lián)排列在8號染色體上,BoCBF2a位于7號染色體,BoCBF2b和BoCBF2c串聯(lián)分布在3號染色體上。推測結球甘藍中與擬南芥AtCBF2同源的BoCBF2基因發(fā)生了基因復制或丟失現(xiàn)象,導致加倍后的BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c基因與BoCBF1和BoCBF3不在同一條染色體上。此外,研究發(fā)現(xiàn)除BoCBF2b和BoCBF2c含有內(nèi)含子序列外,其他BoCBF基因與擬南芥AtCBF基因結構一致,均無內(nèi)含子結構,表明CBF基因在植物進化過程中具有較高的保守性。與BoCBF2a基因結構相比,發(fā)生全基因組三倍化事件后形成的BoCBF2b和BoCBF2c基因結構在進化過程中發(fā)生了變異,出現(xiàn)了較長的內(nèi)含子序列,導致其基因功能也隨之發(fā)生了變化。

擬南芥中AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因不依賴ABA信號轉(zhuǎn)導,受低溫脅迫誘導表達,是低溫誘導的關鍵基因[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)結球甘藍923和D9中BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3、BoCBF4a和BoCBF4b基因受低溫脅迫誘導表達,而結球甘藍923和D9中BoCBF2b、BoCBF2c被發(fā)現(xiàn)不受低溫脅迫誘導表達。其中,結球甘藍D9中BoCBF4a和BoCBF4b基因在低溫處理6 h后至24 h時表達量上升,可能是由于受到節(jié)律調(diào)節(jié)或者光調(diào)控的影響。結合轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2a基因響應低溫脅迫誘導最為迅速,其次是BoCBF1和BoCBF3。本研究還發(fā)現(xiàn)在耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因受低溫脅迫誘導后基因相對表達量變化趨勢均為先上升后下降,僅表達水平出現(xiàn)高低的差異。綜上所述,本研究結果為后續(xù)開展BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因調(diào)控結球甘藍響應低溫脅迫機理研究奠定了基礎。