綠色草莓再生體系的建立

潘嬌艷, 肖世偉, 夏 瑾, 倪知游, 鄒雨婷, 喬玉山,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

建立高效的離體再生體系是構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ),也是開展植物基因工程研究必要的前提條件之一,對于進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因、基因編輯等技術(shù)研究草莓基因功能、品種改良及種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。不同草莓品種的再生效率及遺傳轉(zhuǎn)化效率存在較大差異,一些栽培草莓(Fragaria×ananassaDuch.)品種的再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立,如全明星[1]、早紅[2]、晶瑤[3]、紅顏[4]等。野生草莓擁有風(fēng)味獨特、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀,是改良栽培品種的潛在資源[5]。國外已經(jīng)建立了部分森林草莓(F.vesca)高效、穩(wěn)定的再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系[6-9];國內(nèi)也建立Hawaii 4[10]、Ruegen[11]、Yellow Wonder[12]等森林草莓的再生體系,但這些株系的遺傳轉(zhuǎn)化體系還需要進(jìn)一步研究。黃毛草莓(F.nilgerrensisSchltdl. ex J.Gay)莖尖培養(yǎng)體系、組培苗快繁體系、葉片離體再生體系也先后建立起來[5,13]。綠色草莓(FragariaviridisWeston)屬于二倍體野生草莓,具有抗逆性強(qiáng)、果實硬度高等優(yōu)良性狀,同時具有基因組小等優(yōu)點,在栽培草莓品種改良上具有利用價值[14],但關(guān)于其再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究還比較少。本研究擬以田間自然生長的綠色草莓匍匐莖為外植體,從初代培養(yǎng)開始逐步研究綠色草莓的再生體系,以期為其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用綠色草莓的株系為GE-39。2021年4-6月采集田間幼嫩匍匐莖進(jìn)行初代培養(yǎng),進(jìn)而獲得試管苗,其他培養(yǎng)材料為試管苗的幼葉及由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織。

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或1/2 MS培養(yǎng)基,均附加3.0%蔗糖和0.7%瓊脂,121 ℃/116 ℃滅菌20 min/30 min。高溫滅菌前,將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.8～5.9。培養(yǎng)室溫度為(25±1) ℃,光照周期為16 h/8 h,光照度為2 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 試管苗的建立 將田間取回的匍匐莖用流水沖洗3～5 h,在超凈工作臺將匍匐莖保留3～5 cm的莖尖用70%的乙醇消毒30～40 s,消毒結(jié)束時用無菌水沖洗3～4次,再用10%的次氯酸鈉消毒10 min,用無菌水再次沖洗3～4次,用滅菌濾紙吸干莖尖表面水分,切除莖尖下端少許,然后接種到MS、MS+0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L赤霉素(GA3)初代培養(yǎng)基中,每瓶接種1個莖尖,觀察并記錄莖尖的生長狀況,30 d后統(tǒng)計成活率。

1.2.2 試管苗的增殖 莖尖在初代培養(yǎng)基中成活后獲得試管苗,將長勢相近的試管苗接種至不同增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,植物生長調(diào)節(jié)劑組合為:6-BA與吲哚丁酸(IBA)、6-BA與GA3、6-BA與吲哚乙酸(IAA)。6-BA質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L,IBA、GA3、IAA的質(zhì)量濃度梯度均設(shè)置為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L。每個培養(yǎng)基接種3株試管苗,觀察并記錄植株的生長狀況,培養(yǎng)28 d后對比不同處理對綠色草莓增殖系數(shù)(增殖系數(shù)=再生芽總數(shù)/接種芽數(shù))的影響。

1.2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對葉盤脫分化的影響 選取葉齡為30 d的健康試管苗葉片,剪去葉片四周少許,再沿垂直于葉片中脈方向橫切,形成近似方形且大小相近的葉盤。將葉盤背面朝下平鋪于葉盤脫分化培養(yǎng)基中,均勻擺放。葉盤脫分化培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,并設(shè)置不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合(表1)。每個培養(yǎng)基放置8～15個葉盤,暗培養(yǎng)7 d后分為兩部分,一部分繼續(xù)放在黑暗環(huán)境中培養(yǎng),另一部分置于光下培養(yǎng)。每天觀察并記錄葉盤的生長狀況、愈傷組織的發(fā)生情況,每隔14 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)30 d后計算出愈率(出愈率=長出愈傷組織的葉盤數(shù)/接種的葉盤總數(shù)×100%)。

表1 葉盤脫分化培養(yǎng)基

1.2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織再分化的影響 本研究發(fā)現(xiàn)葉盤在適宜脫分化培養(yǎng)基中產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)相同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后,漸漸出現(xiàn)褐化甚至死亡的現(xiàn)象,不產(chǎn)生不定芽,因此需探索適宜的愈傷組織再分化培養(yǎng)基。將愈傷組織接種至不同的愈傷組織再分化培養(yǎng)基(表2)中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2 MS,每個培養(yǎng)基放置4～6個愈傷組織。在培養(yǎng)過程中統(tǒng)計愈傷組織再分化率(再分化率=可再分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%)及平均分化芽數(shù)(平均分化芽數(shù)=不定芽總數(shù)/可再分化的愈傷組織數(shù)),并記錄再生不定芽的生長狀態(tài)。

表2 愈傷組織再分化培養(yǎng)基

1.2.5 試管苗生根誘導(dǎo)及煉苗移栽 選擇生長狀況良好且長勢相近的試管苗接種至不同的生根培養(yǎng)基中,生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,植物生長調(diào)節(jié)劑為IAA、IBA、IBA+IAA。IAA、IBA的質(zhì)量濃度均設(shè)置為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L,每個培養(yǎng)基接種3株試管苗,培養(yǎng)30 d后記錄試管苗根系的生長狀況、苗的長勢并統(tǒng)計生根率。

將試管苗或再生的芽接種到最佳生根培養(yǎng)基中,經(jīng)過30 d的生根培養(yǎng)后,對根系健壯的試管苗開蓋放置3～5 d,煉苗期間注意觀察試管苗的生長狀況,及時向葉面噴水補(bǔ)充水分。煉苗結(jié)束后洗凈幼苗根部培養(yǎng)基,并用多菌靈水溶液浸泡根系10 s。將草莓苗移栽至經(jīng)高溫消毒的基質(zhì)中,基質(zhì)成分包含營養(yǎng)土、蛭石與珍珠巖,其體積比為9∶3∶1,在室溫條件下緩苗2～3 d后轉(zhuǎn)移至適宜環(huán)境中,30 d后統(tǒng)計成活率,成活率=成活植株數(shù)/總移栽植株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色草莓試管苗的建立

試管苗的建立是綠色草莓再生體系建立的首要步驟,本研究對綠色草莓初代培養(yǎng)的研究結(jié)果表明,在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中莖尖的成活率相對較低,為13.3%,長勢較弱且褐化相對嚴(yán)重;而接種在MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養(yǎng)基中的莖尖生長發(fā)育較為健康且能保持較為活躍的生命力,褐化現(xiàn)象較少。其中,在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養(yǎng)基中,莖尖的生長狀況最為活躍,成活率最高,為46.6%,且有少量側(cè)芽萌發(fā)(圖1),而在MS+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中莖尖的成活率僅為26.6%,因而添加GA3的培養(yǎng)基更適用于綠色草莓的初代培養(yǎng)。綠色草莓的初代建立需要經(jīng)過一系列的消毒步驟,莖尖的生活力受到影響,因此與增殖培養(yǎng)相比,初代建立所需要的時間更長。

A:綠色草莓莖尖在MS+0.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.2 mg/L赤霉素(GA3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 d時的生長狀況;B:綠色草莓莖尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d時的生長狀況。

2.2 不同培養(yǎng)基對試管苗增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對綠色草莓的增殖效果不同,但綠色草莓增殖系數(shù)的高低主要由6-BA決定。在含有0.2 mg/L IAA的增殖培養(yǎng)基中,綠色草莓的增殖系數(shù)隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高而提高;但是當(dāng)綠色草莓的增殖系數(shù)過高時,幼苗在有限的空間內(nèi)相互擠壓,植株的生長勢變?nèi)?表現(xiàn)出根系短小、莖葉細(xì)弱、略有黃化的現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中包含0.1 mg/L的6-BA時,添加0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L的IBA或IAA,均可獲得明顯的增殖效果,且植株形態(tài)正常,生長狀況良好;而添加0.3 mg/L的GA3時,增殖效果一般,但植株更健壯,葉片肥大鮮綠(圖2A)。綜合分析,當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IBA時,綠色草莓的增殖效果最好,增殖系數(shù)為6.4,所誘導(dǎo)產(chǎn)生的草莓苗不但健壯而且葉片鮮綠(圖2B)。

A:綠色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.3 mg/L赤霉素(GA3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d時的生長狀況;B:綠色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L吲哚丁酸(IBA)培養(yǎng)基中28 d時的生長狀況。

2.3 不同培養(yǎng)基對誘導(dǎo)葉盤脫分化的影響

使用不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉盤脫分化的研究結(jié)果表明,葉盤在MS+2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)+噻苯隆(TDZ,1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)培養(yǎng)基中連續(xù)暗培養(yǎng)24 d時多在周圍刻傷處形成白色的愈傷組織,質(zhì)地較軟,在這些培養(yǎng)基中葉盤出愈率均為100%。將白色愈傷組織轉(zhuǎn)移到光照下繼續(xù)培養(yǎng),其顏色逐漸變?yōu)槟埸S色,愈傷組織快速增殖且質(zhì)地緊密,但無不定芽分化現(xiàn)象(圖3)。葉盤在相同培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)23 d,其脫分化效果不明顯。葉盤在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基中連續(xù)暗培養(yǎng)30 d后,出愈率也為100%,但葉盤產(chǎn)生的愈傷組織面積不大,多呈黃白色或黃褐色,長勢較差,在相同的培養(yǎng)基連續(xù)繼代培養(yǎng)后,愈傷組織硬化、不具有生命活力。在TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+NAA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、1.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA、1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基中,無論是連續(xù)暗培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng),葉盤生長狀況都較差,隨著誘導(dǎo)時間的延長,葉盤褐化率逐漸升高,培養(yǎng)30 d時葉盤大部分或全部褐化,不產(chǎn)生愈傷組織,出愈率為0。綜合分析,最適宜誘導(dǎo)葉盤脫分化的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ,在該培養(yǎng)基中出愈率高,且愈傷組織生命力旺盛,在適宜的愈傷組織再分化培養(yǎng)基中產(chǎn)生不定芽的效果最好。

2.4 不同培養(yǎng)基對愈傷組織再分化的影響

愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽的數(shù)量和質(zhì)量因再分化培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑組合的不同而不同。表3、圖4顯示,在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培養(yǎng)基中,愈傷組織的再分化率都高于80.0%,平均分化芽數(shù)也較多,但分化而來的芽基本表現(xiàn)出質(zhì)地較脆、葉片細(xì)小、生長緩慢的玻璃化特征,不能正常生長,難以進(jìn)行下一步的生根培養(yǎng)。在含有TDZ+2,4-D、6-BA+2,4-D的培養(yǎng)基中,愈傷組織在連續(xù)培養(yǎng)50 d時,基本都褐化,不分化不定芽。在含有1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基中,愈傷組織在連續(xù)繼代后仍然保持愈傷狀態(tài),顏色為嫩黃色,質(zhì)地較為疏松,不分化不定芽。愈傷組織在1/2 MS+6-BA+IBA培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～25 d后,細(xì)胞變得更為緊密并產(chǎn)生綠色突起,30～40 d后形成不定芽,并產(chǎn)生根系。在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基中,愈傷組織再分化率最高,為91.0%,愈傷組織產(chǎn)生的不定芽形態(tài)健康、生長活躍且數(shù)量最多,因此選用該培養(yǎng)基作為綠色草莓愈傷組織再分化培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基對綠色草莓愈傷組織再分化的影響

A:愈傷組織接種在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基20 d的生長狀況;B:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基50 d的生長狀況;C:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基50 d的生長狀況;D:愈傷組織接種在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基50 d的生長狀況;E:愈傷組織接種在1/2 MS+2.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基50 d的生長狀況;F:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基50 d的生長狀況;G:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基50 d的生長狀況。TDZ:噻苯隆;2,4-D:2,4-二氯苯氧乙酸;IBA:吲哚丁酸;6-BA:6-芐氨基嘌呤;NAA:萘乙酸。

2.5 生根培養(yǎng)和煉苗移栽

綠色草莓生根培養(yǎng)結(jié)果(圖5)表明,不同培養(yǎng)基對試管苗生根率的影響無明顯差異,生根率均為100%,但對試管苗生根量和生根長度的影響是不同的。適宜質(zhì)量濃度的IBA能提高生根量,在IBA的質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg/L時,隨著IBA質(zhì)量濃度的增加,根的數(shù)量和長度也增加。在添加0.2 mg/L IBA的基礎(chǔ)上再添加0.1 mg/L IAA的培養(yǎng)基中,試管苗的根系比在僅含0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基中的根系更為粗壯。但是,隨著IAA、IBA質(zhì)量濃度增加為0.3 mg/L、0.4 mg/L時,試管苗生根長度及生根量呈下降趨勢,植株的長勢也變?nèi)酢＞C合分析,1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基最有利于綠色草莓生根培養(yǎng),在此培養(yǎng)基中,試管苗根系密集,主根和側(cè)根生長勢均衡,植株莖、葉健壯,整體長勢較為旺盛。

從左到右所用培養(yǎng)基依次為1/2 MS+0.1 mg/L IBA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA、1/2 MS+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA。IBA:吲哚丁酸;IAA:吲哚乙酸。

對根系健壯、長勢良好的綠色草莓試管苗進(jìn)行煉苗,7 d后移栽于經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)中,在溫室培養(yǎng)30 d后,植株的成活率達(dá)到93.7%,并有匍匐莖萌發(fā)現(xiàn)象(圖6)。

圖6 煉苗與移栽

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)基對綠色草莓初代培養(yǎng)與離體增殖的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的細(xì)胞分裂素或生長素有利于初代試管苗的建立。韓如春等[15]發(fā)現(xiàn),紅顏草莓的莖尖在添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基中能獲得較高的成活率和誘芽率。6-BA與NAA或IBA或IAA組合使用都對紅顏草莓再生不定芽有促進(jìn)作用,其中6-BA與NAA搭配效果最好[16]。本研究發(fā)現(xiàn),相較于MS、MS+0.5 mg/L 6-BA,莖尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養(yǎng)基中的成活率更高,且成活的莖尖長勢更好,因而該培養(yǎng)基更適用于綠色草莓初代培養(yǎng)。

不同草莓品種增殖培養(yǎng)階段使用的最適植物生長調(diào)節(jié)劑類型和比例存在差異。6-BA在減弱根尖優(yōu)勢、刺激新芽萌發(fā)方面比其他植物生長調(diào)節(jié)劑的效果更好[17]。肖君澤等[18]發(fā)現(xiàn),章姬草莓的增殖系數(shù)隨著培養(yǎng)基中添加6-BA質(zhì)量濃度的增加而增加。白雪公主、紅顏草莓的最佳增殖培養(yǎng)基均使用6-BA[19-20]。本研究也同樣發(fā)現(xiàn),綠色草莓增殖系數(shù)主要受6-BA質(zhì)量濃度影響,但隨著增殖系數(shù)的不斷提高,會出現(xiàn)幼苗生長勢變?nèi)?、葉片黃化的現(xiàn)象。6-BA與IAA或IBA或GA3配合使用能緩和單獨使用6-BA對綠色草莓過度增殖產(chǎn)生植株長勢變?nèi)醯臉O端影響;當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA和IBA的質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L時,綠色草莓的增殖效果最好,增殖系數(shù)為6.4,所誘導(dǎo)產(chǎn)生的草莓苗不但健壯,而且葉片鮮綠。

3.2 不同培養(yǎng)條件對綠色草莓葉盤脫分化的影響

以草莓不同部位為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的研究已有報道,在不同的外植體中,葉盤的再生率最高[21]。由于葉片來源廣泛、易于處理,草莓葉片已成為離體再生的最佳材料。以葉盤為再生外植體時,其放置方式對不定芽再生率和不定芽質(zhì)量有一定影響,研究發(fā)現(xiàn),Redcoat[22]、紅頰[23]等多個草莓品種葉盤背面接觸培養(yǎng)基時的再生率更高。但也有研究發(fā)現(xiàn),葉盤背面接觸培養(yǎng)基時產(chǎn)生的再生芽不如其他放置方式產(chǎn)生的再生芽健壯,葉盤放置方式對再生效果的影響還有待進(jìn)一步研究[24]。目前常用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2 MS、改良MS等,MS基本培養(yǎng)基中各元素的比例合適,緩沖性強(qiáng),具有高效的不定芽誘導(dǎo)性,可用于多種植物的各類組織培養(yǎng)[25-26]。草莓離體再生培養(yǎng)前期需要暗培養(yǎng),直接進(jìn)行光照或在不適宜光強(qiáng)下培養(yǎng)可能導(dǎo)致無愈傷組織形成[27]。本研究以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,對綠色草莓葉齡為30 d的葉盤進(jìn)行脫分化處理,采用葉盤背面接觸培養(yǎng)基的方式進(jìn)行培養(yǎng),在連續(xù)暗培養(yǎng)24 d后葉盤傷口處產(chǎn)生白色愈傷組織。

控制植物生長調(diào)節(jié)劑的使用可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化方向,一般來說,細(xì)胞分裂素與生長素的比值高有利于誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生,細(xì)胞分裂素與生長素的比值低則有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和根的形成[28-31]。TDZ對愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽再生有不同程度的影響,可以促進(jìn)一些很難發(fā)生器官再生的木本植物的體外再生,如蘋果、梨[32-34]。有研究結(jié)果表明,TDZ的使用對草莓試管苗再生的效果顯著[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn),TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)與IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)組合使用時,出愈率為0。在培養(yǎng)基中添加2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0mg/L)和TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)時都能使葉盤產(chǎn)生愈傷組織,出愈率都高達(dá)100%,其中在MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ培養(yǎng)基中產(chǎn)生的愈傷組織在適宜再分化培養(yǎng)基中的再分化效果最好。

3.3 不同培養(yǎng)基對綠色草莓愈傷組織再分化的影響

草莓再生不定芽誘導(dǎo)階段常用的細(xì)胞分裂素是6-BA和TDZ[37]。張志宏等[38]認(rèn)為TDZ誘導(dǎo)Tudla草莓再生的效果優(yōu)于6-BA。據(jù)報道,在草莓組織培養(yǎng)中單獨使用TDZ或與2,4-D、IBA聯(lián)合使用能有效誘導(dǎo)不定芽再生[5,39-40]。也有研究發(fā)現(xiàn),愈傷組織在6-BA+IBA培養(yǎng)基中的再分化率比在其他激素組合的培養(yǎng)基中的再分化率更高[41]。本研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織在含有TDZ+2,4-D的培養(yǎng)基中不能進(jìn)一步分化;在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培養(yǎng)基中,愈傷組織再分化產(chǎn)生的不定芽玻璃化嚴(yán)重,難以進(jìn)行生根誘導(dǎo),不能達(dá)到理想的再生效果;在1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基中,愈傷組織在連續(xù)繼代培養(yǎng)后始終保持疏松的愈傷組織狀態(tài);6-BA與IBA組合能有效促使綠色草莓愈傷組織分化出不定芽,其中最適組合為1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,在該培養(yǎng)基中愈傷組織再分化率為91.0%,平均分化芽數(shù)為46.2個,再生芽比較健壯。

3.4 不同培養(yǎng)基對綠色草莓生根的影響

植物生根培養(yǎng)一般采用MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基,同時添加或不添加低質(zhì)量濃度的生長素,如IAA、IBA等。在草莓生根培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度的生長素測試中,單獨添加IBA、IAA、NAA均可進(jìn)行生根誘導(dǎo)[42-45]。紅顏草莓最佳生根培養(yǎng)基為添加IBA的1/2 MS培養(yǎng)基[20]。梁貴秋等[46]發(fā)現(xiàn),IBA、IAA分別有利于草莓組培苗側(cè)根、主根的生長,同時使用IBA和IAA可以取得良好的不定根誘導(dǎo)效果。本研究發(fā)現(xiàn)適宜質(zhì)量濃度的IBA、IAA均能誘導(dǎo)再生芽生根,但生長素質(zhì)量濃度過高時根的生長勢失衡表現(xiàn)為短而粗或細(xì)而長。在IBA與IAA組合使用的培養(yǎng)基中,綠色草莓的根系更為密集,生根形態(tài)更自然、更正常,莖、葉長勢旺盛,有利于馴化移栽或開展其他與根系相關(guān)的試驗。綜合分析,綠色草莓在1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基中的生根效果最好。