果樹(shù)分子標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展

孫雨桐, 劉德帥, 馮 美, 齊 迅, 姚文孔

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/林木資源高效生產(chǎn)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川 750021)

果樹(shù)育種的常規(guī)手段主要有雜交育種、誘變育種、倍性育種等,但由于果樹(shù)雜種比較多、品種來(lái)源復(fù)雜、多為多年生木本植物、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等因素,導(dǎo)致傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)、效率低、不確定因素多。相比于常規(guī)育種,分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular marker assisted selection,MAS)可以提高育種效率,縮短育種周期,并且在遺傳多樣性、品種鑒定等方面也有較好的效果[1]。分子標(biāo)記技術(shù)種類(lèi)繁多,如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)等,這些分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于果樹(shù)的遺傳育種、親緣關(guān)系判斷、遺傳圖譜構(gòu)建以及數(shù)量性狀座位(QTL)定位等研究中。這將加速果樹(shù)品種的改良進(jìn)程,提高育種效率。

1 果樹(shù)上應(yīng)用分子標(biāo)記的主要類(lèi)型

1.1 RAPD分子標(biāo)記

為適應(yīng)不良環(huán)境以及抵御病蟲(chóng)危害,培育具有一定抗性的果樹(shù)品種至關(guān)重要。Tartarini[2]從5種不同的RAPD標(biāo)記中篩選出與MdVf基因緊密相關(guān)的OPAM192200和OPAL07580,標(biāo)記了蘋(píng)果(Malusdomestica)抗赤霉病Vf基因。楊亞州等[3]以燕山葡萄和河岸葡萄的F1代為材料,通過(guò)7個(gè)RAPD標(biāo)記對(duì)其抗旱性進(jìn)行研究,將RAPD標(biāo)記5226-1100轉(zhuǎn)化成專(zhuān)一性的SCAR(Sequence characterized amplified regions,特定序列擴(kuò)增)標(biāo)記DR-760。其次RAPD分子標(biāo)記多用于果樹(shù)遺傳多樣性及品種鑒定,余智城等[4]對(duì)16份柑橘包括11份琯溪蜜柚進(jìn)行遺傳多樣性分析,通過(guò)15條RAPD引物將16份材料分為2大類(lèi)(表1)。

表1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

1.2 AFLP分子標(biāo)記

分析果樹(shù)遺傳多樣性,有助于果樹(shù)的分類(lèi)。董美超等[9]針對(duì)90份鱷梨品種材料從24對(duì)AFLP引物中篩選出8對(duì)進(jìn)行遺傳多樣性分析,根據(jù)遺傳相似系數(shù)可劃分為4個(gè)類(lèi)群。Lai等[10]采用AFLP和甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)的分子標(biāo)記技術(shù)探究車(chē)道晚臍橙與芽變南瓜狀臍橙之間的基因和基因組甲基化差異,結(jié)果表明芽變南瓜狀臍橙的出現(xiàn)是由于基因突變?？梢?jiàn)AFLP結(jié)合MSAP分子標(biāo)記技術(shù)可以研究橙的早熟及果實(shí)形狀的基因突變,這為此方面其他果樹(shù)的研究提供了理論及技術(shù)的支持(表2)。

表2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

1.3 SSR分子標(biāo)記

SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是大量標(biāo)記及其共顯性遺傳,也正因如此SSR分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用在果樹(shù)育種中。王立新等[15]從144對(duì)SSR引物中篩選出3對(duì)引物對(duì)40份蘋(píng)果進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,這3對(duì)引物可以鑒定區(qū)分40份蘋(píng)果。Kimura等[16]用9個(gè)SSR標(biāo)記鑒別60個(gè)亞洲梨品種,研究結(jié)果表明其中7個(gè)SSR標(biāo)記能將58個(gè)品種區(qū)分開(kāi)。劉國(guó)彬等[17]以19種歐李種質(zhì)及其近緣種杏李、李資源為試驗(yàn)材料,利用SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定并構(gòu)建分子身份證。魏姍姍等[18]以95份桃品種為試材,利用18對(duì)SSR引物對(duì)桃進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)了桃品種的8個(gè)連鎖群。胡光明等[19]以紅陽(yáng)獼猴桃為材料,從435對(duì)SSR引物中篩選出67對(duì)引物,用于獼猴桃屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析。Mahjbi等[20]以20個(gè)突尼斯柑橘品種為材料,通過(guò)7個(gè)SSR位點(diǎn)建立了它們的親緣關(guān)系來(lái)探究其遺傳多樣性。此外SSR分子標(biāo)記也被用于果樹(shù)品質(zhì)育種、抗性育種以及遺傳圖譜構(gòu)建(表3)。

表3 簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

1.4 SRAP分子標(biāo)記

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)標(biāo)記與RAPD標(biāo)記的原理和步驟極為相似,但SRAP相對(duì)于RAPD,穩(wěn)定性高,重復(fù)性好,多態(tài)性較高。董星光[27]以黃冠和鴨梨為試材,用SRAP和AFLP標(biāo)記對(duì)其抗病基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與抗黑星病相關(guān)的1條SRAP標(biāo)記和1條AFLP標(biāo)記,可見(jiàn)SRAP與AFLP可聯(lián)合用于梨的抗病品種的選育。馮濤等[28]以小白桃、津柳早紅為試材,用12條SRAP引物對(duì)其早熟基因進(jìn)行分析,結(jié)果表明SRAP標(biāo)記可以用于鑒定桃成熟期芽變(表4)。

表4 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

1.5 SCAR分子標(biāo)記

測(cè)序的擴(kuò)增區(qū)段(Sequence characterized amplified region, SCAR)標(biāo)記最初是從RAPD分子標(biāo)記技術(shù)衍生而來(lái)的,并且重復(fù)性和特異性比RAPD更好。為減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人體的危害,選育抗病品種具有重要意義,SCAR分子標(biāo)記在果樹(shù)抗病育種方面發(fā)揮著重要的作用。祁楠等[33]以秦冠和富士F1代群體為試材,將蘋(píng)果抗斑點(diǎn)落葉病相關(guān)基因的1個(gè)RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記(表5)。Deng等[34]以柑橘為材料克隆并測(cè)序了20個(gè)與抗柑橘三葉草病毒基因連鎖的RAPD片段中的7個(gè),并將它們轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。趙偉[35]以用8種葡萄作為親本的雜交后代為材料,用SCAR標(biāo)記SCO11-914對(duì)其白粉病抗性進(jìn)行檢測(cè)。

表5 測(cè)序的擴(kuò)增區(qū)段(SCAR)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

1.6 SNP分子標(biāo)記

SNP檢測(cè)方法主要有酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、直接測(cè)序和基因芯片等。Baldi等[38]通過(guò)2個(gè)蘋(píng)果品種Fiesta和Discovery之間雜交的分離群體開(kāi)發(fā)CAPS和SSCP標(biāo)記,標(biāo)記其抗性基因的定位,實(shí)現(xiàn)了克隆序列的遺傳作圖。SNP多用于遺傳圖譜的構(gòu)建。Antanaviciute等[39]使用來(lái)自28種海棠基因型的SNP數(shù)據(jù)為海棠開(kāi)發(fā)了全基因組基因分型陣列。該陣列為任何給定的海棠后代提供了高通量基因分型和連鎖圖譜開(kāi)發(fā)的前景。將2 272個(gè)SNP標(biāo)記的數(shù)據(jù)整合到M432子代的圖譜中,并展示了最完整和最飽和的普米拉分枝桿菌17個(gè)連鎖群的圖譜。唐海霞等[40]以冬棗和金絲4號(hào)的F1代103株群體為材料,用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(GBS)開(kāi)發(fā)的SNP構(gòu)建了1張包含12條連鎖群的遺傳圖譜。相關(guān)研究(表6)為果樹(shù)數(shù)量性狀定位、功能基因挖掘以及圖位克隆等研究提供了有效的理論依據(jù)。

表6 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記在果樹(shù)上的應(yīng)用

2 果樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建概況

分子標(biāo)記已被廣泛用于構(gòu)建遺傳圖譜,遺傳圖譜是基于遺傳距離的圖譜,它反映的是不同基因座之間的遺傳距離和連鎖程度。目前,大量分子標(biāo)記如SNP、SCAR、SSR、AFLP、SRAP等被用于果樹(shù)遺傳作圖。Wu等[44]以八月紅和碭山酥梨雜交的102個(gè)梨F1代單株為作圖群體,用SNP與SSR整合構(gòu)建了梨的高密度連鎖圖譜,該圖譜是用快速和穩(wěn)健的限制性相關(guān)DNA測(cè)序技術(shù)(RADseq)繪制的。連鎖圖譜由SNP標(biāo)記和SSR標(biāo)記組成,共3 241個(gè)標(biāo)記,跨度為2 243.4 cM,平均標(biāo)記距離為0.70 cM。劉更森[45]以富士和金冠雜交的F1代122個(gè)單株為作圖群體,選用已開(kāi)發(fā)的SNP,結(jié)合SSR標(biāo)記構(gòu)建了蘋(píng)果遺傳圖譜。以杧果金黃和貴妃雜交的98株F1代植物為作圖群體,用SRAP、AFLP和ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行作圖,該圖譜由33個(gè)連鎖群組成,總遺傳距離為1 561.1 cM[46]。已構(gòu)建遺傳圖譜的果樹(shù)品種見(jiàn)表7。

表7 果樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建概況

3 QTL基因定位在果樹(shù)育種中的應(yīng)用

通常沒(méi)有一種基因能唯一決定某些性狀,一般一組基因作為一個(gè)整體控制著某一特性。與特定數(shù)量性狀相關(guān)的基因所在的基因組區(qū)域稱(chēng)為QTL,即數(shù)量性狀位點(diǎn)。自從分子標(biāo)記出現(xiàn)以來(lái),研究人員和育種人員一直致力于識(shí)別與這些QTL相關(guān)的功能標(biāo)記,在果樹(shù)的重要性狀QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種等方面均取得較好的成果,如果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)的品質(zhì)、抗逆性的強(qiáng)弱等。前人已對(duì)蘋(píng)果、梨、柑橘等多種果樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育特性(開(kāi)花、生根能力、矮化等)、果實(shí)品質(zhì)(質(zhì)量、大小、顏色、硬度、風(fēng)味等)、抗生物脅迫、抗非生物脅迫(耐鹽堿、抗干旱、抗寒等)等重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析,有助于培育特定目標(biāo)性狀的果樹(shù)品種。

3.1 與蘋(píng)果相關(guān)的QTL

蘋(píng)果QTL的鑒定集中于其主要農(nóng)藝性狀[如矮化、果實(shí)品質(zhì)(包括果實(shí)質(zhì)量、果實(shí)大小、果實(shí)顏色以及果肉的糖酸含量)、蘋(píng)果的抗逆性(抗寒、抗旱、耐鹽堿等)]。Foster等[62]對(duì)41份M93Robusta5(非矮化)與Braeburn接穗嫁接的砧木群體的QTL進(jìn)行分析,結(jié)果表明,連鎖群LG5上的一個(gè)主要QTL對(duì)接穗的矮化有顯著影響。Zheng等[63]用來(lái)自海棠、紅富士、金冠、喬納森家系9 422株蘋(píng)果F1代雜交種為試材,檢測(cè)得到9個(gè)與蘋(píng)果果皮顏色遺傳變異有關(guān)的微效QTL(表8)。孫瑞[64]以紅玉、金冠以及紅玉和金冠的F1代雜交群體297株蘋(píng)果為試材,對(duì)其品質(zhì)性狀進(jìn)行QTL定位,共得到12個(gè)QTL位點(diǎn)。

3.2 與梨相關(guān)的QTL

迄今,QTL定位在梨的研究上取得了一定的成果。趙亞楠[65]利用蘋(píng)果梨和八月紅150株F1代材料對(duì)14個(gè)果實(shí)品質(zhì)性狀進(jìn)行基因定位分析,共獲得28個(gè)QTL位點(diǎn),其中與單果質(zhì)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)有5個(gè)、與果心大小相關(guān)的QTL位點(diǎn)有2個(gè)、與果肉硬度相關(guān)的QTL位點(diǎn)有3個(gè)、與果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)有6個(gè)、與果梗長(zhǎng)度相關(guān)的QTL位點(diǎn)有1個(gè)、與可溶性固形物含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)有6個(gè)、與可滴定酸含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)有2個(gè),共掃描到2 266個(gè)基因。Sun等[66]以131個(gè)亞洲梨和歐洲梨為試驗(yàn)材料,在已被鑒定的病害相關(guān)QTL區(qū)域中找到41個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)編碼基因(表9)。

表9 梨相關(guān)的數(shù)量性狀座位(QTL)

3.3 與柑橘相關(guān)的QTL

通過(guò)分子標(biāo)記構(gòu)建柑橘的遺傳連鎖圖譜可以獲得果實(shí)發(fā)育等農(nóng)藝性狀和應(yīng)答逆境脅迫的QTL。羅艾等[72]以晚蜜2號(hào)和梨橙2號(hào)的94株F1代材料為群體,進(jìn)行QTL定位分析,發(fā)現(xiàn)4個(gè)與果實(shí)質(zhì)量相關(guān)的QTL定位,7個(gè)與果實(shí)大小相關(guān)的QTL定位。馬喜軍[73]以晚蜜2號(hào)和梨橙2號(hào)的350株F1代為試驗(yàn)材料對(duì)柑橘抗寒性相關(guān)的QTL進(jìn)行定位,得到7個(gè)與柑橘抗寒性相關(guān)的QTL,分布于4個(gè)連鎖群上,分別為L(zhǎng)W1、LW2、LW3和LW8。Huang等[74]對(duì)甜橙×枳橙屬間雜交的170株F1代進(jìn)行基因分型分析,在枳遺傳圖譜上鑒定到4個(gè)與柑橘黃龍病相關(guān)的QTL(表10)。

表10 柑橘相關(guān)的數(shù)量性狀座位(QTL)

3.4 與其他果樹(shù)相關(guān)的QTL

除常見(jiàn)果樹(shù)外,其他果樹(shù)重要性狀相關(guān)的QTL定位研究也取得了很大進(jìn)展。Cirilli等[79]評(píng)估133份桃種質(zhì),定位到1個(gè)可以推遲桃花期的QTL。鮑荊凱[80]用JMS2和交城5號(hào)棗的150株F1代材料對(duì)其QTL定位進(jìn)行分析,共獲得104個(gè)QTL位點(diǎn),其中與果實(shí)大小相關(guān)的QTL位點(diǎn)57個(gè)、與果實(shí)糖組分相關(guān)的QTL位點(diǎn)17個(gè)、與果實(shí)酸組分相關(guān)的QTL位點(diǎn)30個(gè)。劉春燕[81]以桂海4號(hào)和山梨獼猴桃的雜交后代開(kāi)展QTL定位研究,共檢測(cè)到44個(gè)QTL位點(diǎn),其中與果實(shí)質(zhì)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)7個(gè),與果實(shí)橫縱徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)21個(gè)。史曉暢[82]以山東大綿球和新賓軟籽山楂的130株雜交F1代為材料,檢測(cè)到2個(gè)與單果質(zhì)量相關(guān)的QTL位點(diǎn),6個(gè)與果皮穿刺硬度相關(guān)的QTL位點(diǎn),3個(gè)與果實(shí)大小相關(guān)的QTL位點(diǎn),5個(gè)與果皮脆性相關(guān)的QTL位點(diǎn),5個(gè)與果肉平均硬度相關(guān)的QTL位點(diǎn)。這些研究(表11)不僅豐富了果樹(shù)的遺傳學(xué)研究,也為果實(shí)品質(zhì)及果樹(shù)抗逆的遺傳機(jī)制和育種研究提供了理論基礎(chǔ)。

4 展 望

在果樹(shù)的品種鑒定、輔助育種(早熟、無(wú)核、矮化、品質(zhì)以及抗性等)、遺傳圖譜的構(gòu)建和農(nóng)藝性狀基因定位等方面,DNA分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用。DNA分子標(biāo)記技術(shù)種類(lèi)多樣,大致可分為三類(lèi)。第一類(lèi):以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù),如RFLP;第二類(lèi):以DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),包括RAPD、SSR、SCAR等;第三類(lèi):以DNA測(cè)序?yàn)楹诵牡姆肿訕?biāo)記技術(shù),如SNP標(biāo)記[83]。RFLP具有共顯性且不需要先驗(yàn)序列信息,但它耗時(shí)長(zhǎng),需要大量純DNA,價(jià)格也比較昂貴[84]。RAPD操作簡(jiǎn)單,所需DNA量少,多態(tài)顯性,但需要高度純化的DNA并且再現(xiàn)性低。DNA的數(shù)量和質(zhì)量、PCR緩沖液、氯化鎂濃度、退火溫度和TaqDNA聚合酶是影響RAPD標(biāo)記再現(xiàn)性的一些重要因素[85]。AFLP標(biāo)記將RFLP和PCR技術(shù)結(jié)合在一起,先對(duì)DNA進(jìn)行消化,然后進(jìn)行PCR。AFLP標(biāo)記物具有低成本,并且不需要先前的序列信息。在AFLP中,既可以使用高質(zhì)量的DNA,也可以使用部分降解的DNA,但是,該DNA不能含有任何限制性?xún)?nèi)切酶或PCR抑制劑[86]。相較于RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記,SSR標(biāo)記具有多態(tài)性檢出率高、基因組中分布廣泛、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn),是檢測(cè)品種真實(shí)性、分析品種間遺傳差異以及鑒定純度的理想標(biāo)記[87]。SNP可以提供最簡(jiǎn)單和最大數(shù)量的標(biāo)記。SNP在植物和動(dòng)物中大量存在[88-91],植物中的SNP頻率為每100～300 bp中有1個(gè)SNP。SNP成本低,在基因組中廣泛分布,無(wú)需先驗(yàn)序列信息,再現(xiàn)性高,共顯性標(biāo)記,但其開(kāi)發(fā)成本較高。人們基于不同的等位基因識(shí)別技術(shù)和檢測(cè)平臺(tái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量的SNP基因分型方法,其中,RLFP(SNP-RFLP)是最簡(jiǎn)單的方法,CAPS標(biāo)記技術(shù)也可以應(yīng)用于SNP檢測(cè)[92]。分子標(biāo)記種類(lèi)繁多,功能優(yōu)勢(shì)也有所不同,根據(jù)試驗(yàn)的目的選擇合適的分子標(biāo)記有助于解決具體問(wèn)題。

表11 與其他果樹(shù)相關(guān)的數(shù)量性狀座位(QTL)

為同時(shí)提高育種效率、縮短育種周期,尋找與農(nóng)藝性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記至關(guān)重要。分子標(biāo)記輔助育種(MAS)的優(yōu)勢(shì)可以體現(xiàn)在以下3個(gè)方面。一、允許提前選擇。在育種中,有些性狀需要特定的生長(zhǎng)環(huán)境和一定的生長(zhǎng)周期。二、同一性狀利用多個(gè)等位基因。在不同的育種材料中,可能存在多個(gè)基因影響同一性狀(如抗病性和品質(zhì)),利用表型很難識(shí)別這些等位基因。三、允許同時(shí)選擇多個(gè)性狀。所選單株或品系不僅要在單株抗病、品質(zhì)、產(chǎn)量等方面表現(xiàn)良好,綜合性狀也要相對(duì)較好。因此,有必要對(duì)育種的種群中每個(gè)目標(biāo)性狀逐一進(jìn)行識(shí)別和篩選。以往的研究大多將目的基因的分子標(biāo)記與育種工作分離,不能很好地應(yīng)用于實(shí)際。今后分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展將與傳統(tǒng)育種相結(jié)合,使其盡快為育種工作服務(wù)。這有助于提高果樹(shù)作物育種效率,加快育種發(fā)展進(jìn)程。