鹽堿地旱生蘆葦根際解磷菌株篩選及促生特性

王繼蓮, 王冬玲, 周 茜, 張 甜, 李明源

(1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院,新疆 喀什 844006; 2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 喀什 844006)

磷是植物必不可少的礦質(zhì)元素,對其代謝、生長和繁殖有重要影響[1-2]。中國超過70%的耕地土壤缺乏能被植物直接吸收利用的速效磷,主要原因是磷素易被土壤固定,與Ca2+、Al3+、Fe3+等反應(yīng)形成不溶性化合物沉積在土壤中,導(dǎo)致植物生長緩慢或停滯[3]。為提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率,大量施加外源無機(jī)磷肥是增加土壤有效磷供應(yīng),維持作物高產(chǎn)的主要手段。然而植物對磷肥的利用率極低(<25%),長期大量施肥不僅造成磷素盈余,引起土壤性質(zhì)惡化,部分土壤磷還會隨水體滲流遷移,造成地下水污染,導(dǎo)致更嚴(yán)重的生態(tài)問題[4-5]。因此,如何提升土壤磷的供給,又不給生態(tài)環(huán)境造成額外負(fù)擔(dān),成為人們關(guān)注的新焦點(diǎn),微生物肥料應(yīng)運(yùn)而生。

微生物在元素循環(huán)中扮演著重要角色,一些類群能夠?qū)㈦y溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷來改善植物磷素供應(yīng),稱為解磷微生物(Phosphate solubilizing microorganisms, PSM)。研究結(jié)果表明,PSM主要依賴其代謝產(chǎn)生的多種有機(jī)酸來酸化難溶性磷酸鹽[6],還有部分解磷菌可在生長過程中分泌植酸酶、核酸酶、磷脂酶等多種水解酶,通過裂解有機(jī)磷化合物的磷脂鍵使其轉(zhuǎn)化成速效磷[7-8]。劉玲利等[9]將解磷菌施入土壤,有效活化了復(fù)墾土壤磷素,同時(shí)土壤堿性磷酸酶活性增加,促進(jìn)了油菜生長。巨大芽胞桿菌BacillusmegateriumHZP1和腸桿菌Enterobactersp.PSB-1發(fā)酵后,培養(yǎng)基中可溶性磷含量相比對照顯著提高,接種大豆和紫云英后,植株地上部分生物量、根瘤鮮質(zhì)量和根瘤數(shù)明顯增加[10]。莊馥璐等[11]從蘋果根際分離的解磷菌株Enterobactersp.PsbM4可有效礦化植酸鈣產(chǎn)生無機(jī)磷,促進(jìn)擬南芥生長。

特定的有效菌種是微生物菌肥的核心。迄今微生物菌肥已取得了快速發(fā)展,但基于土壤類型、地域和氣候的不同,不同宿主植物的根際解磷菌群存在明顯差異。因此,生物菌肥產(chǎn)品難以具有普適性,從不同生境植物針對性遴選高效解磷菌株仍然是開發(fā)有區(qū)域特效的微生物肥料的有效手段。旱生蘆葦(Phragmitesaustralis)是新疆鹽堿地廣泛分布的典型鹽生植物,適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng),其對鹽堿的適應(yīng)能力與根際菌群密切相關(guān)[12-13]。本研究擬從新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州鹽堿地旱生蘆葦根際篩選解磷菌,分析其促生特性和分類地位,并通過接種試驗(yàn)觀察其對鹽堿條件下作物生長的影響,為研制鹽堿地專用微生物肥料提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州鹽堿地(39°40′N,76°41′E)。該地區(qū)全年干旱少雨,土壤pH值8.0～8.5,全鹽含量12.1 g/kg。植被以鹽節(jié)木(Halocnemumstrobilaceum)、鹽穗木(Halostachyscaspica)、旱生蘆葦(Phragmitescommunis)等耐鹽堿植物為主。2021年10月,采用多點(diǎn)采樣法沿S型線路隨機(jī)挑取長勢良好的旱生蘆葦,挖去表面浮土,沿根系生長方向小心挖取根系及周圍的土壤。

盆栽供試土壤采集自新疆喀什郊區(qū)未耕種的鹽堿地,去除表層浮土后挖取10～30 cm土層的土壤。土壤pH值8.57,可溶性鹽含量0.36%,堿解氮、速效鉀和有效磷含量分別為28.64 mg/kg、99.57 mg/kg、18.92 mg/kg,有機(jī)質(zhì)含量為17.36 g/kg。

1.2 培養(yǎng)基

采用NBRIP培養(yǎng)基分離解無機(jī)磷菌株[14],采用Mongina培養(yǎng)基篩選解有機(jī)磷菌株[15],采用LB培養(yǎng)基加40%甘油保存菌種。

1.3 解磷菌的篩選

稱取10 g根際土壤樣品加入到含有玻璃珠的無菌水中,充分振蕩30 min使顆粒分散。取上清液依次10倍梯度稀釋后,分別吸取不同濃度梯度的上清液涂布于NBRIP和Mongina平板上,每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次,28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。挑取溶磷圈較大、形態(tài)不同的菌落在LB平板上多次劃線純化,獲得純菌落。

1.4 溶磷能力測定

用鉬銻抗比色法[16]測定磷含量,分別吸取5 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml于50 ml容量瓶中,然后加入碳酸氫鈉溶液(0.5 mol/L,pH值8.5)10 ml,再加入鉬銻抗試劑5 ml,用去離子水定容。以磷濃度為橫坐標(biāo),OD700值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將解磷菌以2%接種量分別接種至50 ml的NBRIP和Mongina液體培養(yǎng)基中,每株菌株3次重復(fù),以不接菌的培養(yǎng)基作為對照,28 ℃,180 r/min培養(yǎng)7 d后測定發(fā)酵液pH值。同時(shí)將發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min,取一定量上清液測定磷含量,并分析磷含量與發(fā)酵液pH值的相關(guān)性。

1.5 16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

用無菌牙簽輕輕挑取單菌落,置于50 μl 裂解Buffer (TaKaRa公司產(chǎn)品)中,80 ℃熱變性15 min,然后低速離心5 min。取1～3 μl上清液用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對分離物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MspⅠ和HaeⅢ酶切,并進(jìn)行圖譜分析,相同圖譜選取1～2株代表性菌株由生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果提交EZBioCloud數(shù)據(jù)庫比對,通過MEGA 6.0軟件,用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建解磷菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 促生試驗(yàn)

1.6.1 種子催芽及接菌處理 擬南芥種子為哥倫比亞野生型,消毒后用無菌牙簽點(diǎn)播于花卉基質(zhì)(不含鹽堿土壤)育苗盤,覆保鮮膜,待種子發(fā)芽至兩片嫩葉進(jìn)行接種處理。分別選取解磷能力較強(qiáng)的前5株菌株,接種于LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,統(tǒng)一調(diào)整菌液OD600為0.8(活菌數(shù)1×109CFU/ml),分別接種菌株培養(yǎng)液、滅活的菌株培養(yǎng)液。每8 d灌根1次,每次灌根菌液用量為5 ml,對照用等量無菌LB培養(yǎng)基灌根。每個(gè)處理5次重復(fù)。光照培養(yǎng)室參數(shù)設(shè)置為25 ℃,光照14 h/黑暗10 h,定期補(bǔ)水并調(diào)換育苗盤位置,以保證受光一致,統(tǒng)一管理32 d后取樣。測量相關(guān)指標(biāo),分析解磷菌株對非鹽堿脅迫下植株生長的影響。

將供試鹽堿土壤與花卉基質(zhì)按質(zhì)量比7∶3混勻,高溫滅菌后備用。供試小麥品種新冬60號系喀什地區(qū)主推小麥品種。將健康飽滿的種子用1%的次氯酸鈉浸泡5 min,經(jīng)無菌水沖洗5次以上后平鋪于濕潤的濾紙上,28 ℃催芽48 h。挑選圓潤飽滿且芽長一致的種子,每盆播種9粒種子,同上述方法進(jìn)行菌液灌根處理,研究解磷菌株對鹽堿土種植小麥的促生效應(yīng)。

1.6.2 指標(biāo)測定 隨機(jī)抽取不同處理的擬南芥幼苗和小麥幼苗,用卷尺測量株高,游標(biāo)卡尺測量莖粗;將植株地上部分與地下部分分開,用分析天平精確測量地上部分和地下部分鮮質(zhì)量。植株經(jīng)105 ℃高溫殺青30 min后烘至恒質(zhì)量,用分析天平測量地上部分干質(zhì)量和地下部分干質(zhì)量,對擬南芥根系發(fā)育情況進(jìn)行顯微觀察。采用SPSS 21.0和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌株的篩選及解磷能力測定

從旱生蘆葦根際土壤中共篩選到47株解磷菌株,其中32株能溶解無機(jī)磷,溶磷量為55.8～722.3 mg/L,以菌株P(guān)M-9的解磷能力最強(qiáng)(圖1A)。有37株菌可溶解有機(jī)磷,溶磷量為11.8～34.4 mg/L,以菌株P(guān)M-20的解磷能力最強(qiáng)(圖1B)。可溶解無機(jī)磷菌株的發(fā)酵液pH值為4.24～7.46,發(fā)酵液pH值與發(fā)酵液中可溶性磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(R2=0.830,P<0.05),說明菌株溶解無機(jī)磷能力越強(qiáng)所產(chǎn)生的發(fā)酵液pH值越低?？扇芙庥袡C(jī)磷菌株的發(fā)酵液pH值為6.04～6.89,菌株溶解有機(jī)磷能力與發(fā)酵液pH值無明顯相關(guān)關(guān)系。

2.2 25株代表菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

基于限制性酶切片段長度多態(tài)性的分析結(jié)果,共選取了25株代表菌株進(jìn)行16S rDNA測序,系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。所有菌株隸屬于7個(gè)屬,以腸桿菌屬(Enterobacter)為絕對優(yōu)勢屬,占總數(shù)的60%。假單胞菌屬(Pseudomonas)有3株,占總數(shù)的12%。類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)各2株,各占總數(shù)的8%。芽孢桿菌屬(Bacillus)、Mammaliicoccus和Paeniglutamicibacter各1株,各占總數(shù)的4%。

2.3 促生效果

2.3.1 溶解無機(jī)磷菌株對擬南芥的促生效果 相較于對照,滅活的菌株培養(yǎng)液對擬南芥株高均無顯著影響(P>0.05),未滅活的菌株培養(yǎng)液使擬南芥株高顯著提高11.8%～28.1%(P<0.05)(圖3)。接種未滅活的Bacillussp.PN-2、未滅活的Enterobactersp.PM-9、未滅活的Enterobactersp.PM-13、未滅活的Enterobactersp.PN-7以及滅活的Enterobactersp.PM-13培養(yǎng)液的擬南芥地上部分鮮質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05)。其中接種未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥地上部分鮮質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高62.4%(P<0.05)。

接種未滅活的Pseudomonassp.PN-1、未滅活的Bacillussp.PN-2、未滅活的Enterobactersp.PM-9、未滅活的Enterobactersp.PN-7、滅活的Pseudomonassp.PN-1以及滅活的Enterobactersp.PN-7培養(yǎng)液的擬南芥地上部分干質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05)。在所有處理中,接種未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥地上部分干質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高52.2%。接種未滅活的Pseudomonassp.PN-1、未滅活的Bacillussp.PN-2、未滅活的Enterobactersp.PM-13培養(yǎng)液的擬南芥地下部分干質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05)。在所有處理中,接種未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥地下部分干質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高36.0%(P<0.05)。相比對照,接種未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥主根更發(fā)達(dá),側(cè)根數(shù)量明顯增多(圖4)?？傮w而言,溶解無機(jī)磷菌株中未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液對擬南芥的促生效果更明顯。

A9:菌株P(guān)M-9;A13:菌株P(guān)M-13;B7:菌株P(guān)N-7;B1:菌株P(guān)N-1;A4:菌株P(guān)M-4;B2:菌株P(guān)N-4;A5:菌株P(guān)M-5;B13:菌株P(guān)N-13;A17:菌株P(guān)M-17;B6:菌株P(guān)N-6;A7:菌株P(guān)M-7;A3:菌株P(guān)M-9;B3:菌株P(guān)N-3;A16:菌株P(guān)M-16;B19:菌株P(guān)N-19; B4:菌株P(guān)N-4;A23:菌株P(guān)M-23;B8:菌株P(guān)N-8;B10:菌株P(guān)N-10;B12:菌株P(guān)N-12;A19:菌株P(guān)M-19;A8:菌株P(guān)M-8;A24:菌株P(guān)M-24;B11:菌株P(guān)N-11;A12:菌株P(guān)M-12;A11:菌株P(guān)M-11;A26:菌株P(guān)M-26;A22:菌株P(guān)M-22;A25:菌株P(guān)M-25;B20:菌株P(guān)N-20;B9:菌株P(guān)N-9;A15:菌株P(guān)M-15;A20:菌株P(guān)M-20;A2:菌株P(guān)M-2;B14:菌株P(guān)N-14; B18:菌株P(guān)N-18;A1:菌株P(guān)M-1;B15:菌株P(guān)N-15;B16:菌株P(guān)N-16;A14:菌株P(guān)M-14;B5:菌株P(guān)N-5;A18:菌株P(guān)M-18;A6:菌株P(guān)M-6;A10:菌株P(guān)M-10;B17:菌株P(guān)N-17。

PN-2:Bacillus sp.PN-2;PN-19:Mammaliicoccus sp.PN-19;PM-1:Paenibacillus sp.PM-1;PN-18:Paenibacillus sp.PN-18; PN-14:Paeniglutamicibacter sp.PN-14;PN-17:Acinetobacter sp.PN-17;PM-23:Acinetobacter sp.PM-23;PN-15:Pseudomonas sp.PN-15;PM-22:Pseudomonas sp.PM-22;PN-1:Pseudomonas sp.PN-1;PN-3:Enterobacter sp.PN-3;PN-4:Enterobacter sp.PN-4;PN-9:Enterobacter sp.PN-9;PN-7:Enterobacter sp.PN-7;PM-5:Enterobacter sp.PM-5;PM-8:Enterobacter sp.PM-8;PM-2:Enterobacter sp.PM-2;PM-12:Enterobacter sp.PM-12;PM-13:Enterobacter sp.PM-13;PM-25:Enterobacter sp.PM-25;PN-5:Enterobacter sp.PN-5;PN-6:Enterobacter sp.PN-6;PN-8:Enterobacter sp.PN-8;PN-12:Enterobacter sp.PN-12;PM-9:Enterobacter sp.PM-9。

CK:對照,無菌LB培養(yǎng)基;PN-1、PN-2、PM-9、PM-13、PN-7見圖2注。不同柱上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

A:接種LB培養(yǎng)基的擬南芥根系顯微圖;B:接種滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥根系顯微圖;C:接種未滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥根系顯微圖;D:從左到右分別為接種LB培養(yǎng)基、接種滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液、接種未滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液的擬南芥植株。

2.3.2 溶解有機(jī)磷菌株對擬南芥的促生效果 接種滅活的Enterobactersp.PM-2和Enterobactersp.PM-20培養(yǎng)液的擬南芥株高與對照相比無顯著差異(P>0.05),其他處理擬南芥株高均較對照顯著提高,所有處理中接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的擬南芥株高最高,相較于對照顯著提高46.7%(P<0.05)(圖5)。接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1、未滅活的Enterobactersp.PM-2、未滅活的Enterobactersp.PM-5培養(yǎng)液的擬南芥地上部分鮮質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05),其他處理擬南芥地上部分鮮質(zhì)量和對照相比無顯著差異(P>0.05)。所有處理中接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的擬南芥地上部分鮮質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高58.2%(P<0.05)。接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1、未滅活的Enterobactersp.PM-2、未滅活的Enterobactersp.PM-5培養(yǎng)液的擬南芥地上部分干質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05),其他處理擬南芥地上部分干質(zhì)量和對照相比無顯著差異(P>0.05)。所有處理中接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的擬南芥地上部分干質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高79.9%(P<0.05)。

接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1、未滅活的Enterobactersp.PM-2、未滅活的Pseudomonassp.PN-14、未滅活的Enterobactersp.PM-5和滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的擬南芥地下部分干質(zhì)量顯著高于對照(P<0.05),其他處理擬南芥地下部分干質(zhì)量和對照相比無顯著差異(P>0.05)。所有處理中接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的擬南芥地下部分干質(zhì)量最大,相較于對照顯著提高59.3%(P<0.05)?？傮w而言,溶解有機(jī)磷菌株中未滅活的Pseudomonassp.PM-1對擬南芥的促生作用最明顯,具有較大開發(fā)潛力。

2.3.3 溶解無機(jī)磷菌株對鹽堿脅迫下小麥的促生效果 所有處理中,接種未滅活的Enterobactersp.PM-9培養(yǎng)液的小麥地上部分鮮質(zhì)量、株高、地上部分干質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量最大(圖6、圖7)。接種未滅活的Enterobactersp.PM-9培養(yǎng)液的小麥地上部分鮮質(zhì)量較對照顯著提高40.3%(P<0.05),株高較對照顯著提高18.1%(P<0.05),地上部分干質(zhì)量較對照顯著提高57.5%(P<0.05),地下部分鮮質(zhì)量較對照顯著提高39.0%(P<0.05),地下部分干質(zhì)量較對照顯著提高74.9%(P<0.05)。接種未滅活的Bacillussp.PN-2培養(yǎng)液的小麥莖粗最大,較對照顯著提高18.1%?？傮w而言,溶解無機(jī)磷菌株中Enterobactersp.PM-9對鹽堿脅迫下小麥的促生效果最佳。

2.3.4 溶解有機(jī)磷菌株對鹽堿脅迫下小麥的促生效果 所有處理中,接種未滅活的Enterobactersp.PM-2培養(yǎng)液的小麥地上部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、莖粗、地下部分干質(zhì)量最大(圖8)。接種未滅活的Enterobactersp.PM-2培養(yǎng)液的小麥地上部分鮮質(zhì)量較對照顯著提高34.7%(P<0.05),地上部分干質(zhì)量較對照顯著提高74.4(P<0.05),莖粗較對照顯著提高56.1%(P<0.05),地下部分干質(zhì)量較對照顯著提高26.4%(P<0.05)。接種未滅活的Pseudomonassp.PM-1培養(yǎng)液的小麥地下部分鮮質(zhì)量最大,較對照顯著提高41.9%。接種未滅活的Enterobactersp.PM-5培養(yǎng)液的小麥株高最大,較對照顯著提高71.9%?？傮w而言,溶解有機(jī)磷菌株中未滅活的Enterobactersp.PM-2的促生效果更突出。

CK:對照,無菌LB培養(yǎng)基;PM-1、PM-2、PM-20、PN-14、PM-5見圖2注。不同柱上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

CK:對照,無菌LB培養(yǎng)基;PN-1、PN-2、PM-9、PM-13、PN-7見圖2注。不同柱上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

A圖中從左到右為接種LB培養(yǎng)基、滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液、未滅活的Bacillus sp.PN-2培養(yǎng)液的小麥;B圖中從左到右為接種LB培養(yǎng)基、滅活的Enterobacter sp.PM-9培養(yǎng)液、未滅活的Enterobacter sp.PM-9培養(yǎng)液的小麥。

3 討 論

解磷菌的解磷活性對土壤磷素轉(zhuǎn)化有重要意義,但不同植物因根系分泌物、地理生境等的差異,其根際微生物群落組成有較大差別,這勢必會影響解磷菌的遺傳多樣性。孟建宇等[17]從內(nèi)蒙古荒漠灌木根際土壤中分離的解磷菌分屬6綱21屬,以Bacillus為優(yōu)勢菌屬;莊馥璐等[11]從蘋果根際土壤中分離的解磷促生菌主要屬于Pseudomonas和Enterobacter;杜慧慧等[18]從不同生境滇重樓根際土壤中篩選的解磷菌均屬于Bacillus。本研究從旱生蘆葦根際土壤中分離出的解磷菌包括腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬等7個(gè)屬,以腸桿菌屬占絕對數(shù)量優(yōu)勢,反映出不同生境的植物根際蘊(yùn)藏的解磷菌種群有較大差異。相似的土壤質(zhì)地、氣候條件等環(huán)境因素趨于塑造相近的微生物群落。許芳芳[19]從內(nèi)蒙古荒漠植物根際土壤中獲得的耐鹽堿解磷菌優(yōu)勢屬,主要包括腸桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬;柳鑫鵬等[20]從松嫩平原鹽堿土植物根際土壤中篩選的促生菌主要為不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬,與本研究結(jié)果有相似之處。說明腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等作為重要的解磷菌資源,在荒漠鹽堿土中廣泛分布。

土壤速效磷含量是評價(jià)土壤供磷水平、確定磷肥用量、評估農(nóng)田磷環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo),但不同細(xì)菌種類溶解無機(jī)磷和礦化有機(jī)磷的能力差異較大。陳巖巖等[21]分離自板栗根際土壤中的菌株BurkholderiacepaciaP6能夠溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷的量分別為75.98 mg/L、40.30 mg/L。駱韻涵等[22]從紅樹林根際土壤中篩選出2株溶解無機(jī)磷菌Bacilluscepacia NBRC14074和BacilluspumilusATCC7061,溶磷量分別為409.9 mg/L和90.79 mg/L。王艷霞等[23]從田菁根際土壤中分離的腸桿菌Enterobactersp.N102能夠溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷的量分別為36.29 mg/L和1.23 mg/L。而本研究中有機(jī)磷溶磷量超過30 mg/L的菌株有5株,無機(jī)磷溶磷量超過400 mg/L的有12株,與上述報(bào)道相比具有更高的解磷能力。此外,本研究結(jié)果表明,菌株培養(yǎng)液pH值與菌株溶解無機(jī)磷能力呈顯著負(fù)相關(guān),與駱韻涵等[22]的研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果表明,溶解無機(jī)磷菌株在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生多種有機(jī)酸,導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值下降[24]。因此推測本研究中解磷菌的溶磷過程中伴隨有機(jī)酸的積累,菌株通過酸化作用釋放磷酸三鈣中的磷元素。而鹽堿土壤中,解磷菌富集的有機(jī)酸能較好地降低鹽堿土的pH值,緩解高鹽堿環(huán)境的脅迫。Al-enazy等[25]發(fā)現(xiàn),耐鹽堿解磷菌菌劑配施磷石膏,提高了堿化土壤質(zhì)量,土壤酶活和理化性質(zhì)得到顯著改善。而有機(jī)磷的礦化主要依靠菌株分泌胞外磷酸酶,把有機(jī)磷水解為簡單的無機(jī)磷酸鹽來增加土壤中有效磷含量,對土壤pH值影響相對較小。不足的是,本研究目前僅通過盆栽試驗(yàn)評價(jià)了解磷微生物的生物學(xué)效應(yīng),后期會進(jìn)一步考察其對土壤中磷素形態(tài)轉(zhuǎn)化及植株磷素吸收的影響,為解磷菌改良鹽堿土壤提供更多理論支持。

一般的解磷微生物雖具有促生特性,但耐鹽堿能力有限,在高鹽堿土壤中的存活力較低,嚴(yán)重影響了其促生能力的發(fā)揮。Bacillussp.PN-2、Paenibacillussp.PM-1等對擬南芥表現(xiàn)出促生效應(yīng),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對鹽堿土種植的小麥也有促生作用,但能否最終實(shí)際應(yīng)用到大田有待后續(xù)驗(yàn)證。由于本試驗(yàn)的供試土壤為事先滅菌的,最大程度排除了土壤中土著菌群、原生動(dòng)物、線蟲等因素的干擾,更能客觀反映菌株對作物的促生作用。但是在野外田間條件下,擾動(dòng)微生物在根際定殖的因素錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及根系分泌物的種類和數(shù)量、植物生長狀況、細(xì)菌營養(yǎng)型、趨化性及自我調(diào)節(jié)機(jī)制等。如馬鈴薯根系分泌物和酚酸能吸引萎縮芽孢桿菌QHZ3在根際定殖[26],稗草根系分泌物對根際微生物的定殖有選擇性[27],植物根系構(gòu)型的改變可誘導(dǎo)不同種群的定殖[28],根系生長速率影響假單胞菌的積累[29]。此外,微生物的定殖與土壤溫度、質(zhì)地、含水量、含氧量等非生物因素也有密切關(guān)系[30]。鑒于實(shí)驗(yàn)室與田間自然生境的巨大差異,考慮到后期的實(shí)際應(yīng)用,追蹤、比較解磷菌在控制條件及野外的定殖動(dòng)態(tài)有重要意義。

CK:對照,無菌LB培養(yǎng)基;PM-1、PM-2、PM-20、PN-14、PM-5見圖2注。不同柱上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

鹽堿化問題是制約新疆,乃至中國西北地區(qū)土地資源深度利用的重要限制因素[31-32]。但在這類生境中卻生長著抗逆性極強(qiáng)的植物種質(zhì),其以強(qiáng)悍的耐鹽堿特性成為不同鹽堿化地區(qū)的優(yōu)勢植被。其根際促生菌可釋放多種信號分子來改變植物生理狀態(tài),增加對惡劣環(huán)境的抵抗力[33-35]。因此,對鹽堿地土著植物根際土壤中解磷菌進(jìn)行篩選,有助于發(fā)掘新的功能菌株資源,具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。此外有研究結(jié)果表明[36],根際促生菌能介導(dǎo)根際環(huán)境中整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu),使其與植物形成良性互作關(guān)系,以此促進(jìn)植物生長[37]。蘆葦?shù)目鼓嫘詮?qiáng),在傳統(tǒng)淡水作物無法生長的鹽堿地上仍生長良好,具有短期成型、快速成景、生物量高的優(yōu)點(diǎn),其廣泛的適應(yīng)性和強(qiáng)悍的抗逆性與根際促生菌的互作機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州鹽堿地旱生蘆葦根際土壤中篩選出47株解磷細(xì)菌,其中溶解無機(jī)磷菌株32株,溶磷量為55.8～722.3 mg/L,溶磷量與發(fā)酵液pH值呈顯著負(fù)相關(guān);溶解有機(jī)磷菌株37株,溶磷量為11.8～34.4 mg/L。所有菌株隸屬于7個(gè)屬,以腸桿菌屬(Enterobacter)占絕對優(yōu)勢。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,解磷菌株對非鹽堿脅迫下生長的擬南芥及鹽堿脅迫下生長的小麥幼苗有促生作用,解磷菌株有效促進(jìn)了擬南芥植株的生長和根系發(fā)育,以芽孢桿菌Bacillussp.PN-2和類芽孢桿菌Paenibacillussp.PM-1對非鹽堿脅迫下擬南芥植株的促生作用最突出,以Enterobactersp.PM-9和Enterobactersp.PM-2對鹽堿脅迫下小麥的促生作用最突出。本研究篩選出的解磷菌株在鹽堿地植物促生方面具有一定應(yīng)用潛力。