麻風(fēng)樹JcHDZ28基因克隆與功能分析

唐躍輝, 趙雨凡, 蔣心言, 張英穎, 王 寒, 包欣欣, 范雨杰, 李 彤

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南 周口 466001)

非生物脅迫如干旱、高溫、低溫、氧化脅迫、高鹽等都會(huì)降低作物產(chǎn)量,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了適應(yīng)這些極端環(huán)境條件,植物在生理、代謝、形態(tài)和分子水平上進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,通過激活或者抑制脅迫相關(guān)基因的表達(dá)使得植物在這些極端條件下能夠更好地生存[1]。研究結(jié)果表明,一些轉(zhuǎn)錄因子如MYB、NAC、HD-Zip、AP2/ERF、WRKY、bZIP等家族成員參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫的調(diào)控[1-6]。

HD-Zip蛋白是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子,具有1個(gè)由61個(gè)氨基酸組成的高度保守的同源結(jié)構(gòu)域(HD),以及1個(gè)與HD的羧基端緊密相連的亮氨酸拉鏈(LZ)元件。HD負(fù)責(zé)特異性DNA序列結(jié)合,調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。LZ元件協(xié)助HD-Zip蛋白特異性識(shí)別目標(biāo)DNA序列,起到二聚化的作用[1,7]。植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子最先在玉米中被發(fā)現(xiàn),編碼1個(gè)涉及葉片發(fā)育的HD-Zip I類的轉(zhuǎn)錄因子[7]。之后,HD-Zip基因在不同的植物中被發(fā)現(xiàn),并通過構(gòu)建這類基因的功能缺失突變體或功能獲得突變體對其功能進(jìn)行了研究,結(jié)果表明HD-Zip蛋白在植物生長發(fā)育和逆境脅迫的調(diào)控中扮演重要的角色[6-8]。例如,TaHDZipl-2正調(diào)控小麥花期和穗的發(fā)育[9];oshox33突變體通過改變GS1和GS2的表達(dá)呈現(xiàn)出葉片衰老的表型[10];AtHB12是一種潛在的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與植物葉片發(fā)育的調(diào)節(jié)[11]。除此之外,許多研究結(jié)果表明HD-Zip蛋白也參與調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的響應(yīng)[12-13]。提高TaHDZipI-5基因的表達(dá)水平增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因小麥對干旱脅迫和冷脅迫的抗性[12];提高OsHOX24基因的表達(dá)水平增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻抗旱、抗鹽能力[13];玉米HD-Zip家族基因Zmhdz10通過調(diào)控干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)正調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱脅迫的響應(yīng)[14]。盡管許多物種HD-Zip基因家族成員已被克隆并進(jìn)行功能分析,然而,麻風(fēng)樹中參與生長發(fā)育和脅迫調(diào)控的HD-Zip基因仍然有待挖掘和進(jìn)一步研究。

麻風(fēng)樹又名小桐子,由于其具有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、耐干旱、耐鹽堿、種仁含油量高等特點(diǎn)成為生產(chǎn)生物柴油的明星物種,越來越引起科學(xué)家的重視[15]。因此,本研究擬從麻風(fēng)樹中挖掘響應(yīng)鹽脅迫的HD-Zip家族基因并對其調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行研究,以期為麻風(fēng)樹耐鹽品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

試驗(yàn)材料為麻風(fēng)樹自交系品種GZQX0401和擬南芥Columbia-0。選取6葉期麻風(fēng)樹的根、莖、葉、花和授粉后35 d的種子進(jìn)行JcHDZ28基因組織特異性表達(dá)分析。鹽脅迫試驗(yàn),對6葉期麻風(fēng)樹直接澆灌150 mmol/L的NaCl溶液,選取脅迫處理0 h、2 h、6 h、12 h和24 h的第4片葉,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 JcHDZ28基因序列分析

麻風(fēng)樹JcHDZ28序列和該基因在別的物種中的同源基因均來自于NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心),JcHDZ28在擬南芥中的同源基因來自TAIR數(shù)據(jù)庫。采用DNA MAN 9.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。

1.3 JcHDZ28基因亞細(xì)胞定位

以麻風(fēng)樹葉片cDNA為模版,通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得不含終止密碼子的JcHDZ28編碼序列,隨后將其連接到pBWA(V)HS-GLosgfp載體構(gòu)建pBWA(V)HS-JcHDZ28-GLosgfp融合表達(dá)載體。將構(gòu)建好的pBWA(V)HS-JcHDZ28-GLosgfp載體和pBWA(V)HS-GLosgfp載體通過聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞,在共聚焦掃描顯微鏡(Leica TCS SP8)上獲得定位樣品的熒光圖像。聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體制備參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。

1.4 基因克隆與轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建

以麻風(fēng)樹葉片cDNA為模版,通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得JcHDZ28基因的全長編碼序列,測序后,將測序正確的序列連接到p1301載體KpnI和XbaI的酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建35S::JcHDZ28-p1301植物表達(dá)載體。然后通過GV3101介導(dǎo)的花序浸染法將35S::JcHDZ28-p1301載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中獲得轉(zhuǎn)基因植株[14]。通過潮霉素、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色和RT-PCR確定有效JcHDZ28轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)試驗(yàn)研究,以期為麻風(fēng)樹耐鹽品種的培育提供理論依據(jù)。

1.5 轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株鹽脅迫分析

首先用潮霉素將野生型擬南芥和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株種子消毒,4 ℃暗處理2 d后,將擬南芥Columbia-0(WT,野生型)和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株種子點(diǎn)播到1/2 MS和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中,置于22 ℃生長間中生長(16 h 光照/8 h黑暗),20 d后觀察表型。

1.6 生理指標(biāo)分析

選用鹽脅迫處理15 d的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株葉片進(jìn)行相對電導(dǎo)率和脯氨酸含量測定。相對電導(dǎo)率的測定方法參照文獻(xiàn)[14],脯氨酸含量測定方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.7 RNA提取和定量PCR分析

RNA采用TRIzol試劑進(jìn)行提取,采用Invitrogen SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成第一鏈cDNA,具體操作方法參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。采用SYBR PremixExTaqTMII 試劑盒和LightCycler 480定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。本研究所用引物信息見表1。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 JcHDZ28基因的生物信息學(xué)分析

設(shè)計(jì)特異性引物,以麻風(fēng)樹葉cDNA為模版,通過RT-PCR克隆獲得JcHDZ28基因編碼區(qū)序列,測序并通過NCBI比對,結(jié)果表明,JcHDZ28基因編碼區(qū)序列(CDS)全長882 bp,編碼293個(gè)氨基酸。我們進(jìn)一步通過DNA MAN軟件對JcHDZ28及其與在別的物種中的同源基因的相似性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,麻風(fēng)樹JcHDZ28蛋白與擬南芥、玉米和水稻中的HD-Zip家族成員高度同源,且均含有高度保守的HD和LZ基序(圖1)。

Oshox1表示水稻中的HD-Zip家族蛋白;Zmhdz25表示玉米中的HD-Zip家族蛋白;AtHB2表示擬南芥中的HD-Zip家族蛋白。

2.2 JcHDZ28基因的表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步研究JcHDZ28在植物生長發(fā)育中的作用,我們使用qRT-PCR分析了JcHDZ28基因在根、莖、葉、花和種子中的表達(dá)模式,結(jié)果表明,在所有被檢測的器官中都檢測到JcHDZ28的表達(dá),且JcHDZ28基因在生殖器官(花和種子)中的相對表達(dá)量較高(圖2a)。我們進(jìn)一步檢測了JcHDZ28基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式,結(jié)果表明,JcHDZ28基因在鹽脅迫2 h、6 h、12 h和24 h的相對表達(dá)量均顯著低于鹽脅迫0 h的相對表達(dá)量,且鹽脅迫24 h的相對表達(dá)量相比鹽脅迫6 h、12 h有所提高(圖2b)。該結(jié)果進(jìn)一步表明,JcHDZ28基因也許在植物響應(yīng)鹽脅迫中起重要的調(diào)控作用。

a:JcHDZ28基因組織特異性表達(dá);b: JcHDZ28基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)模式分析。 **表示在鹽脅迫2 h、6 h、12 h、24 h與0 h相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 JcHDZ28蛋白的亞細(xì)胞定位

為了檢測JcHDZ28蛋白的亞細(xì)胞定位,我們構(gòu)建了35S::JcHDZ28-GLosgfp融合表達(dá)載體。隨后將構(gòu)建好的質(zhì)粒連同35S::GFP質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞,在共聚焦掃描顯微鏡上獲得定位樣品的熒光圖像。結(jié)果(圖3)表明,35S::GFP質(zhì)粒在所有細(xì)胞中都可以檢測到熒光信號(hào),然而,35S::JcHDZ28-GFP質(zhì)粒只在細(xì)胞核中檢測到了明亮的綠色信號(hào)。這些結(jié)果表明,JcHDZ28蛋白定位于細(xì)胞核中。

圖3 JcHDZ28蛋白亞細(xì)胞定位分析

2.4 轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥表型分析

為了進(jìn)一步研究JcHDZ28基因的功能,我們構(gòu)建了過表達(dá)轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥植株。RT-PCR結(jié)果表明,檢測到JcHDZ28基因在轉(zhuǎn)基因株系中高表達(dá),在野生型中沒有檢測到表達(dá)(圖4a)。表型分析結(jié)果表明,過表達(dá)JcHDZ28不影響擬南芥地上部分生長發(fā)育(圖4b)。開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株開花時(shí)間與野生型相比沒有顯著差異,表明過表達(dá)JcHDZ28不影響擬南芥開花時(shí)間(圖4c)。這些結(jié)果表明,JcHDZ28基因不影響轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分的生長和發(fā)育。

a:JcHDZ28基因在野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況;b:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株表型分析;c:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)。 WT:野生型;OE1:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株1號(hào)株系;OE2:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株2號(hào)株系;OE3:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株3號(hào)株系。

2.5 轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥鹽脅迫抗性分析

qRT-PCR結(jié)果表明鹽脅迫抑制JcHDZ28基因的表達(dá)(圖2b),因此我們推測JcHDZ28也許參與植物對鹽脅迫的響應(yīng)。為了證明這個(gè)假設(shè),我們進(jìn)一步檢測了野生型和轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的抗性。我們將消毒后的野生型和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株直接點(diǎn)播到1/2 MS和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中生長20 d。結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株大小明顯小于野生型擬南芥植株大小,葉片白化更嚴(yán)重(圖5a),存活率極顯著低于野生型擬南芥(圖5b)。生理指標(biāo)測定結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片相對電導(dǎo)率極顯著高于野生型擬南芥(圖5c),脯氨酸含量極顯著低于野生型擬南芥(圖5d)。這些結(jié)果表明,過表達(dá)JcHDZ28降低了轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株對鹽脅迫的抗性。

a:野生型擬南芥和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥在正常生長和鹽脅迫(100 mmol/L NaCl)條件下的生長分析;b:成活率分析;c:相對電導(dǎo)率分析;d:脯氨酸含量分析。 WT:野生型;OE1:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株1號(hào)株系;OE2:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株2號(hào)株系;OE3:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株3號(hào)株系。**表示在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比差異極顯著(P<0.01)。

2.6 鹽脅迫條件下非生物脅迫相關(guān)基因表達(dá)

為了進(jìn)一步闡明JcHDZ28調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)理,我們通過qRT-PCR技術(shù)檢測了SNAC1、AtCATA、LEA3、P5CS1等脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明,在正常生長條件下,SNAC1、AtCATA、LEA3、P5CS1在野生型擬南芥和轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥植株中的相對表達(dá)量沒有顯著差異,然而,在鹽脅迫條件下,這些基因在轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥植株中的相對表達(dá)量顯著低于在野生型擬南芥中的相對表達(dá)量(圖6)。這些結(jié)果表明,鹽脅迫條件下,過表達(dá)JcHDZ28增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的敏感性也許是通過改變這些非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)引起的。

WT:野生型;OE1:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株1號(hào)株系;OE2:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株2號(hào)株系;OE3:轉(zhuǎn)JcHDZ28基因植株3號(hào)株系。

3 討 論

HD-Zip基因是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子基因,這些轉(zhuǎn)錄因子基因在植物生長發(fā)育(如胚胎發(fā)生、分生組織調(diào)控等)和非生物脅迫(如高鹽、干旱等)過程中發(fā)揮重要的作用[1]。盡管許多HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在擬南芥、水稻和別的物種中的功能已經(jīng)被闡述,但是HD-Zip基因在大戟科尤其是麻風(fēng)樹中的研究較少。在本研究中,我們克隆了麻風(fēng)樹JcHDZ28基因(1個(gè)HD-Zip家族基因的成員)并分析了該基因的功能,在擬南芥中超表達(dá)JcHDZ28增加了轉(zhuǎn)基因植物對鹽脅迫的敏感性。

前人研究結(jié)果表明,超表達(dá)HD-Zip家族基因能夠改變轉(zhuǎn)基因植物對非生物脅迫的抗性[12-15]。在水稻中,過表達(dá)HD-Zip家族基因增加了轉(zhuǎn)基因水稻對非生物脅迫的敏感性[15]。與此相似,在本研究中,轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥在鹽脅迫條件下的植株大小和存活率均低于野生型擬南芥。前人研究結(jié)果表明,當(dāng)植物遭遇非生物脅迫的時(shí)候,其體內(nèi)的一些生理指標(biāo)迅速變化使得植物能夠更好地應(yīng)對這些極端環(huán)境條件[12-14]。因此,生理指標(biāo)可以用來衡量植物對非生物脅迫的抗性。相對電導(dǎo)率是植物遭受逆境脅迫時(shí)其細(xì)胞膜損傷程度的重要評(píng)價(jià)因子[15]。本研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥在鹽脅迫條件下的相對電導(dǎo)率極顯著高于野生型擬南芥,該結(jié)果進(jìn)一步表明,鹽脅迫對轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥細(xì)胞膜的破壞程度顯著高于野生型擬南芥。脯氨酸能夠用來作為穩(wěn)定劑降低高鹽、干旱等極端環(huán)境脅迫對植物的危害[16-17]。本研究結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥葉片脯氨酸的含量顯著低于野生型擬南芥,該結(jié)果進(jìn)一步表明,在鹽脅迫條件下,脯氨酸也許是一個(gè)導(dǎo)致轉(zhuǎn)JcHDZ28基因擬南芥具有更高敏感性的因子。以上結(jié)果進(jìn)一步表明,鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥的破壞程度顯著高于野生型擬南芥。

除了上述生理指標(biāo)外,轉(zhuǎn)基因植物對鹽脅迫敏感性的增加也歸因于非生物脅迫響應(yīng)基因的下調(diào)表達(dá)[18]。例如,HsfA3s通過降低非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因植物對鹽脅迫的敏感性[18]。與此類似,在我們的研究中,在鹽脅迫條件下,一些非生物脅迫應(yīng)答基因 (SNAC1、AtCATA、LEA3和P5CS1)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的相對表達(dá)量顯著低于在野生型擬南芥中的相對表達(dá)量。綜上,過表達(dá)JcHDZ28降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的抗性可能是因?yàn)榻档土朔巧锩{迫相關(guān)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果將有助于我們進(jìn)一步了解HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因JcHDZ28在麻風(fēng)樹中的生理功能。