參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠血管內(nèi)皮損傷的影響及機(jī)制

郭 倩,劉豐進(jìn),康 海,鄭鑫寅

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東 青島 266300;2. 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院,山東 煙臺(tái) 264000)

膿毒癥時(shí)全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致多器官損害,其中作為維持正常血管通透性和凝血功能的血管內(nèi)皮屏障完整性被破壞,導(dǎo)致血管通透性增加, 引起血管滲漏、循環(huán)血容量減少、凝血功能障礙、微血栓形成等。因此, 維持血管內(nèi)皮的完整性, 抑制凝血功能的異常是膿毒癥治療的重要環(huán)節(jié)[1-3]。參附注射液源于經(jīng)典名方參附湯,具有抗炎、抗氧化以及改善能量代謝等作用,被《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克指南》推薦用于治療膿毒癥[4]。既往研究證實(shí),參附注射液可以改善休克患者血流動(dòng)力學(xué)與內(nèi)皮功能,降低血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6) 、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平,減輕炎癥反應(yīng)[5];還可保護(hù)冠心病合并心力衰竭患者血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制血小板活化,抗血管炎癥反應(yīng)[6]。本研究探討了參附注射液對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔制備的膿毒癥大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及其可能機(jī)制,為膿毒癥的治療提供新的干預(yù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 48只SPF級(jí)7～8周齡成年雄性SD大鼠,購自濟(jì)南朋悅有限公司,許可證號(hào):SCXY(魯)2022 0006。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在21～23 ℃,30%～40%濕度和12 h明暗循環(huán)環(huán)境中,飼養(yǎng)期間大鼠可隨意獲取食物和水。本研究經(jīng)青島大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[煙毓醫(yī)倫審(2023-255)號(hào)] ,所有操作符合國家頒布的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理的相關(guān)要求。

1.2主要試劑及儀器 兔抗大鼠核因子κB抑制蛋白α(IKBα)抗體、p-IKBα抗體、核因子-κB(NF-κB)抗體、p-NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology公司),TNF-α、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、組織因子(TF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、血管性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);正置顯微鏡(LEICA DMLB2),OD450酶標(biāo)儀(Multiskau FC),高速冷凍離心機(jī)(ST16R),超低溫冰箱,冰凍切片機(jī)(LEICA CM3050S),組織研磨儀(ZHFB-CL-48),化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(ChemiScope6200Touch)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將預(yù)飼養(yǎng)7 d的48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、膿毒癥組和參附注射液組,每組16只。膿毒癥組和參附注射液組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)[7]:術(shù)前禁食12 h,自由飲水,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后腹部備皮,沿腹中線做長2 cm的切口暴露盲腸,用3-0絲線高位結(jié)扎盲腸(盲腸的35%),并用18G針頭從盲腸系膜緣向?qū)?cè)貫穿,擠出少量腸內(nèi)容物后還納盲腸,縫合開腹部位。假手術(shù)組僅開腹翻動(dòng)盲腸,不進(jìn)行結(jié)扎、穿孔。每組操作結(jié)束后均予以皮下注射預(yù)熱生理鹽水(37 ℃,50 mL/kg)復(fù)蘇大鼠。術(shù)后將各組大鼠放回籠中,自由獲取食物和水。術(shù)后1 h開始,參附注射液組給予參附注射液[華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司、國藥準(zhǔn)字Z51020664]6 mL/kg腹腔注射(考慮操作難度及給藥劑量,故選擇藥物吸收與靜脈給藥相似、生物利用度稍差于靜脈給藥,但操作更簡(jiǎn)便的腹腔注射),假手術(shù)組和膿毒癥組在相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積的生理鹽水腹腔注射,大鼠給藥劑量通過人與動(dòng)物等效劑量換算確定,大鼠給藥時(shí)間均每隔12 h 1次。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及存活率 從大鼠術(shù)后清醒開始,實(shí)時(shí)觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、排便、對(duì)刺激的反應(yīng)、活動(dòng)等行為學(xué)表現(xiàn),記錄各組大鼠存活時(shí)間,計(jì)算各組大鼠術(shù)后48 h存活率。

1.4.2腸管肉眼所見及主動(dòng)脈組織病理形態(tài) 術(shù)后48 h,處死每組存活大鼠,開腹觀察腸管情況;開胸取部分主動(dòng)脈組織,用OCT膠包埋,進(jìn)行冰凍切片(切片厚度10 μm)。按HE試劑盒操作流程進(jìn)行固定、染色、分化、脫水、透明、封片操作后,光鏡下觀察。

1.4.3血清炎癥因子及血管損傷、凝血系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)水平 取術(shù)后48 h各組存活大鼠心室血,置于離心管中室溫靜置30 min后,用低溫高速臺(tái)式低溫離心機(jī)(4 ℃、3 000 r/min)離心10 min,取上清液保存于-80 ℃冰箱中,按TNF-α、IL-10、TF、TM、vWF、PAI-1試劑盒操作流程進(jìn)行稀釋、加樣、洗板,加入工作液后再次洗板,室溫暗處反應(yīng)后加入終止液,經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。

1.4.4主動(dòng)脈組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取術(shù)后48 h各組存活大鼠主動(dòng)脈組織,加入高效RIPA裂解液,于組織研磨儀中勻漿2 min,冰上放30 min,然后4 ℃下10 000 r/min離心10 min,將上清移至另一預(yù)冷的EP管中,沉淀?xiàng)壷?BCA 法測(cè)定蛋白含量后,將剩余蛋白樣品加入5×上樣緩沖液,沸水中煮5 min,而后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,蛋白樣品中分別滴加兔抗大鼠p- NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κBp65(1∶1000)、p-IKBα(1∶1000)、IKBα(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜;第2天加入對(duì)應(yīng)的羊抗兔二抗,搖床室溫孵育1 h。ECL發(fā)光顯色,掃描。用Image J軟件計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量,其中p- NF-κB p65、p-IKBα以和總蛋白的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及存活率 假手術(shù)組大鼠毛發(fā)均勻有光澤,反應(yīng)敏捷,精神、食欲、大小便均正常。膿毒癥組大鼠毛發(fā)束立,身體蜷縮,對(duì)外界反應(yīng)遲鈍,部分大鼠扎堆取暖,不活動(dòng),不進(jìn)食、進(jìn)水,腹瀉,鼻及眼部可見滲血。與膿毒癥組比較,參附注射液組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)、活動(dòng)度、腹瀉、鼻及眼部滲血等多種情況均有明顯好轉(zhuǎn)。造模12 h后開始出現(xiàn)死亡大鼠,參附注射液組干預(yù)后死亡大鼠減少,術(shù)后48 h假手術(shù)組大鼠均存活,膿毒癥組存活6只(37.5%),參附注射液組存活10只(62.5%),參附注射液組大鼠存活率明顯高于膿毒癥組(P<0.05)。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和膿毒癥各組大鼠48 h存活率

2.2大鼠腸管肉眼所見及主動(dòng)脈組織病理形態(tài)假手術(shù)組剖開腹腔可見腸管結(jié)構(gòu)正常,無粘連水腫,顏色正常;光鏡下顯示主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑,內(nèi)膜下細(xì)胞排列整齊,內(nèi)彈力層和中層平滑肌層次分明。膿毒癥組腸道黏膜充血水腫、壞死,腸管與周圍器官包裹粘連,不易剝離,有惡臭味;光鏡下顯示主動(dòng)脈組織染色不均,內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫脹、脫落,內(nèi)彈力膜斷裂,平滑肌排列紊亂,炎癥細(xì)胞浸潤。參附注射液組腸道水腫、壞死情況及光鏡下主動(dòng)脈病理改變較膿毒癥組減輕。見圖2。

圖2 假手術(shù)組和膿毒癥各組大鼠術(shù)后48 h主動(dòng)脈組織病理形態(tài)(HE染色,×400)

2.3大鼠血清炎性因子水平 膿毒癥組和參附注射液組大鼠外周血中TNF-α、IL-10水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),參附注射液組外周血中TNF-α、IL-10水平均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 假手術(shù)組和膿毒癥各組大鼠術(shù)后48 h外周血中TNF-α、IL-10水平

2.4大鼠血清血管內(nèi)皮損傷及凝血指標(biāo)水平 膿毒癥組和參附注射液組大鼠外周血中TF、TM、vWF、PAI-1水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),參附注射液組外周血中TF、TM、vWF、PAI-1水平均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 假手術(shù)組和膿毒癥各組大鼠術(shù)后48 h外周血中TF、TM、vWF、PAI-1水平

2.5大鼠主動(dòng)脈組織中IKBα、NF-κB p65及其磷

酸化蛋白表達(dá)情況 膿毒癥組和參附注射液組大鼠主動(dòng)脈組織中p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),參附注射液組主動(dòng)脈組織中p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 假手術(shù)組和膿毒癥各組大鼠術(shù)后48 h主動(dòng)脈組織中IKBα、NF-κB p65及其磷酸化蛋白表達(dá)情況

3 討 論

膿毒癥時(shí)機(jī)體炎癥反應(yīng)被激活,細(xì)胞釋放出大量炎性介質(zhì),對(duì)組織和器官造成損傷,其中血管內(nèi)皮是膿毒癥病原體及其毒素破壞的關(guān)鍵宿主靶點(diǎn)之一[8]。大量的炎性介質(zhì)附著于血管壁內(nèi)皮細(xì)胞,使內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,進(jìn)而釋放TF、vWF等凝血系統(tǒng)相關(guān)物質(zhì),影響凝血功能[3]。既往研究顯示,約20%膿毒癥患者的死亡原因與血管內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)[9]。參附注射液在近年來的研究中越來越多地被證實(shí)具有抗氧自由基、減輕鈣超載、抑制中性粒細(xì)胞激活和炎癥介質(zhì)釋放的作用,可以改善膿毒癥及膿毒性休克患者血流動(dòng)力學(xué),緩解炎癥反應(yīng),可能具有保護(hù)血管內(nèi)皮以改善微循環(huán)障礙等功效[10];體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制HMGB1/NF-κB信號(hào)通路的活化,從而減少炎癥因子的分泌[11]。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確參附注射液是否具有血管保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

NF-κB的上游因子通過識(shí)別多種內(nèi)源性配體及細(xì)胞外基質(zhì)的某些成分,活化NF-κB信號(hào)通路,NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)促炎基因等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8等多種炎性因子的活化和表達(dá),介導(dǎo)炎癥損傷。TNF-α作為機(jī)體受到有害刺激后最初分泌的重要炎性因子,在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最先被激活,可啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路活化后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)IL-6、IL-10等多種炎性因子表達(dá),引發(fā)炎癥風(fēng)暴,且TNF-α具有強(qiáng)促凝血的作用[12]。膿毒癥發(fā)生后,大量促炎因子產(chǎn)生,使得抑炎因子IL-10開始生成、釋放, 減輕炎癥反應(yīng), 從而引起免疫抑制和延長低炎癥反應(yīng)時(shí)間,IL-10在機(jī)體抑炎及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[13]。盡管IL-10是一種抗炎因子,但其過度升高也可加重炎癥反應(yīng),并預(yù)示預(yù)后不良[14]。本研究中膿毒癥組和參附注射液組大鼠外周血中TNF-α、IL-10水平和主動(dòng)脈組織中p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組,可能與膿毒癥發(fā)生后,血管內(nèi)皮損傷,炎癥因子釋放失控,TNF-α、IL-10水平急劇升高,啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路活化后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)多種炎性因子表達(dá),引發(fā)炎癥風(fēng)暴,促炎與抗炎介質(zhì)失衡有關(guān);參附注射液組上述各指標(biāo)均明顯低于膿毒癥組,提示參附注射液干預(yù)可明顯降低炎癥因子水平,抑制NF-κB信號(hào)通路活化。

膿毒癥患者血管內(nèi)皮損傷后導(dǎo)致的凝血功能障礙是膿毒癥高病死率的重要原因之一,其主要病理生理機(jī)制包括凝血激活、生理性抗凝和纖溶受損[15]。生理?xiàng)l件下,血液vWF表達(dá)水平很低,但在血管內(nèi)皮細(xì)胞受刺激或損傷后,vWF可被大量釋放入血,因而vWF是一種可以反映內(nèi)皮細(xì)胞受損和功能障礙的生物標(biāo)志物[16],是膿毒癥診斷、嚴(yán)重程度分層的重要指標(biāo),亦與不良預(yù)后密切相關(guān)[17]。本研究顯示膿毒癥血管內(nèi)皮損傷后vWF明顯升高,而參附注射液干預(yù)可有效降低其水平,證實(shí)參附注射液對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮損傷具有一定的保護(hù)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞被炎癥介質(zhì)刺激也可產(chǎn)生TF,TF作為體內(nèi)凝血過程的主要啟動(dòng)劑,由TF和VIIa因子組成的復(fù)合物催化非活性X因子轉(zhuǎn)化為活性形式,從而激活凝血[18]。TM可與凝血酶結(jié)合形成復(fù)合物促進(jìn)蛋白C活化發(fā)揮抗凝作用,在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí),TM能夠被血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放出來,導(dǎo)致血液中TM水平增高,同時(shí)血管壁細(xì)胞膜上TM減少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損,又削弱了自身的抗凝作用。PAI-1的表達(dá)主要局限于內(nèi)皮細(xì)胞,其通過抑制纖溶酶原活化維持纖溶平衡,膿毒癥時(shí)機(jī)體內(nèi)纖維蛋白溶解停止并阻止纖維蛋白的清除,進(jìn)一步加劇微血管血栓形成。PAI-1和凝血酶激活纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)水平的升高與嚴(yán)重膿毒癥患者的器官衰竭和不良預(yù)后相關(guān)[19]。近年來研究表明,TM被視為一種反映內(nèi)皮損傷的敏感標(biāo)志物,但是不能作為單一的預(yù)測(cè)因子[20]。本實(shí)驗(yàn)中膿毒癥組大鼠外周血中vWF、TF、TM、PAI-1水平均明顯高于假手術(shù)組,進(jìn)一步證明了膿毒癥期間內(nèi)皮細(xì)胞的激活以及纖溶受損;參附注射液組vWF、TF、TM、PAI-1水平均明顯低于膿毒癥組,說明參附注射液可改善膿毒癥誘發(fā)的凝血功能障礙,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述,參附注射液可通過抑制IKBα/NF-κB通路活化,減輕膿毒癥造成的炎癥反應(yīng),對(duì)血管內(nèi)皮及凝血功能起到一定的保護(hù)作用,為臨床治療膿毒癥患者凝血功能障礙提供了一個(gè)新的方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。