壯醫(yī)經(jīng)筋推拿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠去泛素化酶BRCC3介導(dǎo)NLRP3去泛素化修飾的影響及鎮(zhèn)痛機制

王天翊,唐宏亮,梁英業(yè),龐 軍,盧棟明,唐業(yè)妮,鄭玉嬌,何育風(fēng)

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530000;2. 防城港市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 防城港 538000;3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530000)

神經(jīng)病理性疼痛(NPP)臨床癥狀復(fù)雜多樣且發(fā)病率高,以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為主要特征[1-3],我國NPP患者達數(shù)千萬人,并呈現(xiàn)逐年上升的發(fā)展趨勢。壯醫(yī)經(jīng)筋推拿療法是在中醫(yī)十二經(jīng)筋理論結(jié)合壯醫(yī)學(xué)“三道兩路”理論及“筋結(jié)”致痛學(xué)說指導(dǎo)下的一種民族療法,其特色技術(shù)是“查灶術(shù)”和“松筋術(shù)”。前期研究證明,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿可通過減少炎癥因子釋放起到鎮(zhèn)痛效果[4-6],但其具體起效機制研究尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)活化的啟動過程中發(fā)生了去泛素化,泛素標(biāo)記NLRP3翻譯后的狀態(tài)導(dǎo)致NLRP3不能寡聚化,只有啟動信號激活去泛素化酶BRCC3,作用于NLRP3使其去泛素化后才可激活炎癥因子[7-8]。故本實驗觀察了壯醫(yī)經(jīng)筋推拿對去泛素化酶BRCC3介導(dǎo)NLRP3去泛素化修飾的影響,從泛素化角度探討推拿鎮(zhèn)痛的機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 45只健康雌性SD大鼠,SPF級,6～8周齡,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘) 2019-0004,使用許可證號:SYXK(桂)2019-0001。大鼠單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,室溫保持20～25 ℃,濕度35%～45%,自由飲用自來水,飼用普通清潔鼠飼料,每日更換籠具與墊料。所有的實驗操作嚴(yán)格參照廣西中醫(yī)藥大學(xué)規(guī)定的關(guān)于實驗動物的飼養(yǎng)與使用的規(guī)定以及清醒狀態(tài)下的動物進行疼痛實驗的操作指南進行,且實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查并批準(zhǔn)(DW20230302-017)。

1.2試劑與儀器 Life TRIzol Reagent RNA提取試劑(美國Life Invitrogen公司,貨號:15596026),GoScriptTMReverse Transcriptase[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd,貨號:A5000],GoTaq?qPCR Master Mix[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd,貨號:A6001],白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,48T,貨號:E-EL-R0567c)。 YI-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠),高速冷凍離心機(美國Thermo公司,型號:ST16R),全波長多功能酶標(biāo)儀(北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司,型號:Infinite M200 PRO),NanoDrop儀器(美國賽默飛公司,型號:ND-ONE-W),熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號:Roche Light Cycler 96),按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號:ZL 200710187403.1),Von Frey機械刺痛測試包(上海軟隆科技發(fā)展有限公司,型號:BW806),熱板痛覺測試儀(美國IITC公司)。

1.3實驗方法 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為5組,每組9只。模型組、假推拿組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組大鼠參照文獻[6]方法建立神經(jīng)病理性疼痛模型:術(shù)前12 h禁食,采用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉后,將大鼠俯臥固定頭和四肢,定位兩側(cè)髂后上嵴,在左側(cè)髂后上棘與脊柱之間且平行于脊柱方向做一長約2 cm縱向切口,鈍性分離各層組織,用咬骨鉗夾斷橫突,鈍性分離L5脊神經(jīng),用5-0的可吸收性羊腸線雙層結(jié)扎,清洗后縫合傷口,對側(cè)不進行任何處理。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上,但僅暴露脊神經(jīng)而不結(jié)扎;正常組僅進行日常飼養(yǎng)。于術(shù)后第1天開始,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組用布袋束縛大鼠后,采用按摩推拿手法模擬儀依次刺激脊神經(jīng)結(jié)扎節(jié)段相應(yīng)體表部位及所結(jié)扎神經(jīng)支配區(qū)域(以1 cm為間隔),再選擇腰部及下肢2個治療點(模擬腰椎間盤突出癥疼痛部位),以臨床常用松筋解結(jié)手法的點、撥、揉法,采用按摩推拿手法模擬儀并用4N的按摩力量以直徑10 mm的圓形光滑接觸面按摩頭進行推拿,每法每處各推拿1 min,每只大鼠每天共治療9 min,連續(xù)干預(yù)14 d;假推拿組大鼠每天采用布袋束縛后輕輕撫摸其雙側(cè)后肢9 min,連續(xù)干預(yù)14 d;其他3組都不進行干預(yù),只觀察14 d。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1痛覺閾值 分別于術(shù)前及術(shù)后1 d、3 d、14 d進行測定。機械性痛閾值測定參考文獻[9]:設(shè)定室溫為25 ℃,將大鼠置于四周粘上紅紙、底層為鐵絲網(wǎng)的籠子內(nèi),待大鼠適應(yīng)15 min后,采用VonFrey纖維絲依次加大力度刺激手術(shù)側(cè)后肢足底中部,每次持續(xù)刺激3～4 s,記錄大鼠最小的后足收縮閾值。熱痛覺閾值測定方法參考文獻[10]:設(shè)定室溫為25 ℃,熱板痛覺測試儀調(diào)至(55±0.2)℃,將大鼠放置于測試儀的封閉且透明玻璃盒內(nèi)并啟動計時器,當(dāng)觀察到大鼠出現(xiàn)快速抬足、頻繁舔足等現(xiàn)象時停止計時并做記錄。2種測定方法均連續(xù)測定3次,每次間隔5 min,取平均值。

1.4.2脊髓背角中BRCC3和NLRP3 mRNA表達情況 術(shù)后14 d處死各組大鼠,迅速取出L4-6脊髓背角組織,立即放入液氮冷卻后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。運用TRIzol法提取大鼠脊髓背角組織中總RNA,加入1 mL TRIzol試劑將組織研磨成勻漿后,按試劑說明書提取RNA,使用 NanoDrop儀器測定RNA濃度和純度,采用GoScriptTMReverse Transcriptase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增。以β-actin為內(nèi)參,于NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢BRCC3、NLRP3的引物序列,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成并純化,引物序列見表1。PCR擴增反應(yīng)的總體積為20 μL,包括Nuclease-Free Water 7.2 μL、上下游引物各0.4 μL、GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 2 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 min;變性擴增95 ℃ 15 s、退火60 ℃ 1 min,共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,采用2-ΔΔCT法計算BRCC3、NLRP3 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.4.3血清IL-1β水平 取各組大鼠腹主動脈血,在4 ℃下以3 000 r/min的速度離心15 min,收集上層血清,采用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠機械性痛覺閾值比較 術(shù)后1 d、3 d,各手術(shù)組大鼠的機械性痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),模型組、假推拿組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);術(shù)后14 d,正常組、假手術(shù)組和壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組大鼠的機械性痛覺閾值均明顯高于模型組和假推拿組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠機械性痛覺閾值比較

2.2各組大鼠熱痛覺閾值比較 術(shù)后1 d,各手術(shù)組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),各手術(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);術(shù)后3 d,各手術(shù)組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),假手術(shù)組和壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組均明顯高于模型組和假推拿組(P均<0.05),壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后14 d,假手術(shù)組、模型組、假推拿組大鼠的熱痛覺閾值均明顯低于正常組(P均<0.05),假手術(shù)組明顯高于模型組(P<0.05),壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組明顯高于模型組、假推拿組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠熱痛覺閾值比較

2.3各組大鼠脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較 術(shù)后14 d,正常組與假手術(shù)組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);模型組和假推拿組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量均明顯高于正常組和假手術(shù)組(P均<0.05),壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量均明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05)。見表4。

表4 正常組、假手術(shù)組和神經(jīng)病理性疼痛各組大鼠術(shù)后14 d脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量比較

2.4各組大鼠血清IL-1β水平比較 正常組、假手術(shù)組、模型組、假推拿組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組血清IL-1β水平分別為(50.50±2.39)pg/mg、(57.46±1.42)pg/mg、(71.03±0.96)pg/mg、(63.38±1.25)pg/mg、(53.41±1.72)pg/mg,模型組明顯高于正常組和假手術(shù)組(P均<0.05),壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05)。

3 討 論

壯醫(yī)是認(rèn)識人體的基本理論,可以統(tǒng)稱為“三道兩路”,其內(nèi)涵是指“水道”“谷道”“氣道”以及“火路”“龍路”。龍路在人體內(nèi)指血液運行的通路,火路則可與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中人體的神經(jīng)系統(tǒng)相對應(yīng)。基于以上認(rèn)識,壯醫(yī)提出“因結(jié)致痛”:各種病理性因素的作用下,導(dǎo)致局部組織受力不平衡,產(chǎn)生病理性損傷,形成“橫絡(luò)”“條索”與“結(jié)節(jié)”等局部病灶即筋結(jié),筋結(jié)在龍路中積聚進而造成龍路的血液循環(huán)障礙,同時又因為龍路血液循環(huán)的異常,對火路產(chǎn)生作用,產(chǎn)生相關(guān)疼痛信號并通過火路傳入大腦(“巧塢”),最終導(dǎo)致龍路不通、火路失調(diào)而發(fā)病。壯醫(yī)經(jīng)筋手法以松結(jié)、解結(jié)、破結(jié)為治療原則。在手法操作過程中,壯醫(yī)注重“以灶為腧的原則”,治療前先沿著經(jīng)筋的尋行路線探索結(jié)節(jié)部位,以方便治療中著重施術(shù)[11],以充分發(fā)揮松解經(jīng)筋循行之處的緊繃狀態(tài),恢復(fù)經(jīng)筋氣血循行的作用。

泛素化主要是指泛素在多種酶的作用下,識別細(xì)胞內(nèi)靶蛋白,并結(jié)合至靶蛋白的過程。去泛素化指泛素分子通過去泛素化酶水解C-端羧基與靶蛋白賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基或α-氨基之間的異肽鍵,即將蛋白底物中的泛素鏈水解開,從而使26S蛋白酶體途徑和溶酶體途徑無法水解底物[12]。NLRP3的活化過程中,首先是泛素標(biāo)記NLRP3翻譯產(chǎn)物使其不能寡聚化,直到去泛素化酶BRCC3被其他因子激活,才使NLRP3去泛素化從而具有活性[7-8]。

炎癥小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,主要由炎性蛋白傳感器分子、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和 酶原pro-Caspase-1組成,其進一步介導(dǎo)pro-IL-1β的成熟和分泌,作為該炎癥小體活化的必要條件[13],它在炎癥及NPP中發(fā)揮重要作用[14]。NLRP3是NOD樣受體家族中的重要成員,ASC介于NLRP3與 pro-Caspase-1之間,NLRP3與ASC相互作用從而激活pro-Caspase-1使其自我切割形成Caspase-1,NLRP3進一步使具有生物活性的Caspase-1裂解GasderminD,從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。1L-1β在炎癥疾病過程中發(fā)揮重要作用[15],其前體形式為無活性的 pro-IL-1β,NLRP3炎癥小體可以介導(dǎo)其成熟,使其成為具有生物學(xué)活性的IL-1β[16],然后分泌到細(xì)胞外,產(chǎn)生局部或者全身的炎癥反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示,短時間的推拿干預(yù)對NPP大鼠機械性痛覺閾值影響并不明顯;壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組術(shù)后3 d的熱痛覺閾值和術(shù)后14 d的機械性痛覺閾值、熱痛覺閾值均明顯升高,提示推拿一段時間后降低了NPP大鼠的痛敏反應(yīng),大鼠對于熱刺激的反應(yīng)較機械性刺激的反應(yīng)更為敏感。術(shù)后14 d,模型組脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA表達上調(diào),血清IL-1β水平增高,提示脊神經(jīng)損傷促使脊髓部位去泛素化酶BRCC3、NLRP3及炎癥因子過表達;壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組脊髓背角中BRCC3、NLRP3 mRNA相對表達量及血清IL-1β水平均較模型組降低,表明壯醫(yī)經(jīng)筋推拿能夠抑制NPP大鼠脊髓背角去泛素化酶BRCC3的表達,抑制NLRP3的去泛素化修飾,從而阻止NLRP3的活化,阻礙IL-1β的成熟和分泌。假推拿組各指標(biāo)較模型組有改善,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,提示假推拿可以使大鼠情緒得到安撫,疼痛狀態(tài)有所緩解,但效果非常有限。

綜上所述,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿可能通過抑制去泛素化酶BRCC3的表達,抑制NLRP3的去泛素化修飾,從而阻止了NLRP3的活化,進而阻礙炎癥因子IL-1β的成熟和分泌,起到鎮(zhèn)痛作用,為壯醫(yī)經(jīng)筋推拿治療NPP提供了新思路。但因NPP發(fā)病機制復(fù)雜,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿的鎮(zhèn)痛靶點及途徑還需進一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。