高效液相色譜法測定炒榧子仁飲片中油酸和亞油酸含量*

李志霞，李翠華，侯金良，李正國

（山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 濟寧 272000）

榧樹主要分布于長江流域以南地區(qū)的浙江、安徽、江蘇、福建、湖南、湖北、江西、四川、云南、貴州等省，其中浙江省資源最多［1-2］。香榧的主要產(chǎn)區(qū)為會稽山的諸暨、紹興、東陽、嵊州、磐安等，諸暨市種植面積最廣，產(chǎn)量最大，品質(zhì)最佳，有“中國香榧之鄉(xiāng)”之稱［3-5］。榧子為紅豆杉科植物榧Torreya grandisFort. 的干燥成熟種子［6］，炒制加工后香脆味美，營養(yǎng)價值極高。榧子仁中富含脂肪油、蛋白質(zhì)、碳水化合物［7-10］，其中脂肪酸多為不飽和脂肪酸，并含有19 種氨基酸和192 種礦物元素［11-13］。榧子為我國傳統(tǒng)驅(qū)蟲中藥，同時又是特有的珍稀干果，營養(yǎng)豐富，為藥食同源中藥［14］。榧子的營養(yǎng)價值及其藥效均與榧子所含成分直接相關(guān)，受采種時間及種子成熟度的影響，榧子所含成分的含量波動較大［15］。研究表明，香榧子油具有調(diào)血脂、降低血清膽固醇的作用，可軟化血管，促進血液循環(huán)，調(diào)節(jié)老化的內(nèi)分泌系統(tǒng)［16-17］，對動脈粥樣硬化形成的預防作用明顯［18］。目前，市場上的榧子產(chǎn)地較多，而各地炮制規(guī)范中的榧子仁只進行了常規(guī)定性檢驗，無法控制其內(nèi)在質(zhì)量。榧子仁油脂中含有7種脂肪酸，以亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸為主，不飽和脂肪酸占脂肪酸總數(shù)的79.41%［19］。故本研究中建立了測定炒榧子仁飲片中油酸和亞油酸含量的高效液相色譜（HPLC）法，以有效控制飲片質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 2030C 3D 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配有二極管陣列檢測器；XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；SK8200LHC 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司，功率為500 W，頻率為53 kHz）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；磷酸（色譜純，美國Tedia 公司）；水為娃哈哈純凈水；亞油酸對照品（批號為111622-201704，含量為99.8%），油酸對照品（批號為111621-201707，含量為99.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；榧子仁飲片（編號為1 - 13，樣品信息見表1），其中7 批藥材為生品，6 批藥材按2020年版《中國藥典（四部）》通則0213項下炮制通則及2012年版《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》項下方法，委托山東嘉泰中藥飲片有限公司炒制。

表1 榧子仁飲片樣品信息Tab.1 Information of Torreyae Semen Tostum samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ThermoHypersilGoldC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（78∶22，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按亞油酸峰計應不低于5 000，且分離度不小于1.5。色譜圖見圖1。

1. 亞油酸 2. 油酸圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖1.Linoleic acid 2.Oleic acidFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取亞油酸對照品47.14 mg、油酸對照品58.02 mg，精密稱定，分別置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，即得亞油酸和油酸對照品貯備液。分別精密吸取亞油酸對照品貯備液15.00 mL、油酸對照品貯備液5.00 mL，置同一50 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含亞油酸0.141 14 mg、油酸0.057 96 mg 的混合溶液，即得混合對照品溶液A。分別精密吸取亞油酸對照品貯備液15.00 mL、油酸對照品貯備液5.00 mL，置同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含亞油酸0.070 57 mg、油酸0.028 98 mg 的混合溶液，即得混合對照品溶液B。

供試品溶液：取樣品粉末（過2 號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為53 kHz）60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液A 2，4，6，8，10，12，14，16 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得亞油酸回歸方程Y=1 617 755X+19 734（R2=1.000 0，n=8），得油酸回歸方程Y=445 735.49X-731.36（R2=1.000 0，n= 8）。結(jié)果表明，亞油酸的進樣量在0.282 3～2.258 2 μg、油酸的進樣量在0.115 9～0.927 4 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液B 10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果亞油酸峰面積的RSD為0.56%（n=6），油酸峰面積的RSD為0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20201103）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果亞油酸平均含量為4.787 mg/g、RSD為0.69%（n=6），油酸平均含量為1.576 mg/g、RSD為0.50%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20201103）0.5 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，100，200，300，400，500，600，700 min 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果亞油酸峰面積的RSD為0.33%（n=8），油酸峰面積的RSD為0.91%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置700 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20201103）9 份，每份約0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入亞油酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.559 0 mg/mL）和油酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.210 7 mg/mL）1，2，3 mL，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 炒榧子仁飲片中亞油酸和油酸加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of linoleic acid and oleic acid in Torreyae Semen Tostum（n = 9）

2.4 樣品含量測定

取樣品（編號為1-13）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定2次，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果見表3。

表3 炒榧子仁飲片中亞油酸和油酸含量測定結(jié)果（%，n=2）Tab.3 Results of the content determination of linoleic acid and oleic acid in Torreyae Semen Tostum（%，n = 2）

3 討論

3.1 含量限度擬訂

由表3 可知，不同產(chǎn)地和同一產(chǎn)地、不同批次的炒榧子仁飲片中亞油酸和油酸含量差異較大，這與藥材不同產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候條件、采收加工等直接相關(guān)。含量限度制訂中，去除含量明顯偏低的13號樣品和含量明顯偏高的3號樣品，計算亞油酸和油酸的平均總含量為（0.65±0.34）%，則最小值為0.31%，故建議炒榧子仁飲片中亞油酸和油酸的總含量不得低于0.30%。

3.2 提取方法選擇

曾對提取溶劑（甲醇、90%甲醇、80%甲醇）、提取方法（超聲提取和加熱回流提取）、提取時間（超聲提取30，45，60 min）進行了考察。結(jié)果以甲醇為提取溶劑時提取效果較好；超聲提取和加熱回流提取效果相同，超聲提取30 min 提取不完全，提取45 min 和60 min 的效果相同，但炒榧子仁油性大，粉碎后黏度大，提取過程中不易分散。故最終確定樣品提取方法為以甲醇為提取溶劑，超聲提取60 min。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結(jié)果準確，可用于炒榧子仁飲片中油酸和亞油酸的含量測定。建議炒榧子仁飲片中油酸和亞油酸的總含量不得低于0.30%。