鹽酸賴氨酸（注射用）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究

黃 逯，謝 鵬

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

賴氨酸是人體8種必需氨基酸之一，能改善人類膳食營養(yǎng)，促進(jìn)人體的健康發(fā)育，增強免疫力，提高中樞神經(jīng)功能［1-3］，臨床主要用于顱腦外傷、慢性腦組織缺血及缺氧性疾病的神經(jīng)元保護(hù)［4-5］，可提高血腦屏障通透性，幫助藥物進(jìn)入腦細(xì)胞。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，細(xì)菌死亡或自溶后釋放出來，極微量內(nèi)毒素進(jìn)入人體即可產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)［6］，大量內(nèi)毒素易導(dǎo)致休克、多器官衰竭甚至死亡［7-9］。發(fā)熱是鹽酸賴氨酸的不良反應(yīng)［10］，以鹽酸賴氨酸（注射用）作為注射劑的原料藥時必須嚴(yán)格控制其生產(chǎn)質(zhì)量及細(xì)菌內(nèi)毒素含量。細(xì)菌內(nèi)毒素按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［11］檢測，通常采用鱟試劑試驗法［12］檢測，包括凝膠法及光度測定法。其中，凝膠法是檢測細(xì)菌內(nèi)毒素最常用的方法，光度測定法包括濁度法和顯色基質(zhì)法。細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法是以凝膠試驗為基礎(chǔ)發(fā)展起來的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測方法［13-14］，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的內(nèi)毒素含量進(jìn)行定量檢測［15］，利用細(xì)菌內(nèi)毒素在鱟試劑形成凝膠過程中的濁度變化定量測定細(xì)菌內(nèi)毒素。本研究中參照2020年版《中國藥典（四部）》通則1143項下方法，采用凝膠法和動態(tài)濁度法進(jìn)行鹽酸賴氨酸（注射用）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan ET 型酶標(biāo)儀（定量內(nèi)毒素專用，美國Thermo Fisher公司）；ME204型電子天平（精度為萬分之一），Seven excellence 型多參數(shù)測定儀，均購于Mettler Toledo 公司；GR110DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（致微＜廈門＞儀器有限公司）；VORTEX 型周圍振蕩器（德國IKA公司）；DKB- 8A 型電熱恒溫槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸賴氨酸（注射用，廣西南寧邕江藥業(yè)有限公司，批號分別為22060701，22060801，22060901）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號為2105281，效價為每支10 EU）；鱟試劑（KTA，靈敏度為10～0.005 EU/ mL，規(guī)格為每支1.25 mL，批號為2203090），鱟試劑（TAL-1，靈敏度為0.25 EU/mL，規(guī)格為每支0.1 mL，批號為2012101），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，批號為2105140，規(guī)格為每瓶50 mL），Tris緩沖液（批號為2104210，規(guī)格為每支4.0 mL），均購于湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（TAL-2，湛江博康海洋生物有限公司，批號為2011203，靈敏度為0.25 EU/mL，規(guī)格為每支0.1 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）確定

按規(guī)定，L=K/M，其中K為人最大可接受的內(nèi)毒素劑量［EU/（kg·h）］，鹽酸賴氨酸（注射用）供生產(chǎn)注射劑使用，注射劑K為5 EU/（kg·h）；M為人用最大供試品劑量［mg/（kg·h）］，鹽酸賴氨酸（注射用）臨床1 次最大使用劑量為3.0 g，則成人的最大劑量M為50 mg/（kg·h）。故L為0.1 EU/ mg。根據(jù)注射劑安全性檢查的從嚴(yán)原則，確定鹽酸賴氨酸（注射用）限值為“每1 mg鹽酸賴氨酸中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01 EU”，與2020年版《中國藥典》的要求一致，即擬訂L為0.01 EU/mg。

2.2 凝膠法

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

用BET 溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，并制成2λ，λ，0.5λ，0.25λ4 個濃度的溶液。按《中國藥典》規(guī)定，對鱟試劑的靈敏度進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果2批鱟試劑的測定靈敏度（λc）與標(biāo)示靈敏度（λ）一致。詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab.1 Verification results of the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate

2.2.2 干擾預(yù)試驗

干擾試驗一：根據(jù)公式計算最小有效稀釋濃度（MVC），公式MVC =λ/L。其中，L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.01 EU/mg；λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度。常用的鱟試劑靈敏度為0.03～0.5 EU/ mL，則供試品對應(yīng)有效稀釋濃度為C0.5=0.5/0.01=50 mg/mL，C0.03=0.03/0.01=3 mg/mL。故選擇靈敏度為0.25 EU/mL 的鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)試驗。取樣品（批號為22060701）0.25 g，加BET 5.0 mL溶解成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，用BET稀釋成質(zhì)量濃度分別為25，12.5，6.25，3.125 mg/mL 的系列溶液，作為鱟試劑標(biāo)識靈敏度陽性對照（NPC）；分別在上述系列溶液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的系列溶液，作為供試品陽性對照（PPC）；以BET 為陰性對照（NC）；以含2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的溶液為陽性對照（PC）。取鱟試劑TAL-1 和TAL-2，分別與NPC，PPC，PC 反應(yīng)，各濃度平行2 管，觀察各管的凝膠反應(yīng)。結(jié)果供試品質(zhì)量濃度低于6.25 mg/mL 時對細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品與鱟試劑反應(yīng)無干擾，供試品的其他濃度均干擾較大，試驗無效。詳見表2?？紤]到用BET 溶解后供試品的pH 約為5.4，在最佳測試的（pH 6.0～8.0）。因此，選擇堿性的Tris緩沖液稀釋供試品，提高供試品pH值，進(jìn)行干擾預(yù)試驗二。

干擾預(yù)試驗二：取樣品（批號為22060701）0.25 g，加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解，制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液（pH為7.12），其余操作同干擾預(yù)試驗一，觀察各管的凝膠反應(yīng)。結(jié)果樣品質(zhì)量濃度在3.125～50 mg/mL范圍內(nèi)均無干擾。詳見表3。

表3 鹽酸賴氨酸（注射用）干擾預(yù)試驗二結(jié)果Tab.3 Results of the interference preparatory test Ⅱof Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.2.3 干擾試驗

選擇質(zhì)量濃度為50 mg/ mL 的供試品，靈敏度為0.25 EU/mL 的鱟試劑進(jìn)行試驗。用BET溶解并稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，得最終濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5 EU/mL 系列溶液。取3 批供試品（批號分別為22060701，22060801，22060901）0.25 g，分別加Tris緩沖液5.0 mL 溶解，制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的溶液（pH分別為7.10，7.18，7.13）。設(shè)溶劑系列和樣品系列，取不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液各100 μL，分別加入100 μL鱟試劑水溶液或100 μL 鱟試劑樣品溶液，每個濃度平行4管。陰性對照（NC）和鱟試劑標(biāo)示靈敏度對照（NPC）各設(shè)2 個平行管，反應(yīng)結(jié)果按公式Es=antilg（∑Xs/4）和Et=antilg（∑Xt/4）計算。其中，Xs和Xt分別為溶劑系列、樣品系列各反應(yīng)終點細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后1 個呈陽性結(jié)果的濃度。結(jié)果Es和Et均為0.25 EU/mL，表明質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，3批樣品均無干擾，可采用凝膠法進(jìn)行檢查。詳見表4。

表4 鹽酸賴氨酸（注射用）質(zhì)量濃度為50 mg/mL時的干擾試驗結(jié)果Tab.4 Results of the interference test of Lysine Hydrochloride（for Injection）with mass concentration of 50 mg / mL

2.2.4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，使用2 個不同廠家、靈敏度為0.25 EU/ mL的鱟試劑，對質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的3 批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。詳見表5。

表5 鹽酸賴氨酸（注射用）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3 動態(tài)濁度法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和可靠性分析

用BET 溶解并稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，得濃度為0.12，0.06，0.03，0.015 EU/mL 的系列溶液，每次稀釋于漩渦混合器中混勻30 s，每個濃度平行3 管。用BET 作陰性對照，平行2 管。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液及陰性對照溶液各100 μL，分別加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定。測定條件為溫度（37±0.5）℃，檢測波長405 nm，反應(yīng)時間3 600 s。以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)、反應(yīng)時間的對數(shù)（lgt）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程lgt=2.869 6-0.289 5 lgC，r= -1.000 0（n=4），平行管間的變異系數(shù)（CV）為0.56%～1.89%，均小于2%，陰性對照管反應(yīng)時間大于規(guī)定檢測時間，故細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。詳見表6。

表6 鹽酸賴氨酸（注射用）標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性分析結(jié)果Tab.6 Results of the reliability test of the standard curve of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗

按規(guī)定，最大有效稀釋倍數(shù)按MVD=CL/λ公式計算。式中，L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.01 EU/ mg，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)菌內(nèi)毒素最低濃度0.015 EU/ mL，得到試驗最大稀釋倍數(shù)為66.7倍。

取樣品（批號為22060701）0.50 g，加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的溶液（pH 為6.98），用BET 將上述溶液稀釋成1，2，4，16，64 倍的系列溶液（A 液）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備含細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.06 EU/mL 的上述濃度的供試品溶液（B 液）；細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.12，0.06，0.03，0.015 EU/ mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（C 液）；以BET 為陰性對照溶液（D 液）。取上述溶液100 μL，分別加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定。每個濃度平行2管，計算回收率。回收率（%）=（Cs-Ct）/λm×100%。其中，Ct為供試品溶液中內(nèi)毒素含量，Cs為含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量，λm為0.06 EU/ mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lgt= 2.810 6 -0.306 4 lgC，r= 0.999 5（n= 5）。結(jié)果樣品在稀釋倍數(shù)為1，2，4，16，64倍條件下試驗的干擾性降低，回收率在50%～200%范圍內(nèi)，均符合規(guī)定；且當(dāng)供試品的稀釋倍數(shù)為1，2，4 倍時的回收率較好，且稀釋倍數(shù)較小，引入誤差小。故選擇100，50，25 mg/mL 質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。詳見表7。

表7 鹽酸賴氨酸（注射用）干擾試驗結(jié)果Tab.7 Results of the interference test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3.3 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定結(jié)果

取3 批樣品（批號分別為22060701，22060801，22060901）各0.5 g，分別加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解，成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的溶液（pH 分別為7.01，7.06，7.03），用BET將上述溶液稀釋成1，2，4倍的系列溶液。按2.2.2項下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和陰性對照溶液，選擇0.06 EU/ mL 作為λm，制備含細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為λm的上述供試品濃度的溶液。分別取100 μL，加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定，每個濃度平行2 管。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lgt=2.846 5-0.306 4 lgC，r=0.997 9（n=3）。結(jié)果回收率符合要求，準(zhǔn)確穩(wěn)定，表明供試品在選取的稀釋濃度下對試驗無干擾。詳見表8。

表8 鹽酸賴氨酸（注射用）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.8 Results of the bacterial endotoxin test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

3 討論

鹽酸賴氨酸（注射用）水溶液呈微酸性，pH 值為5.4，已超過細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的適宜范圍。預(yù)試驗中，采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品，凝膠法試驗干擾較強，動態(tài)濁度法試驗結(jié)果顯示回收率均不理想。通過過濾、中和、透析、加熱等方法對樣品進(jìn)行處理，以避免干擾?？紤]pH 值的影響，本研究中采用Tris 緩沖液稀釋樣品，保證樣品pH 值為7.0，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的適宜范圍。結(jié)果凝膠法的干擾較小，且動態(tài)濁度法的試驗回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，可見上述處理方法能消除干擾因素對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的影響。本研究中建立了檢測鹽酸賴氨酸（注射用）中細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠法和動態(tài)濁度法，結(jié)果表明，凝膠法試驗中鹽酸賴氨酸（注射用）的L為0.01 EU/mg，質(zhì)量濃度稀釋至50 mg/mL 時，對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)無明顯干擾；動態(tài)濁度法試驗中，質(zhì)量濃度為100，50，25 mg/ mL 時，回收率為84.75%～96.12%，該系列濃度下對試驗無干擾。在凝膠法中，樣品稀釋較小倍數(shù)，可消除干擾，試驗有效；在動態(tài)濁度法中，較高質(zhì)量濃度可排除干擾，測得定量數(shù)據(jù)。凝膠法和動態(tài)濁度法所選擇的稀釋倍數(shù)均低于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的稀釋倍數(shù)，操作方便快捷，具有檢測范圍寬、靈敏度高的優(yōu)點。

綜上所述，所建立的檢測鹽酸賴氨酸（注射用）細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠法和動態(tài)濁度法均可行，可用于其細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量控制。