土霉素原料及片劑中有關(guān)物質(zhì)測定*

楊天風(fēng)，張少萌，高燕霞，張 冬△

（1. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200； 2. 河北省藥品審評中心，河北 石家莊 050011）

土霉素又名氧四環(huán)素、地霉素等，屬第1 代生物發(fā)酵的四環(huán)素類抗菌藥物［1］。FINLAY 等于1950年自龜裂鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離制得［2］。土霉素作用機制主要為阻止氨酰tRAN 與細菌核糖體結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用，對立克次體、螺旋體、某些原蟲等亦有抑制作用［3-4］。1950年，美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)土霉素上市，我國于1952年開始生產(chǎn)，臨床常用劑型為片劑。土霉素原料收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：抗生素藥品（第一冊）》WS1-C2- 0002- 89［5］（《簡稱部頒標(biāo)準(zhǔn)》）、《英國藥典》（BP2020）［6］、《歐洲藥典10.2》（EP10.2）［7］及《美國藥典42》（USP42）［8］；片劑收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》及USP42。土霉素對光、熱敏感，遇光后顏色逐漸變暗，在pH 過低或過高和加熱條件下易失活。而我國現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對有關(guān)物質(zhì)進行控制，產(chǎn)品存在一定安全隱患。為此，本研究中建立了測定土霉素原料及片劑中有關(guān)物質(zhì)含量的高效液相色譜法［9-13］，在實現(xiàn)有效分離的基礎(chǔ)上，對雜質(zhì)進行定性及限量控制；并根據(jù)國家計劃抽驗工作的部署和要求［14-15］，以該方法作為主要評價方法，對全國抽取的192批次土霉素片劑進行了綜合評價?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器），UV-2450型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu公司；XS205型電子天平（瑞士Mettler公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

土霉素對照品（批號為130487 - 200703，含量為88.8%），四環(huán)素對照品（批號為130306-201419，含量為969 IU/ mg），美他環(huán)素對照品（批號為130499 -200101，含量為90.1%），脫水四環(huán)素對照品（批號為130402 - 200203），脫水差向四環(huán)素對照品（批號為130403 - 200204），4 - 差向四環(huán)素對照品（批號為130401 - 200209），均購自中國食品藥品檢定研究院；4 - 差向土霉素對照品（EPure，批號為E200712 -1020）；α-阿撲土霉素對照品（編號為A1220000），β-阿撲土霉素對照品（編號為A1230000），均購自EP Referrence Standard；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；醋酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、三乙胺（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；土霉素（原料，X，Y，Z 生產(chǎn)企業(yè)；制劑，18 家生產(chǎn)企業(yè)，編號為1-18，共192批次）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD SinoChrom C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為醋酸銨溶液［0.25 mol/L 醋酸銨-0.05 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液- 三乙胺（100∶10∶1，V/V/V），用醋酸調(diào)pH 至7.5］-乙腈（88∶12，V/V），B 為乙腈，梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性溶液：取土霉素對照品（約含3%2-乙酰-2-去酰胺土霉素）適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液適量溶解，用水稀釋成每1 mL 含土霉素0.5 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品細粉適量（約相當(dāng)于土霉素50 mg），精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

自身對照溶液：精密量取供試品溶液2 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，搖勻，即得。

土霉素對照品溶液：取土霉素對照品25.01 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻；精密量取2 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得。

混合雜質(zhì)對照品溶液：取四環(huán)素、美他環(huán)素、脫水四環(huán)素、脫水差向四環(huán)素、4 - 差向四環(huán)素、4 - 差向土霉素、α-阿撲土霉素、β-阿撲土霉素及土霉素對照品各適量，精密稱定，加0.01 mol/ L 鹽酸溶液溶解并定容，制成每1 mL 分別含0.1 mg 的混合溶液，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備不含土霉素的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取2.2 項下系統(tǒng)適用性溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，土霉素峰的保留時間為12 min，土霉素峰與2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰（與土霉素峰相對保留時間約為1.1）的分離度為2.0。詳見圖1。

1. 土霉素 2.2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖1.Oxytetracycline 2.2-Acetyl-2-deamidothetracyclineFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.4 方法學(xué)考察

強力破壞試驗：1）酸破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加2 mL 1 mol/L鹽酸溶液使溶解，60 ℃水浴20 min，取出，加2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液中和，用0.01 mol/L 鹽酸溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得酸破壞試驗溶液。2）堿破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶解，60 ℃水浴3 min，取出，加2 mL 1 mol/L 鹽酸溶液中和，用0.01 mol/L 鹽酸溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得堿破壞試驗溶液。3）高溫破壞。取土霉素對照品適量，120 ℃放置3 h，取10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得高溫破壞試驗溶液。4）氧化破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加30%H2O2溶液2 mL，室溫放置50 min，加0.01 mol / L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得氧化破壞試驗溶液。5）光照破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，4 000 lx光照48 h，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得光照破壞試驗溶液。取上述5種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果樣品經(jīng)酸、堿、高溫、氧化、光照破壞后，個別雜質(zhì)增加明顯，提示樣品在酸、堿、高溫、氧化、光照條件下不穩(wěn)定；主峰與雜質(zhì)峰及雜質(zhì)峰間的基線分離，且未知雜質(zhì)不干擾主成分的測定。色譜圖見圖2。

1.4 - 差向土霉素 2.4 - 差向四環(huán)素 3. 土霉素 4. 美他環(huán)素 5. 四環(huán)素 6. 脫水差向四環(huán)素A. 酸破壞 B. 堿破壞 C. 高溫破壞 D. 氧化破壞 E. 光照破壞圖2 強力破壞試驗高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Oxytetracycline 4.Methicycline 5.Tetracycline 6.AnhydrotetracyclinA.Acid damage B.Alkali damage C.High - temperature damage D.Oxidative damage E.Light damageFig.2 HPLC chromatograms of the strong destructive test

專屬性試驗：精密量取2.2項下混合雜質(zhì)對照品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果9 種成分均可實現(xiàn)基線分離，四環(huán)素與美他環(huán)素的分離度為1.5，其他各峰間的分離度均大于2.0，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖3。

1.4 - 差向土霉素 2.4 - 差向四環(huán)素 3. 土霉素 4. 脫水差向四環(huán)素 5. 四環(huán)素 6. 美他環(huán)素 7.α - 阿撲土霉素 8. 脫水四環(huán)素 9.β - 阿撲土霉素A. 混合雜質(zhì)對照品溶液 B. 陰性對照品溶液圖3 專屬性試驗高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Oxytetracycline 4.Anhydrotetracyclin 5.Tetracycline 6.Methicycline 7.α- Apooxytetracycline 8.Anhydrotetracycline 9.β - Apooxytetracycline A.Mixed impurity reference solution B.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察：取土霉素對照品11.26 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.01 mol/ L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液；分別精密吸取對照品貯備液0.5，1，2.5，5，10，20 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，以土霉素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y= 1 991.6X-758.75（r=0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，土霉素的質(zhì)量濃度在0.5～20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限確定：精密量取2.2項下土霉素對照品溶液適量，加0.01 mol/L 鹽酸溶液制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為10∶1 和3∶1 時的進樣量為定量限和檢測限。結(jié)果土霉素的定量限為5.0 ng，檢測限為1.4 ng。

精密度試驗：取2.2 項下土霉素對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.54%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫放置1，2，3，4，5，6，7，8 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果隨著放置時間的延長，雜質(zhì)含量略有增加，但各雜質(zhì)含量變化的絕對值在0.1%范圍內(nèi)，土霉素峰面積的RSD為0.85%（n= 8），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)較穩(wěn)定，檢測有關(guān)物質(zhì)時宜臨用現(xiàn)配。

耐用性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別采用不同色譜柱［CAPCELL PAK TYPE MGⅡ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），DiamonsilTMC18柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil GDLD SinoChrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液中雜質(zhì)含量的RSD均在±0.1%范圍內(nèi)，表明方法耐用性良好。

2.5 土霉素原料和制劑中雜質(zhì)色譜圖確立

采用主成分自身對照法，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果顯示，各企業(yè)樣品中檢出雜質(zhì)含量相近，檢出雜質(zhì)9 個，典型供試品溶液有關(guān)物質(zhì)高效液色譜圖見圖4。采用已知雜質(zhì)對照品定性雜質(zhì)4 個，分別為4 - 差向土霉素、4 - 差向四環(huán)素、脫水差向四環(huán)素、四環(huán)素；經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC - MS/ MS）法初步分析結(jié)構(gòu)，確定雜質(zhì)1 與2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素結(jié)構(gòu)一致，雜質(zhì)2 為蛋白性雜質(zhì)，雜質(zhì)3 為土霉素氧化降解產(chǎn)物。

1.4 - 差向土霉素 2.2 - 差向四環(huán)素 3. 脫水差向四環(huán)素4. 四環(huán)素 5. 土霉素 6. 雜質(zhì)1 7. 雜質(zhì)2 8. 雜質(zhì)3 9 - 10. 未知雜質(zhì)圖4 供試品溶液有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Anhydrotetracyclin 4.Tetracycline 5.Oxytetracycline 6.Impurity 1 7.Impurity 2 8.Impurity 3 9 - 10.Unknown impuritiesFig.4 HPLC chromatograms of relevant substances in the test solution

2.6 土霉素原料和制劑中有關(guān)物質(zhì)含量測定

原料：取X，Y，Z 生產(chǎn)企業(yè)的土霉素原料樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。3家生產(chǎn)企業(yè)樣品中共檢出8種雜質(zhì)，均為制劑雜質(zhì)譜中的雜質(zhì)，但未檢出脫水差向四環(huán)素，檢出量有差異。提示不同原料生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝相近，脫水差向四環(huán)素在土霉素制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生，其他均為原料引入。詳見表2。

表2 不同生產(chǎn)企業(yè)土霉素原料中有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of the content determination of related substances in oxytetracycline API from different manufacturers（%）

制劑：取18 家生產(chǎn)企業(yè)的192 批次土霉素制劑樣品，每批樣品抽驗數(shù)量不少于5 批次，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。抽驗樣品中，合格率為100.00%，檢出雜質(zhì)2-乙酰-2-去酰胺土霉素含量在1.62%～2.73%范圍內(nèi)，其他雜質(zhì)總含量在1.20%～1.84%范圍內(nèi)。故以2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素作為標(biāo)示指標(biāo)控制產(chǎn)品質(zhì)量。擬訂有關(guān)物質(zhì)2-乙酰-2-去酰胺土霉素的限度為不得過對照溶液主峰面積的3.5%，其他各雜質(zhì)峰面積之和不得過對照溶液主峰面積的2.0%。詳見表3。

表3 不同生產(chǎn)企業(yè)土霉素制劑中有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（%）Tab.3 Results of the content determination of related substances in oxytetracycline preparations from different manufacturers（%）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

EP10.2 土霉素有關(guān)物質(zhì)檢測時，流動相需用到三氟乙酸及四氫呋喃，三氟乙酸酸性較強，具有一定揮發(fā)性，四氫呋喃長期使用會腐蝕peak 管。2020年版《中國藥典（二部）》［16］鹽酸土霉素項下有關(guān)物質(zhì)檢測中，流動相的選擇更優(yōu)，故以2020年版《中國藥典（二部）》鹽酸土霉素有關(guān)物質(zhì)所示方法為基礎(chǔ)，對雜質(zhì)對照品溶液進行預(yù)試驗，β-阿撲土霉素于104 min 出峰，為縮短分析時間，將等度洗脫優(yōu)化為梯度洗脫，達到快速檢驗的目的。

BP2020 和EP10.2 土霉素有關(guān)物質(zhì)項下檢測波長為254 nm，2020年版《中國藥典（二部）》鹽酸土霉素有關(guān)物質(zhì)項下檢測波長為280 nm。對土霉素有可能產(chǎn)生的3種雜質(zhì)（4-差向土霉素、α-阿撲土霉素、β-阿撲土霉素）進行二極管陣列檢測器（PDA）全波長掃描，三者的最大吸收均在254 nm波長處，故選擇檢測波長為254 nm。

土霉素在乙醇中微溶，在水中極微溶解，在氫氧化鈉和稀鹽酸中溶解，根據(jù)其溶解性，提取溶劑選擇0.01 mol/L鹽酸溶液。

3.2 線性范圍選擇

土霉素原料及片劑的主要雜質(zhì)為2-乙酰-2-去酰胺土霉素，而目前中國食品藥品檢定研究院尚未提供2-乙酰-2-去酰胺土霉素的對照品，故采用主成分自身對照法對雜質(zhì)的限量進行控制，此方法是2020年版《中國藥典》和其他國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多、最廣泛的有關(guān)物質(zhì)測定和計算方法。同面積歸一化法的思路一致，該方法也是在假定供試品溶液中所有雜質(zhì)均與主成分分離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進行的，故方法驗證選擇土霉素定量限至2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素的最高限度3.5%的濃度作為線性范圍，以保證雜質(zhì)的響應(yīng)值位于線性范圍內(nèi)。

主成分自身對照法的優(yōu)點為操作簡單，運算方便，無需雜質(zhì)對照品；缺點是忽略了各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實，導(dǎo)致測得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量存在差異。隨著雜質(zhì)分離和制備技術(shù)的不斷發(fā)展，可采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法實現(xiàn)對特定雜質(zhì)的精準(zhǔn)控制。

3.3 特定雜質(zhì)選擇

2-乙酰-2-去酰胺土霉素是土霉素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種共生物雜質(zhì)，其母環(huán)結(jié)構(gòu)與土霉素相同，分子式極接近［17］，是影響土霉素質(zhì)量的主要因素之一，故選擇2-乙酰-2-去酰胺土霉素作為特定雜質(zhì)。通過對產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的控制，進一步分析影響土霉素原料及制劑總體質(zhì)量水平的主要產(chǎn)生因素，進而明確產(chǎn)品質(zhì)量提高的方向。

3.4 方法評價

該方法操作簡便、專屬性好、靈敏度高，可用于土霉素原料及制劑中有關(guān)物質(zhì)的測定。