基于抗炎活性的香花崖豆藤化學成分研究*

姚采平，邱 飛，2，郭燕華，李燕華，劉建鋒，2△

（1. 湖南醫(yī)藥學院第一附屬醫(yī)院，湖南 懷化 418000； 2. 湖南醫(yī)藥學院·侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000）

香花崖豆藤Millettia dielsianaHarms 是侗族常用民間藥材，又名山雞血藤、大巴豆、山胡豆，為豆科崖豆藤屬植物的藤莖［1］，味苦、微甘，性溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有行氣、解熱、止血、驅(qū)風除濕、通經(jīng)活絡功效，常用于治療偏頭痛。研究表明，香花崖豆藤具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進造血等藥理學作用［2］，但未進行相關抗炎活性的化學成分研究。目前，分離出的化學成分主要有黃酮類、蒽醌類、生物堿類、萜類、甾類、有機酸或酯類、多糖等［3-12］。本研究中評價了香花崖豆藤70%乙醇提取物經(jīng)聚酰胺柱初分后，不同極性部位對脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 巨噬細胞炎性模型一氧化氮（NO）釋放量及環(huán)氧合酶2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表達水平的影響，并以抗炎活性為導向?qū)τ行Р课贿M行系統(tǒng)的化學成分分離，為闡明香花崖豆藤的抗炎機制提供理論依據(jù)。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，WondaSilC18柱（150mm×4.6 mm，5 μm），均購于日本Shimadzu 公司；Aston SC5制備柱［（280 mm × 10 mm，5 μm），湖南德米特儀器有限公司］；AV-600 spectrometer 型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；Ti2 - U 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；5702R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；FORMA STERI-CYCLE i160 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；iMark型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Bio-Rad 1658029型號蛋白電泳儀（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；5200Multi型化學發(fā)光熒光成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 試藥

香崖豆藤于2017年11月采自湖南省懷化市，經(jīng)湖南醫(yī)藥學院鄧偉峰教授鑒定為正品；聚酰胺（國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20151228 ＜30～60 目＞，20180720 ＜100～200 目＞）；Sephadex LH - 20 凝膠色譜（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為C2012176）；胰蛋白酶（批號為B121103），胎牛血清（批號為M430984），高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號為K211005），L- 谷酰胺（貨號為S210JV），5 × SDS 蛋白上樣緩沖液（批號為20221214），均購于上海源培生物科技股份有限公司；LPS（西格瑪奧德里齊＜上海＞貿(mào)易有限公司，批號為0000189647）；NO 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，貨號為S0023）；CCK - 8 試劑（批號為20220928），青-鏈霉素溶液（貨號為C100C5），RIPA 裂解液（批號為20221107），14 - 250KD 蛋白預染marker（貨號為P9006），超敏增強型化學發(fā)光（ECL）試劑盒（批號為20221115），均購于蘇州新賽美生物科技有限公司；兔抗人抗體iNOS 一抗（貨號為Ab178954），COX- 2 抗體（貨號為Ab17988），均購于英國Abcam 公司；羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（貨號為S0001），羊抗小鼠HRP 標記二抗（貨號為S0002），均購于Affinity Biosciences；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，貨號為ID0170）；Greiss 試劑盒（北京百瑞極生物科技有限公司，貨號為BN16025）。

1.3 細胞

RAW264.7 細胞系來自湖南醫(yī)藥學院生物醫(yī)學研究中心細胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取香花崖豆藤4.5 kg ，加10 倍量70%乙醇，室溫冷浸15 d，冷浸液進一步濃縮得浸膏506 g，浸膏用適量甲醇溶解，經(jīng)聚酰胺（30～60 目）攪拌揮干溶劑，并裝于100～200目聚酰胺柱，用水、40%乙醇、70%乙醇、100%乙醇洗脫，回收溶劑后分別得水洗脫部位96 g，40%乙醇洗脫部位123 g，70%乙醇洗脫部位189 g，100%乙醇洗脫部位67 g。

根據(jù)抗炎活性篩選結(jié)果，對香花崖豆藤40%乙醇洗脫部位進行系統(tǒng)分離，依次經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠色譜及半制備高效液相色譜分離純化，分別得化合物1（21 mg）和化合物2（35 mg）。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇，不溶于水。1H - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：12.23（1H，s，5 -OH），10.81（1H，s，7 - OH），6.89（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 5'），6.78（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 6'），5.91（2H，s，6 - H，8 - H），4.46（2H，m，H - 2），4.31（1H，m，H -3），3.79（3H，s，4' - OCH3），3.74（3H，s，2' - OCH3），3.73（3H，s，3' - OCH3）。13C - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：70.5（C - 2），46.9（C - 3），197.5（C - 4），167.0（C - 5），96.5（C - 6），164.4（C - 7），95.3（C - 8），163.5（C - 9），153.8（C - 10），121.2（C - 1'），153.8（C - 2'），151.9（C - 3'），142.2（C - 4'），108.3（C -5'），125.2（C - 6'），61.0（2' - OCH3），60.7（3' -OCH3），56.4（4'-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［13］的報道結(jié)果基本一致，經(jīng)鑒定，化合物1 為5，7 - dihydroxy-2'，3'，4'-trimethoxyisoflavanone（C18H18O7）。

化合物2：淡黃色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇，不溶于水。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.96（1H，s，5-OH），10.88（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4'-OH），8.33（1H，s，H - 2），7.39（2H，dd，J= 6.0 Hz，H - 3'，H -5'），6.82（2H，dd，J=6.0 Hz，H-2'，H-6'），6.39（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 6），6.22（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 8）。13C - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：154.5（C - 2），122.7（C - 3），180.7（C - 4），162.5（C - 5），99.4（C -6），164.8（C-7），94.1（C-8），158.1（C-9），104.9（C-10），121.7（C-1'），115.5（C-2'，C-6'），130.6（C-3'，C-5'），157.9（C-4'）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［14］的報道結(jié)果基本一致，經(jīng)鑒定，化合物2 為5，7，4' - trihydroxyisoflavanone（C15H10O5）。

2.3 抗炎活性評價

2.3.1 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞在含10%低內(nèi)毒素胎牛血清、青霉素G（10 000 U/ mL）、鏈霉素（10 μg/ mL）、L- 谷酰胺（29.2 mg/ mL）的DMEM 培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞。

2.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力

取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，用培養(yǎng)基制成2×106個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。試驗分為水洗脫部位組（A 組）、40%乙醇洗脫部位組（B 組）、70%乙醇洗脫部位組（C 組）、100%乙醇洗脫部位組（D 組）、陽性對照組和空白組，每組各6 個復孔。吸棄各孔培養(yǎng)液，A 組、B 組、C 組、D 組每孔加質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的供試藥液，陽性對照組加濃度為0.5 μmol/ L 的地塞米松，空白組加培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，上述各組各孔分別加10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的CCK-8溶液，30 min后利用酶標儀于570 nm 波長處測定吸光度值，計算細胞存活率，試驗重復3 次。結(jié)果在50 μg / mL 質(zhì)量濃度作用24 h 后，A 組、B 組、C 組、D 組細胞存活率均在80%以上，但組間無顯著差異（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 不同極性部位作用下RAW264.7細胞的存活率Fig.1 Viability of RAW264.7 cells under different polar parts

2.3.3 Griess 法檢測細胞產(chǎn)生NO 含量

試驗分為A 組、B 組、C 組、D 組、陽性對照組、模型組和空白組。取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，用培養(yǎng)基制成2 × 106個/ mL 的單細胞懸液，接種于96 孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后吸棄上清液，A 組、B 組、C組、D組分別加入待測物溶液（質(zhì)量濃度為50 μg/mL），陽性對照組加入地塞米松（濃度為0.5 μmol/L），模型組和空白組加入等量完全培養(yǎng)液。2 h 后，A 組、B 組、C組、D組、陽性對照組加入LPS（質(zhì)量濃度為10 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)，模型組加入LPS（質(zhì)量濃度為10 μg/mL）刺激24 h，空白組加入等量完全培養(yǎng)液。24 h 后，取50 μL培養(yǎng)基上清液，加入Greiss1試劑，室溫避光振搖10 min，再加入Greiss2 試劑，室溫避光振搖10 min，以完全培養(yǎng)基加顯色劑作為空白對照，利用酶標儀于540 nm波長處測定各孔的吸光度值。結(jié)果與模型組比較，A組NO釋放量增多，B組、C組、D組NO釋放量均顯著減少（P＜0.001），且B 組減少最多，故以40%乙醇洗脫部位進行系統(tǒng)分離。詳見圖2。

圖2 不同極性部位對RAW264.7細胞產(chǎn)生NO的影響Note：Compared with those in the model group，*P ＜0.01，**P ＜0.001（for Fig.2 - 3）.Fig.2 Effect of different polar parts on NO production in RAW264.7 cells

2.3.4 免疫印跡（Western blot）法檢測iNOS 和COX-2蛋白表達

取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，用培養(yǎng)基制成5×105個/mL的單細胞懸液，接種于12孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。試驗分組及給藥同2.3.3 項下。24 h 后，提取細胞總蛋白，采用Western blot法檢測iNOS和COX-2的蛋白表達水平。結(jié)果與模型組比較，A 組、B 組、D 組COX - 2 蛋白表達下調(diào)；B 組iNOS 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01），故以40%乙醇洗脫部位進行系統(tǒng)分離。詳見圖3。

圖3 不同極性部位對RAW264.7細胞COX-2和iNOS蛋白表達水平的影響A.COX - 2 B.iNOSFig.3 Effect of different polar parts on the expression of COX - 2 and iNOS protein in RAW264.7 cells

3 討論

本研究中以LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞炎性模型評價了侗藥香花崖豆藤不同極性部位對COX - 2和iNOS 蛋白表達水平的影響。結(jié)果表明，其40%乙醇洗脫部位能顯著降低NO 的釋放量，并能選擇性地抑制iNOS 蛋白的表達，提示40%乙醇洗脫部位可能為香花崖豆藤發(fā)揮抗炎活性的有效部位。采用凝膠柱色譜及半制備高效液相色譜對其進行系統(tǒng)分離，得到2個化合物，并經(jīng)NMR 結(jié)合文獻波譜數(shù)據(jù)比對確認為5，7 - dihydroxy-2'，3'，4'-trimethoxyisoflavanone（化合物1）和5，7，4'-trihydroxyisoflavanone（化合物2），其中化合物1為首次從香花崖豆藤中分離得到。

文獻［13］報道，化合物1 對LPS 誘導RAW264.7 細胞的NO 生成具有較強的抑制活性，半數(shù)有效抑制濃度（IC50）低于50 μmol/ L，而化合物2 對LPS 誘導RAW264.7細胞的COX-2表達有顯著抑制作用［15］。提示化合物1 和化合物2 可能為香花崖豆藤發(fā)揮抗炎活性的藥效物質(zhì)基礎，并可能通過調(diào)控COX - 2 和iNOS蛋白的表達而發(fā)揮抗炎作用。

香花崖豆藤為治療偏頭痛的侗族常用民間藥材，應用歷史悠久。研究表明，偏頭痛患者NO 水平增加引起的氧化應激性損傷是引起偏頭痛的重要原因［16-18］。抑制一氧化氮合酶（NOS）對偏頭痛的急性或預防性治療提供了可行途徑。本研究中初步探討了香花崖豆藤40%乙醇洗脫部位通過選擇性抑制iNOS 蛋白的表達，以發(fā)揮治療偏頭痛作用的部分藥效物質(zhì)基礎，可為其治療偏頭痛的藥理作用研究及后續(xù)開發(fā)提供參考。