改良方法與傳統(tǒng)方法對富血小板血漿血小板回收率的對比研究

鄧述歡，黃少媛，張棟武

（1·佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院，廣東 佛山 528315；2·佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528500）

富血小板血漿（Platelet-Rich Plasma，PRP）是一種通過離心自體外周血獲得的血小板濃縮物[1]。研究已證實 PRP 激活后，血小板中的 α 顆?？舍尫臥DGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多種生長因子[2-3]。PRP具有促進組織修復(fù)的作用，且來源于自體，具有無排斥反應(yīng)和來源便捷等優(yōu)勢，臨床上已廣泛用于骨不連、慢性肌腱損傷、慢性創(chuàng)面、關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病的治療[4-7]。目前，臨床上使用的 PRP 制備套裝主要采用二次離心法和一次離心法。血小板回收率是用于比較制備方法優(yōu)劣的指標，有學(xué)者[8]用血小板回收率對4 種不同參數(shù)的PRP 制備方法進行了比較，分析方法的優(yōu)劣，并提出了改良方法。傳統(tǒng)的血小板回收率計算公式為：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；用此方法計算的血小板回收率均較低，在 46·9%左右[9-12]。此方法計算血小板回收率受較多因素的影響，特別是受人為因素的影響較大,進而影響PRP在臨床中的治療效果，使得PRP 在臨床治療中的推廣受限[13-15]。在制備PRP 時因血小板在中高速離心后多聚集在管底部，且有聚集成團的現(xiàn)象，操作者通常用吸管吹打數(shù)次后取100 μL 移于PVC 管用于計數(shù)，吹打次數(shù)不夠，血小板未充分懸浮，可導(dǎo)致計數(shù)偏低。其次因為PRP 的血小板濃度是基數(shù)血小板的數(shù)倍，而儀器計數(shù)有線性范圍，有學(xué)者通過對某款儀器進行性能分析發(fā)現(xiàn)，其線性范圍為( 0 ～977)×109/L, 而PRP的血小板濃度常有超過這一范圍的情況，所以易導(dǎo)致誤差。本研究通過對貧血小板血漿（Platelet-Poor Plasma,PPP）的血小板計數(shù)，用差值計數(shù)法得到PRP的真實濃度，再用血小板回收率的計算公式計算回收率。該方法不受上述因素影響，準確度可提高。研究表明，PPP 計數(shù)法的回收率明顯高于PRP 計數(shù)法的回收率，且其方法簡單不需要額外的儀器，只要有血球分析儀的實驗室都可開展，是值得推廣的方法。

1 材料與方法

1·1 實驗對象選擇標準

取 68 例成年健康志愿者的外周血（6 支 9mL/例）。其中男39 例，女29 例；年齡18 ～68 歲，平均42·6 歲。研究納入標準：（1）符合《中華人民共和國獻血法》和中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《獻血體格檢查標準》相關(guān)要求的健康人群，血紅蛋白：男性≥120 g/L，女性≥ 110 g/L；血小板計數(shù)≥100×109/L［正常值（100 ～300）×109/L］。（2）采血前7 d 內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血系統(tǒng)的藥物。（3）無臨床可見的肝腎功能性疾病、傳染性疾病、相關(guān)血液疾病、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病及感染等，依從性好且愿意配合進行相關(guān)檢測及隨訪，資料齊全。 研究排除標準：在納入標準的基礎(chǔ)上將依從性差，或有其他不適宜做此項研究之基礎(chǔ)疾病如血小板減少等的患者、資料不全或失聯(lián)者均排除在本次研究項目之外。本研究之目的、預(yù)期結(jié)果及潛在風險經(jīng)過本單位道德倫理委員會討論認定符合道德倫理標準要求（樂從醫(yī)倫字20220124）。

1·2 主要試劑與儀器

枸櫞酸鈉抗凝管（廣州陽普醫(yī)療器械有限公司，10 mL/支）；一次性使用采血針（廣州陽普醫(yī)療器械有限公司）；生物安全柜（山東濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、離心機（山東百歐醫(yī)療科技有限公司，TDL-500C 型）、全自動血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC5390CRP）。

1·3 PRP 制備方法

方法：（1）用9 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血6 支（用于制備PRP），用2 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血1 支（用于PLT 計數(shù)）。（2）將6 支血樣放入離心機第一次離心（參數(shù)160g、20 min，升9 降9），離心后取血漿放入潔凈離心管，對收取的離心管內(nèi)血漿（PPP 血漿）進行充分混勻，并記錄體積，取100 μL 混勻的血漿放入PVC 管進行血小板計數(shù)。（3）對混勻的血漿進行第二次離心（離心參數(shù)：460g、15 min，升9 降9）。（4）第二次離心后，留下管底的2 mL富血小板血漿（PRP管），用吸管把上層的泛血小板血漿吸到另一支一次性離心管（PPP 管）中。充分混勻PRP 管并取100 μL 置于PVC 管中進行PLT 計數(shù)，得到數(shù)據(jù)組（PRP 血漿直接PLT 計數(shù)組）；充分混勻PPP管并取100 μL置于PVC管中進行PLT計數(shù)，得到數(shù)據(jù)組（PPP 血漿PLT 計數(shù)組）。

1·4 數(shù)據(jù)收集及計算血小板回收率

用兩組數(shù)據(jù)及相應(yīng)的方法計算其相應(yīng)的血小板回收率。分別為傳統(tǒng)方法計算的血小板回收率（公式1）：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；改良法計算的血小板回收率（公式2）∶血小板回收率=(第一次離心后的血漿血小板計數(shù)×第一次離心后血漿的體積-PPP 的血小板計數(shù)×PPP 的體積)/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%。

1·5 統(tǒng)計學(xué)方法

對所有結(jié)果采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果

用PRP 直接計數(shù)的血小板回收率，平均回收率為66·8%，最高回收率為95·7%，最低回收率為21·5%；PPP 直接計數(shù)的血小板回收率，平均回收率為75·9%，最高回收率為98·8%，最低回收率為35·7%。PPP 直接計數(shù)的血小板回收率顯著高于PRP 直接計數(shù)的血小板回收率，P＜0·05。見圖1。

圖1 血小板回收率比較

3 討論

PRP是一種自身血液經(jīng)過離心去除紅細胞而得來的濃縮血小板血漿，盡管被醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但不少文獻認為PRP 在某些領(lǐng)域并不適用。目前，PRP 在慢性腱鞘炎、骨關(guān)節(jié)炎治療、醫(yī)美領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸被重視，但是應(yīng)用效果卻不盡相同，爭議眾多，其根本原因在于PRP 制作最終質(zhì)量不同[2,6,10]。看似是簡單的制作流程，但由于缺乏普遍認可的PRP 制作質(zhì)量控制標準，多種因素（尤其是制作人操作水平、離心次數(shù)、離心機參數(shù)等因素）均可造成血小板回收率的較大差異，導(dǎo)致成品PRP 質(zhì)量參差不齊，進而導(dǎo)致應(yīng)用效果及臨床作用不盡相同。PRP 作為一種高濃度血小板濃縮物被應(yīng)用于臨床由來已久，尤其是在慢性損傷修復(fù)、運動損傷修復(fù)、燒燙傷創(chuàng)面修復(fù)方面功效明顯；因血小板中富含生長因子、細胞因子和抗菌肽等多種生物活性物質(zhì)，具有促進細胞增殖、分化、基質(zhì)合成、組織再生與修復(fù)等作用，而被臨床所重視，因此近來在臨床多個領(lǐng)域被廣為推崇，但由于PRP 制備方法受到人員素質(zhì)、設(shè)備性能、計算方式等諸多因素制約，導(dǎo)致PRP 質(zhì)量參差不齊，隨著行內(nèi)專家共識指導(dǎo)性文件[1]的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象得到改觀。由于PRP 制備方法大多以一次離心法、二次離心法及三次離心法等手工法為主，導(dǎo)致血小板回收率參差不齊（從21·5%～98·8%不等），但二次離心法或三次離心法血小板回收率顯著高于一次離心法，Harriso 等[5]通過對6 種離心所得的PRP 分析發(fā)現(xiàn)，血小板回收率差異較大，其總體回收率介于（53±18）%至（72±13）%之間，血小板計數(shù)值介于（568～1062）×109/L之間，白細胞計數(shù)、紅細胞比容等有形成分也各不相同，提示不同離心力參數(shù)制備的PRP 質(zhì)量差異較大；有學(xué)者[7-10]采用不同離心參數(shù)及全血規(guī)格制備了PRP，比較了血小板回收率和純度，結(jié)果表明：三次離心法制備的PRP 純度較高，但血小板回收率偏低，不適合用于醫(yī)美或其他慢性修復(fù)，只適合制備冰凍血小板等。還有研究發(fā)現(xiàn)[11-13]：采用不同離心力參數(shù)離心法（先1000 g 離心10 min，再1500 g 離心15 min）制備所得的 PRP 血小板回收率最高，值得推廣；但有學(xué)者提出了不同看法[14-16]，認為這種方法跟分步離心法并無不同，且血小板回收率未見提升。

為提高PRP 制作水平，獲得穩(wěn)定的、純度較高的、血小板回收率符合要求的PRP，在總結(jié)各類普遍使用的PRP 制作方法之基礎(chǔ)上，本文作者采用二次離心法制備PRP，通過先制備PPP，而后再將PPP 第二次離心取得PRP，結(jié)果顯示：血小板回收率顯著高于一次離心獲得的PRP，血小板回收率符合要求，取得滿意效果；PRP 含有數(shù)倍于血小板生理濃度的血小板濃縮物，研究認為，PRP 中的血小板計數(shù)達到全血3 ～6 倍以上才能起到治療作用[16-17]。有學(xué)者在研究后認為，衡量PRP 成品質(zhì)量的指標主要是血小板富集系數(shù)和回收率[18-20]。所以在實際工作中如何把回收率計算準確是亟待解決的問題。直接行PLT 計數(shù)的影響因素較多，具體包括：操作人員在工作中的操作會影響PLT 的計數(shù)準確度，如操作人員吹打的時間和力度不同；因PRP 中PLT 的濃度不同，PLT離心會聚成塊狀，同樣的力度吹打，血小板散開的程度不同，吹打后涂片用顯微鏡觀察通常會有肉眼無法觀察到的小凝塊；血細胞分析儀的分析原理主要是電容型、電阻抗型、激光型、光電型、聯(lián)合檢測型、干式離心分層型和無創(chuàng)型，不管是哪一種類型都無法區(qū)分聚集的血小板小塊，再者血細胞分析儀的檢測能力都有一個線性范圍，超過線性范圍的PLT 濃度的標品就會失真。本研究采用分步離心法先取得PPP，再將PPP 離心取得PRP，較好地解決了血小板回收率不足等問題，值得臨床推廣。

現(xiàn)在一般的血細胞分析儀的PLT 計數(shù)線性范圍在（0 ～1000）×109/L，采用PRP 制品直接行PLT 計數(shù)結(jié)果的準確性值得懷疑。用傳統(tǒng)的血小板回收率的計算公式算出的回收率其準確性必然大打折扣。血小板數(shù)值直接與臨床治療效果相關(guān)聯(lián)[4,8-9,16]，因此，制備出高質(zhì)量的PRP 意義重大。但是，制備PRP 受諸多因素制約，如環(huán)境溫度、操作者技術(shù)水平、離心次數(shù)等等，所以，PRP 制備好后的PLT 計數(shù)就顯得非常重要；本研究用改良方法計算的血小板回收率，其公式用到的兩個PLT 計數(shù)都不會超出線性范圍，計數(shù)的準確性是有保障的，第一次離心的計數(shù)，因是低速離心，取血漿的PLT 計數(shù)通常是原血血小板計數(shù)的一倍左右，涂片鏡檢也沒發(fā)現(xiàn)有聚集現(xiàn)象。PPP 的血小板計數(shù)通常在100×109/L 左右,在儀器的線性范圍內(nèi),其計數(shù)的準確性也有保障。所以改良法血小板回收率計算公式的各變量都能準確測得，其計算所得的回收率是準確可靠的。從上述統(tǒng)計結(jié)果來看，改良法計算的回收率的平均值是84%，而傳統(tǒng)法計算的回收率平均值是72%，高出12%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0·05）。改良法回收率的計算不需要測PRP 的血小板計數(shù)，所以在制作PRP 時就不用取部分PRP 血漿用來計數(shù)，從而減少了污染的風險，提高了PRP 血漿質(zhì)量，尤其在侵入性方式使用PRP 的醫(yī)美領(lǐng)域或慢性損傷性修復(fù)領(lǐng)域，防止污染PRP 進入人體是影響修復(fù)是否達到預(yù)期的關(guān)鍵因素[17-20]，值得臨床重視。

綜上所述，本研究采用的改良法制備的PRP 成品，血小板回收率比傳統(tǒng)法明顯更優(yōu)，血液其他有形成分計數(shù)與傳統(tǒng)方法比較未見明顯差異，且減少了PRP 被污染的風險，血小板計數(shù)值符合醫(yī)美、慢性炎癥修復(fù)之臨床應(yīng)用要求，值得推廣。本研究存在的不足之處在于：試驗樣本量不足，導(dǎo)致PRP 質(zhì)量評價缺乏大數(shù)據(jù)支撐。關(guān)于PRP 制備方法、離心參數(shù)、質(zhì)量評價標準體系文件的建立，依然需要臨床同行繼續(xù)努力，這也是本研究組成員今后努力之方向。