1,25-（OH）2D3 對慢性哮喘小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的影響

黃麗娟，董德興，謝劍露

（華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

支氣管哮喘（Asthma）在我國的流行病學調(diào)查中結(jié)果不太樂觀，用于治療哮喘的藥物也相對有限，對于預防哮喘的發(fā)生和防止哮喘患者氣道重塑的藥物更少。目前，在哮喘的治療中糖皮質(zhì)激素應用較為廣泛，但由于患兒家長對兒童長期應用糖皮質(zhì)激素的安全性存疑，因此導致糖皮質(zhì)激素在兒童哮喘治療中的使用程度不高。找到一種能替代糖皮質(zhì)激素的藥物，用于治療小兒哮喘及改善哮喘患兒的氣道重塑非常重要，也是目前的研究熱點?，F(xiàn)階段，關(guān)于預防和改善哮喘患兒氣道重塑藥物的有效性仍需進一步探討，需要大量的實驗數(shù)據(jù)證實新藥的有效性。研究表明，給予致敏小鼠慢性長時程激發(fā)可誘導出具有人類哮喘病理特征的哮喘動物模型［1］。本研究采用卵清蛋白（OVA）誘導建造慢性哮喘小鼠模型，并用1,25-二羥維生素D3﹝1,25-（OH）2D3﹞治療慢性哮喘小鼠，然后檢測其血清TGF-β、IL-4 水平，以期探索1,25-（OH）2D3抑制哮喘氣道重塑的作用機制，詳細報道如下。

1 材料和方法

1·1 實驗動物

雌性、3 周齡BALB/c 小鼠30 只（購于廣東省實驗動物中心），體重15 ～19 g。將30 只小鼠隨機分為3 組：正常對照組（10 只）、模型組（10 只）、維生素D 組（10只）。

1·2 試劑與藥品

藥品：1,25-（OH）2D3（美國Sigma 公司），OVA（美國Sigma 公司），氫氧化鋁（美國Sigma 公司）；試劑：轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELLSA）試劑盒（蘇州四正柏生物科技有限公司）。

1·3 研究方法

模型組、維生素D組小鼠檢疫3 d正常后分別于第1 d、第14 d 背部、腹腔注射OVA 混合液100 μg﹝OVA 100 μg+氫氧化鋁1 mg+磷酸鹽緩沖液（PBS）0·05 mL/只﹞，構(gòu)建慢性哮喘小鼠模型。維生素D 組在第21 d 予1,25-（OH）2D3腹腔注射（100 ng/只，共18 次），30 min后予1% OVA 霧化吸入（隔天1 次，共18 次）；模型組予等量生理鹽水腹腔注射，30 min 后予1% OVA 霧化吸入（隔天1 次，共18 次）。第55 d 收集標本，處死動物，采用ELLSA 檢測各組的血清TGF-β、IL-4 水平，并予以比較。正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不建模。

1·4 造模觀察

造模小鼠在給予OVA 激發(fā)初始階段表現(xiàn)為氣促、點頭呼吸、打噴嚏、腹肌收縮、煩躁等哮喘發(fā)作癥狀，隨著0VA 誘導次數(shù)的增加，小鼠出現(xiàn)毛色光澤度下降、反應遲鈍、進食減少和體重下降表現(xiàn)。

1·5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19·0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。兩變量間的相關(guān)性采用線性相關(guān)風險分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用組成設(shè)計的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的q 檢驗。P＜0·05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2·1 三組小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比較

血清TGF-β、IL-4 水平對比，維生素D 組較模型組明顯降低（P＜0·05）；維生素D 組和模型組較正常對照組明顯升高（P＜0·05）。詳見表1。

表1 三組小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比較（±s）

表1 三組小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比較（±s）

注：與正常對照組比較，☆P ＜0.05；與模型組比較，◇P ＜0.05。

組別 TGF-β（μg/L） IL-4（ng/mL）正常對照組（n=10） 27.81±1.31 61.32±2.62模型組（n=10） 39.33±1.53☆ 89.12±2.91☆維生素D 組（n=10） 33.12±1.68☆◇ 73.66±2.63☆◇

2·2 相關(guān)性分析

慢性哮喘小鼠血清中TGF-β 與IL-4 呈正相關(guān)（r=0·856，P＜0·05）。

3 討論

哮喘的發(fā)病機制較為復雜，尚未完全清楚。目前認為哮喘發(fā)病主要是因為Th1 型細胞功能和數(shù)量不足，Th2 型細胞占優(yōu)勢是其重要特征。哮喘患者體內(nèi)的Th2型細胞主要產(chǎn)生IL-4 等細胞因子，這些細胞因子可導致免疫球蛋白E（IgE）抗原特異性增強，而IgE 抗原特異性增強可引起肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的分化、聚集等，進而啟動哮喘氣道炎癥并保持氣道炎癥持續(xù)存在。Th1 和Th2 型細胞因子之間占比不均衡和生物功能的不平衡會引起免疫功能紊亂，從而導致哮喘發(fā)作。因此，維持Th1 和Th2 型細胞因子間的平衡對于哮喘的治療至關(guān)重要。1,25-（OH）2D3是一種活性很強的物質(zhì)，同時也屬于類固醇激素，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝、抗炎以及調(diào)節(jié)免疫功能等作用。1,25-（OH）2D3不僅在腎臟中生成，在人體其他器官中也能生成，例如在肺組織中廣泛表達，此外在一些細胞中如肺泡巨噬細胞、氣道上皮細胞中也廣泛存在，并且局部合成的1,25-（OH）2D3在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能上承擔著重要的角色[2-3]。關(guān)于1,25-（OH）2D3能否在人體內(nèi)產(chǎn)生生物學活性，主要取決于機體內(nèi)維生素D 受體（VDR）是否正常。正常情況下，VDR 能與1,25-（OH）2D3結(jié)合，使其發(fā)揮良好的生物學效應。新近的研究表明，VDR 基因是哮喘的易感基因，提示1,25-（OH）2D3可能在某種程度上通過與VDR 的配體-受體效應參與對哮喘的調(diào)節(jié)[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，1,25-（OH）2D3在哮喘的免疫應答、慢性氣道炎癥、氣道平滑肌細胞相關(guān)基因的調(diào)控方面均發(fā)揮著復雜的調(diào)控作用[5-6]。1,25-（OH）2D3通過上述作用，能夠有效抑制哮喘患者的氣道高反應和氣道重塑。

IL-4 細胞因子是在T 細胞培養(yǎng)上清液中被發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)命名為白細胞介素-4，是第5 號染色體上的基因。成熟IL-4 分子由氨基酸殘基組成，其生物學效應強。IL-4能激活B 淋巴細胞合成IgE 和免疫球蛋白G（IgG），上調(diào)可溶性低親和力IgE 受體的表達，而IgE 與肥大細胞、嗜酸性粒細胞相互作用釋放炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生氣道高反應，引起哮喘發(fā)作[7-8]。IL-4 可促使Th1 型細胞因子向Th2型細胞因子轉(zhuǎn)化，通過對Th2 細胞強有力的催化以增強體液免疫。由此可見，IL-4 是誘導Th2 細胞分化的主要細胞因子［9-10］。IL-4 也是強大的致炎因子，能促使Th2細胞處于極化狀態(tài)，引起上皮細胞過度增生、杯狀細胞分化和黏液產(chǎn)生、氣道內(nèi)嗜酸性粒細胞浸潤和聚集、氣道平滑肌收縮及氣道纖維化，最終導致氣道高反應及氣道重塑[11-12]。支氣管哮喘本質(zhì)上是一種以Th2 細胞免疫應答為主的氣道重塑，而氣道重塑在本病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和預后中起著重要作用。本實驗通過建造慢性哮喘小鼠模型，并檢測其血清IL-4 水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的血清IL-4 水平較正常對照組高；給予1,25-（OH）2D3干預后發(fā)現(xiàn)，維生素D 組小鼠的血清IL-4 水平較模型組低。可見，1,25-（OH）2D3可有效治療哮喘，其治療機制主要是減輕氣道高反應及抑制氣道重塑。

TGF-β 可由體內(nèi)的多種細胞分泌產(chǎn)生，它是多功能細胞活性調(diào)節(jié)因子中活性最強的因子，在炎癥調(diào)節(jié)、干細胞及T 細胞的調(diào)節(jié)和分化中起著重要作用。TGF-β 在正常人體內(nèi)呈低表達，一旦機體出現(xiàn)炎癥反應或應激反應，TGF-β 的表達就會迅速升高。既往對支氣管哮喘患者進行肺泡灌洗發(fā)現(xiàn)，TGF-β 在肺泡灌洗液和支氣管中含量均很高。TGF-β 是導致哮喘患者氣道結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化生長因子，TGF-β 基因表達水平與哮喘的嚴重程度相關(guān)[13-14]。TGF-β 是由調(diào)節(jié)性T 細胞分泌的重要因子之一，并參與調(diào)節(jié)性T 細胞的發(fā)育，當調(diào)節(jié)性T 細胞分化不足及出現(xiàn)功能缺陷時，過敏性疾病就會發(fā)生[15]。在哮喘的炎癥反應中，TGF-β 能抑制T 淋巴細胞向Th2 細胞轉(zhuǎn)化，通過增加轉(zhuǎn)錄因子Fox P3 的表達促進調(diào)節(jié)性T 細胞的分化，間接抑制Th2 細胞所導致的免疫反應，減少嗜酸性粒細胞的浸潤[16]。TGF-β 是公認的致纖維化的轉(zhuǎn)化生長因子，而纖維化的過程是導致氣道重塑的重要原因[17-18]。哮喘患者氣道的多種病理生理過程均有TGF-β 的參與，包括免疫細胞趨化、細胞凋亡、細胞分化和增殖、氣道上皮和內(nèi)皮屏障功能改變等，而上述過程均與哮喘的發(fā)病機制相關(guān)。本研究應用1,25-（OH）2D3治療慢性哮喘小鼠，發(fā)現(xiàn)維生素D 組的血清TGF-β 水平顯著高于正常對照組（P＜0·05）；模型組的血清TGF-β水平顯著高于維生素D組（P＜0·05）。提示1,25-（OH）2D3能有效阻止哮喘患者體內(nèi)TGF-β 的表達，并能延緩氣道重塑過程，這與相關(guān)文獻[17-18]報道的結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)慢性哮喘小鼠血清中TGF-β 與IL-4 呈正相關(guān)（r=0·856，P＜0·05），說明兩者之間存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，1,25-（OH）2D3能下調(diào)慢性哮喘小鼠的血清TGF-β、IL-4 水平，故推測1,25-（OH）2D3抑制氣道重塑的作用機制可能與調(diào)節(jié)血清中TGF-β、IL-4 的含量有關(guān)。慢性哮喘小鼠在1,25-（OH）2D3的作用下導致血清TGF-β 水平降低，使Th2 極化水平下降。同時，在1,25-（OH）2D3的干預下，慢性哮喘小鼠的血清IL-4 水平下降，進一步促使Th2 細胞誘導的免疫反應下降，兩者水平的降低可調(diào)整Th1/Th2 免疫細胞因子水平，使其重新恢復動態(tài)平衡，從而減輕氣道炎癥，延緩氣道重塑。