二甲雙胍調(diào)控LC3B/p62 自噬通路抑制椎基底動脈延長擴(kuò)張癥進(jìn)展的機(jī)制

束寧德，劉慶新，曹曉雨

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濱州 256600）

椎基底動脈延長擴(kuò)張癥（Vertebrobasilar Dolichoectasia，VBD）是進(jìn)行性發(fā)展的腦血管疾病，且與卒中的發(fā)生聯(lián)系緊密[1]。隨著VBD 血管病變程度的加重，腦缺血區(qū)域會增加[2]。根據(jù)多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)及尸檢報告可以明確VBD血管的病理特征為血管迂曲擴(kuò)張，血管壁變薄，血管的彈性纖維斷裂伴隨內(nèi)彈力層變性、間隙增多，血管平滑肌層全層萎縮[3]。

自噬能改善動脈瘤的血管重構(gòu)[4-6]，抑制自噬的激活可能對主動脈夾層存在治療作用[7]。Wu、Liu 等人的研究也發(fā)現(xiàn)在血管炎癥以及動脈瘤等疾病中，亞精胺、STAT3抑制劑可通過激活自噬保護(hù)細(xì)胞，減輕血管炎癥，改善動脈瘤的血管重構(gòu)[5-6]。Azza 團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)性回顧研究驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，自噬不僅存在保護(hù)作用，過度激活的自噬也可加快細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[8]。VBD 屬于血管形態(tài)學(xué)改變疾病，血管中存在多種結(jié)構(gòu)破壞表現(xiàn)，是否有自噬的參與尚未見研究報道。

二甲雙胍是一類降糖藥物，同時還具有抗炎、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、抗衰老等多種功能。以往的研究證實(shí)二甲雙胍能夠增加自噬相關(guān)蛋白 LC3II/I、beclin 1，且能改善血管收縮功能[9]。硫酸羥氯喹是一種著名的抗瘧藥，也是臨床上常用的自噬抑制劑。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建 VBD 大鼠模型，通過應(yīng)用二甲雙胍及硫酸羥氯喹處理 VBD 大鼠，檢測各組大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白（LC3B、p62），探討二甲雙胍誘導(dǎo)的自噬在VBD 病程中的作用及機(jī)制，為VBD 的預(yù)防及治療提供思路。

1 材料與方法

1·1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

選 擇6 ～7 周 體 重200 ～220 g SPF 級SD 大 鼠 共64 只（濟(jì)南朋悅繁育有限公司），飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。環(huán)境溫度18 ～25℃，環(huán)境濕度40%～70%，換氣次數(shù)10 ～20 次/h，光暗交替比例1∶1，定時飼喂等量紫外線消毒鼠糧、更換高壓蒸汽滅菌水。本動物實(shí)驗(yàn)已通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審核。

彈性蛋白酶（Worthington Biochemical 公司）、鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）、硫酸羥氯喹 （上海上藥中西制藥有限公司）、LC3B 抗體（Proteintech Group）、p62 抗體 （博士德生物）、β-actin抗體 （博士德生物）、抗兔IgG 抗體（博士德生物）。

1·2 動物分組與處理

常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將64只大鼠隨機(jī)分為四組，即假手術(shù)組（S組）、VBD 模型組（V組）、二甲雙胍組（M組）、二甲雙胍+硫酸羥氯喹組（MH 組），每組16 只。后三組均制備VBD 模型。造模后24 h，M 組大鼠先給予2 mL 生理鹽水灌胃，30 分鐘后給予200 mg/kg 二甲雙胍灌胃；MH 組先給予40 mg/kg 硫酸羥氯喹（2 mL）灌胃，30 分鐘后給予200 mg/kg 二甲雙胍灌胃；其余兩組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃。

1·3 VBD 模型的制備

依次稱量各組大鼠體重，按10%水合氯醛0·4 mL/100 g比例，計算安全麻醉藥物腹腔注射劑量。參考文獻(xiàn)造模方法[4-5]，按照以下步驟進(jìn)行操作：將麻醉良好的大鼠以俯臥位固定于工作臺，常規(guī)標(biāo)記手術(shù)切口，備皮、消毒、鋪巾。逐層剪開大鼠皮膚、皮下軟組織，用鑷子鈍性分離大鼠頸部肌肉至環(huán)枕筋膜處。用微量注射器針尾抬高約45°緩慢旋轉(zhuǎn)進(jìn)針穿刺環(huán)枕筋膜，待出現(xiàn)明顯突破感后向枕大池緩慢注射2·5 μL 彈性蛋白酶（10 MU/μL）（V 組、M 組、MH 組），S 組大鼠注入等體積生理鹽水。注射完成后停針靜置1 分鐘，緩慢拔針，觀察到有清亮腦脊液由針孔處緩慢溢出，表明穿刺位置正確。以無菌棉簽充分按壓注射點(diǎn)，直至注射點(diǎn)無腦脊液流出。

1·4 基底動脈彎曲程度的評價

造模8 周后，于深度麻醉下或灌流后處死大鼠并拍攝采集基底動脈照片，取材后存至-80℃冰箱備用。使用ImageJ 軟件對所采集的圖像進(jìn)行測量，記錄數(shù)值進(jìn)行整合及分析，測量血管的最大直徑、垂直長度及實(shí)際長度，計算直徑增加比率、血管的迂曲指數(shù)。各組測量或計算后的數(shù)值同時滿足以下兩個條件被認(rèn)為造模成功，并納入各自分組（不滿足的樣本及數(shù)據(jù)將被剔除）：（1）直徑增加比率=（樣本直徑-假手術(shù)組平均直徑）/假手術(shù)組平均直徑≥0·25；（2）迂曲指數(shù)=（動脈實(shí)際長度/動脈垂直長度-1）×100 ≥10。動脈垂直長度：自基底動脈尖至椎動脈末端的直線距離。動脈實(shí)際長度：自基底動脈尖沿血管走行至椎動脈末端的距離?；讋用}直徑：測量基底動脈擴(kuò)張程度最大處為基底動脈直徑。

1·5 Westernblot 檢測

取方法1·4 中帶有腦血管樹的大鼠全腦，剝離大鼠椎基底動脈，稱量標(biāo)本重量后，加入裂解液及PMSF，充分進(jìn)行研磨后使細(xì)胞充分裂解。裂解后離心取上清液，用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定。將BCA 實(shí)驗(yàn)后剩余上清液按照1∶4 的配比添加5×蛋白上樣緩沖液，以95℃水浴鍋水浴加熱10 min，再次冷卻至室溫后，置于-20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。配?2·5% SDSPAGE 凝膠及電泳液，按計算后的蛋白上樣量進(jìn)行上樣，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后分別在200 mA、30 min（LC3B、β-actin），200 mA、70 min（p62）條件下進(jìn)行冰上轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。用封閉液配制一抗后，將封閉后的條帶置于對應(yīng)一抗（LC3B 抗體、p62 抗體）中，于4℃下過夜。孵育后用TBST 充分洗滌殘余一抗，然后加入封閉液配制的二抗（抗兔IgG 抗體）室溫孵育2 h。以TBST 充分洗滌二抗后，加入 ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光處理，并進(jìn)行相關(guān)條帶的圖像采集。

1·6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26·0 軟件及GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)性和等方差假設(shè)分別使用Hartley 檢驗(yàn)和峰度與偏度Z 評分（Z-score）進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法進(jìn)行分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey 多重比較，方差不齊的數(shù)據(jù)比較采用Brown-Forsythe、Welch ANOVA和Tamhane’ s T2檢驗(yàn)，以P＜0·05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2·1 大鼠一般情況觀察及VBD 模型成功率統(tǒng)計

在實(shí)驗(yàn)過程中共有4 只大鼠死于麻醉意外或術(shù)后并發(fā)癥，其中S 組、 V 組、M 組、MH 組分別為 1 只、0只、1 只、2 只。按照實(shí)驗(yàn)計劃進(jìn)行藥物干預(yù) 8 周后，取大鼠基底動脈，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)測量大鼠基底動脈直徑、基底動脈尖至椎動脈末端直線長度、血管的走行長度等指標(biāo)，計算各組大鼠直徑增加比率及血管的迂曲指數(shù)。根據(jù)VBD 大鼠納入標(biāo)準(zhǔn)（基底動脈直徑增加比率≥0·25；基底動脈迂曲指數(shù)≥10），各組分別排除 0 只、1 只、1只、2 只大鼠， 實(shí)驗(yàn)總體模型制作成功率為 91%（41/45），各組大鼠模型制作成功率均在 86%以上。

2·2 VBD 大鼠基底動脈血管重構(gòu)觀察及基底動脈迂曲指數(shù)、直徑、直徑增加比率計算

藥物干預(yù) 8 周后，通過對比四組大鼠基底動脈可以發(fā)現(xiàn)，V 組、M 組、MH 組大鼠基底動脈均有不同程度的迂曲延長，其中M 組血管迂曲及延長程度較 V 組及MH 組輕（見圖1）。

圖1 四組大鼠造模后8 周基底動脈形態(tài)特征

拍攝大鼠基底動脈形態(tài)學(xué)照片，應(yīng)用 ImageJ 軟件測量四組大鼠基底動脈直徑并計算基底動脈迂曲指數(shù)及基底動脈直徑增加比率（詳見表1、圖2）。與S 組相比，V 組、M 組、MH 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數(shù)及直徑增加比率均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0·05）；與V 組相比，M 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數(shù)及直徑增加比率均明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0·05）；與M 組相比，MH 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數(shù)及基底動脈直徑增加比率均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0·05）。

表1 各組基底動脈延長、擴(kuò)張程度比較（±s）

表1 各組基底動脈延長、擴(kuò)張程度比較（±s）

組別 (每組大鼠數(shù)量) 基底動脈迂曲指數(shù) 基底動脈直徑 (mm) 基底動脈直徑增加比率Group S (10) 1.5302 ± 0.4047 0.2125 ± 0.0213 0.0000 ± 0.1003 Group V (10) 35.5258 ± 7.1007 0.4051 ± 0.0560 0.9064 ± 0.2637 Group M (9) 11.7234 ± 1.6032 0.2850 ± 0.1983 0.3412 ± 0.0933 Group MH (7) 23.0161 ± 6.2910 0.4094 ± 0.0439 0.9267± 0.2064

圖2 基底動脈迂曲指數(shù)、動脈直徑、基底動脈直徑增加比率

2·3 二甲雙胍干預(yù)的 LC3B/p62 相關(guān)自噬通路的調(diào)節(jié)作用

藥物干預(yù) 8 周后處死大鼠，取大鼠基底動脈提取蛋白，應(yīng)用Western blot 技術(shù)檢測大鼠基底動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白指標(biāo)并進(jìn)行組間比較，比較結(jié)果如圖3所示，與S 組相比，V 組大鼠基底動脈LC3BII/I 蛋白比值明顯下降（P＜0·05），p62 蛋白表達(dá)升高（P＜0·05）；與 V 組相比，M 組及MH 組大鼠基底動脈LC3BII/I 蛋白比值升高（P＜0·05），p62 蛋白表達(dá)減少（P＜0·05）；與M 組相比，MH 組p62 蛋白表達(dá)增加（P＜0·05）。

圖3 各組大鼠血管標(biāo)本中LC3BII/I 和p62 蛋白表達(dá)比較

3 討論

VBD 是腦血管病的一類，其特征性表現(xiàn)為椎動脈和（或）基底動脈的異常迂曲擴(kuò)張。我們的研究團(tuán)隊(duì)前期通過應(yīng)用免疫熒光、Western blot、PCR 等相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段，驗(yàn)證了VBD病變血管基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-9表達(dá)增加，發(fā)現(xiàn)血管周圍巨噬細(xì)胞標(biāo)志物MAC387 及JNK 表達(dá)量升高，應(yīng)用瑞舒伐他汀對VBD 大鼠進(jìn)行干預(yù)后，通過對比大鼠組間MAC387 等炎癥指標(biāo)的變化，認(rèn)為炎癥可能是VBD 的病因之一。過度激活的炎癥導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的損傷及血管結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞的自噬作為一個高度保守的過程，往往在缺血、炎癥、氧化損傷等條件下出現(xiàn)，通常情況下自噬通過降解損傷細(xì)胞，并對降解細(xì)胞中的物質(zhì)進(jìn)行循環(huán)利用，從而使機(jī)體更快地適應(yīng)環(huán)境的變化；同時結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，特異性刪除小鼠血管平滑肌細(xì)胞的自噬相關(guān)基因會導(dǎo)致小鼠血管的彈性蛋白降解、斷裂[10-13]，相似的病理表現(xiàn)提示自噬可能同樣參與VBD 血管改變。

二甲雙胍能夠增加自噬相關(guān)蛋白 LC3II/I、beclin 1 和腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）水平，增強(qiáng) AMPK/mTOR 信號通路，減輕β-甘油磷酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，同時還能增加血管平滑肌細(xì)胞中α-SMA 蛋白表達(dá)，改善血管收縮功能[14]；二甲雙胍還能夠通過降低NLRP3 和選擇性自噬接頭蛋白（Sequestosome 1，p62）的表達(dá)，增加LC3II/LC3I 的比值，減輕巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，保護(hù)缺血心肌，減輕心肌損傷[10]；此外二甲雙胍可通過增強(qiáng)自噬在改善炎癥-衰老的狀況、延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展、改善肺纖維化等不同方面發(fā)揮積極作用[11-12，15]。目前，二甲雙胍已成為短期內(nèi)激活自噬的首選藥物之一。硫酸羥氯喹是磷酸氯喹的衍生物，由于其治療指標(biāo)廣、口服生物利用度高、成本低，常用作臨床自噬相關(guān)的研究。Qin Fei 的團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)，氯喹能夠消除二甲雙胍對巨噬細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用[16]，在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，羥氯喹抑制自噬的作用在相關(guān)手術(shù)中也有所應(yīng)用[17]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立VBD 大鼠模型并使用二甲雙胍、二甲雙胍+硫酸羥氯喹進(jìn)行干預(yù)，初步觀察了VBD 大鼠椎基底動脈中的LC3B 、p62 蛋白表達(dá)及二甲雙胍對其干預(yù)的作用，結(jié)果顯示：與S 組相比，V 組大鼠 LC3BII/I水平降低，p62 水平升高；與V 組相比，M 組及MH 組LC3BII/I 比值增加，M 組p62 蛋白降低；與M 組相比，MH 組大鼠p62 蛋白水平較高，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0·05）。本研究提示：VBD 大鼠血管迂曲擴(kuò)張程度增加；VBD 大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬水平減低；二甲雙胍可延緩 VBD 的進(jìn)展，其機(jī)制可能與干預(yù) LC3B/p62 相關(guān)通路，提升血管平滑肌細(xì)胞自噬水平有關(guān)。

由于本實(shí)驗(yàn)時間有限，對VBD 大鼠僅進(jìn)行了8 周的干預(yù)，后續(xù)可進(jìn)一步延長干預(yù)時間，進(jìn)行療效觀察。本次研究過程中，在應(yīng)用臨床治療藥物二甲雙胍對VBD大鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)治療時，未設(shè)置不同的劑量組進(jìn)行觀察對比，后續(xù)進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)時還需進(jìn)一步調(diào)整劑量以及設(shè)置相關(guān)對照組，以明確最佳的治療劑量。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。