牛支原體黏附相關(guān)因子的研究進展

楊舒婷，李媛，王茗雨，檀雅潔，梁家豪，荊婷婷，2，付磊，2，儲岳峰，2*

(1.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/動物疫病防控全國重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

養(yǎng)牛業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，牛肉、牛奶及乳制品是人們飲食生活中的重要品種。確保牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，不僅是保障食品安全和畜牧業(yè)安全的重要條件，也是對鞏固脫貧攻堅成果、促進鄉(xiāng)村振興的有力支撐，更是促進我國西部地區(qū)社會經(jīng)濟發(fā)展的重要因素。牛支原體病目前在世界范圍內(nèi)流行，是嚴重危害世界養(yǎng)牛業(yè)的重要疫病之一，給養(yǎng)牛業(yè)造成不可估量的損失[1]。1961年美國首次分離到牛支原體(Mycoplasmabovis)，之后卻未引起重視，同時，因?qū)嶒灩ぞ吲c技術(shù)的局限性，對牛支原體研究較為滯后。我國華中地區(qū)自2008年暴發(fā)?！盃€肺病”以來，現(xiàn)已在全國廣泛流行，牛支原體是重要病原之一，可引起患牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎等一系列重要疾病，但由于對牛支原體致病因子缺乏了解，致病機制仍不清楚，迄今無安全有效的商業(yè)化疫苗可用，也是牛支原體病難以有效防控的重要原因。

牛支原體與其他支原體類似，基因組很小、細胞結(jié)構(gòu)簡單，缺乏依靠自身合成氨基酸、核苷酸等一系列必需物質(zhì)的能力，且體外培養(yǎng)支原體的要求相較于一般細菌會更高，因此，牛支原體必需與宿主細胞取得直接聯(lián)系以維持生存[2]。由于牛支原體沒有細胞壁，黏附宿主細胞的功能就由其細胞膜及相關(guān)膜蛋白承擔，因此，表達在細胞膜上的黏附因子對于支原體的黏附宿主細胞作用十分重要[3]。已有研究表明，肺炎支原體與雞毒支原體的非黏附分離株和突變株的毒力減弱，也證明黏附是支原體致病的重要毒力因素[4]。

闡明牛支原體的黏附機制有助于更清晰地了解牛支原體的感染途徑以及致病機理，有利于新型防控產(chǎn)品的研發(fā)，有效防制因牛支原體感染引起的呼吸道等疾病的暴發(fā)，減少養(yǎng)殖戶在養(yǎng)牛業(yè)上的經(jīng)濟損失，有助于保障我國尤其是西部地區(qū)畜牧業(yè)的安全、健康發(fā)展。本文將基于牛支原體黏附和牛支原體致病機理研究現(xiàn)狀，論述牛支原體黏附相關(guān)因子的研究進展。

1 黏附機制在牛支原體致病中發(fā)揮的作用

黏附是牛支原體進入宿主細胞的第一步，并會對細胞產(chǎn)生損傷。支原體在代謝過程中產(chǎn)生過氧化氫等物質(zhì)，能給宿主細胞膜造成氧化性損傷，甚至使細胞死亡[5]。細菌黏附因子的靶蛋白主要是宿主細胞外基質(zhì)(ECM)的組分，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、血小板衍生生長因子、層粘連蛋白等[6]。對于支原體，位于細胞膜上的蛋白質(zhì)可以與宿主細胞的ECM成分結(jié)合，例如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖溶酶原和糖胺聚糖肝素，從而介導(dǎo)支原體定殖或侵襲[7]。因牛支原體沒有細胞壁，細胞膜及膜相關(guān)蛋白往往直接參與黏附宿主細胞[8]。而膜蛋白和糖脂是細胞膜上的主要抗原，可刺激宿主產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答[9]?？傊Ｖгw通過細胞膜表面蛋白或者黏附蛋白與宿主細胞上的靶蛋白(如纖連蛋白、纖溶酶原、肝素和淀粉樣蛋白前體樣蛋白-2[10])黏附，從而介導(dǎo)牛支原體對宿主細胞的黏附。

已有研究表明，感染牛支原體將影響宿主免疫系統(tǒng)，其中包含炎癥因子的產(chǎn)生或免疫細胞的凋亡，而膜蛋白在調(diào)節(jié)宿主防御系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[11]。支原體黏附到宿主細胞之后，能與宿主細胞膜形成緊密的直接接觸，這會造成局部膜融合。膜融合會使宿主細胞膜組分改變，如各種受體，直接影響機體正常的信息傳遞過程。另外，膜融合會使支原體內(nèi)部物質(zhì)進入宿主細胞，包括有活性的酶，有極大可能直接影響宿主細胞正常的代謝活動，如支原體磷蛋白磷酸酶進入真核細胞后干擾其正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。牛支原體侵入不同細胞可能導(dǎo)致病原體傳播到各種定殖位點，這與削弱抗生素的治療效果和逃避免疫系統(tǒng)殺傷有關(guān)。部分支原體還可能破壞宿主的細胞膜，支原體與宿主細胞膜的緊密接觸可能引起宿主細胞磷脂的水解，還可能會引起特定的信號級聯(lián)反應(yīng)，甚至?xí)尫拍苤录毎劳龅娜苎字ＥＶгw黏附在宿主細胞上會掠奪宿主的營養(yǎng)物資，從而導(dǎo)致宿主細胞的凋亡。

2 牛支原體的黏附因子

支原體在入侵細胞時，必不可少的過程是進行黏附。牛支原體的黏附能力很強，可以黏附于宿主的不同細胞。在研究牛支原體的黏附中，以胎牛肺細胞(EBL)最為常見，除此之外，牛氣管上皮細胞 (BBE)、胚胎牛氣管細胞 (EBTr)、牛腎細胞(MDBK)和兔腎細胞 (RK)等在研究中也常被用為宿主細胞。牛支原體的黏附作用是通過其表面結(jié)構(gòu)與宿主細胞的表面受體相結(jié)合而實現(xiàn)的。牛支原體沒有具有黏附作用的尖端細胞器[12]，它的黏附因子被認為以膜蛋白的形式散布在菌體表面[13]，下面就其黏附因子進行簡要介紹。

2.1 P26蛋白

1992年，Berthold等[14]使用牛支原體J282來篩選單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)識別26 kDa蛋白的單克隆抗體4F6有很強的特異性，可以與該試驗中所有的牛支原體反應(yīng)。1993年，Sachse等[15]發(fā)現(xiàn)4F6可以特異性阻斷牛支原體對EBL細胞的黏附，這種針對26 kDa蛋白的單克隆抗體可以使牛支原體對EBL細胞的黏附力降低。這些結(jié)果提示P26蛋白可能在牛支原體黏附中發(fā)揮作用，但目前還沒有鑒定到P26蛋白的靶蛋白。

2.2 P27蛋白

據(jù)報道，牛支原體中一種假設(shè)的脂蛋白P27具有黏附素活性[16]。P27分布在整個支原體細胞中，但大部分P27分子都暴露在膜表面。免疫熒光試驗(IFA)和特異性血清阻斷試驗表明，P27可以直接黏附到EBL細胞上，并且這種結(jié)合可以被抗P27血清特異性阻斷。進一步的試驗證實P27的靶蛋白是纖連蛋白，它們之間的相互作用是直接和特異的，呈劑量依賴性。經(jīng)過基因組比對分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有牛支原體的臨床分離株都具有p27基因[17]。

2.3 P33蛋白

2014年，吳金迪等[18]對牛支原體全基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)一個約33 ku的具有黏附特征的假定蛋白，命名為P33蛋白。P33蛋白定位于牛支原體細胞膜表面，可以黏附EBL細胞，其吸附作用被P33抗體特異性抑制，表明P33是牛支原體中一個新發(fā)現(xiàn)的具有黏附作用的膜表面相關(guān)蛋白。2019年，根據(jù)p33基因序列設(shè)計并合成特異性引物，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/P33，并獲得純度較高的P33重組蛋白，特異性好。該重組蛋白為后續(xù)開展牛支原體檢測方法及疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[19]。遺憾的是，研究沒有確定P33蛋白的靶蛋白。

2.4 膜表面可變脂蛋白家族蛋白(Vsps)

表面可變脂蛋白Vsps家族是牛支原體在黏附宿主細胞的過程中產(chǎn)生了表面可塑性后，演化出的針對特定抗體的蛋白，在黏附過程中，此類蛋白可在一定程度上幫助牛支原體抗原躲避宿主細胞免疫防御系統(tǒng)，從而便利牛支原體進一步入侵細胞，在病原體與真核細胞的相互作用、抗原變異和免疫逃避中起著至關(guān)重要的作用。該家族成員主要具有以下特點：(1)N端部分含有原核脂蛋白信號序列；(2)表面暴露的C端區(qū)域帶有廣泛的重復(fù)結(jié)構(gòu)；(3)自發(fā)非坐標相位變化率高；(4)高頻蛋白大小變化；(5)通過N末端半胱氨酸殘基處的脂質(zhì)部分將這些大量表達的可變性蛋白錨定在支原體膜中[20]。Vsp蛋白的所有氨基端都有一個保守的原核信號肽，同源性超過99%，Vsp蛋白也可以通過氨基末端錨定在細胞膜上[21]。Thomas等[22]發(fā)現(xiàn)，識別VspC和VspF的單克隆抗體可以抑制牛支原體對BBE細胞的黏附，表明VspC和VspF可能是黏附因子。Sachse等[23]對牛支原體的VspA、VspB、VspE和VspF進行研究，其競爭性黏附試驗表明，VspA、VspB、VspE和VspF的不同重復(fù)單位產(chǎn)生的一些寡肽部分抑制了牛支原體PG45菌株對胎牛肺細胞的黏附。由此表明牛支原體Vsps也是其重要的黏附因子。遺憾的是，這些研究都沒有確定這些Vsps黏附素的靶蛋白。

2.5 α-烯醇化酶和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FBA)

已有研究表明，一些胞質(zhì)代謝酶或管家酶可以定位在病原體的表面并發(fā)揮多種功能，如一些細菌代謝酶出現(xiàn)在細胞膜上時可以介導(dǎo)宿主-病原體的相互作用，讓病原菌定殖在細胞上[24]。α-烯醇化酶又稱2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，是糖酵解的限速酶之一。它是一種高度保守的蛋白[25-26]，廣泛存在于多種細菌表面。牛支原體膜蛋白結(jié)合纖溶酶原的能力與其存在的α-烯醇化酶密切相關(guān)[27]。Song等[28]對牛支原體的α-烯醇化酶蛋白進行研究，發(fā)現(xiàn)它具有纖溶酶原結(jié)合活性，而纖溶酶原可以顯著增強牛支原體黏附EBL的能力；且抗牛支原體α-烯醇化酶的抗體會特異性地抑制此種黏附能力，證實了α-烯醇化酶在牛支原體黏附過程中發(fā)揮重要作用。

同樣，F(xiàn)BA也在糖酵解過程中起重要作用，但其生物學(xué)功能遠不止于此。FBA是糖酵解、糖異生和三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶[29]，是多種致病菌中的一種多功能蛋白，是在牛支原體細胞膜上表達的一種免疫原性蛋白[30]。通過Western blot和ELISA證實FBA的目的蛋白為纖溶酶原。Huang等[31]通過Western blot和IFA進一步的亞細胞定位研究證明，F(xiàn)BA主要聚集在牛支原體的細胞質(zhì)中，也有一些在細胞膜上，并且純化的rFBA與天然的FBA一樣具有醛縮酶活性，這表明FBA在牛支原體中具有多種作用。通過EBL細胞的黏附和抑制試驗，證實rFBA可以直接黏附于EBL細胞，并且用rFBA的多克隆抗體預(yù)孵育牛支原體后，可以顯著降低牛支原體對EBL細胞的黏附效率，這再次表明牛支原體中的FBA是一種黏附素，跟牛支原體的毒力相關(guān)。

2.6 VpmaX蛋白

對牛支原體Hubei-1株的基因組分析發(fā)現(xiàn)，在該菌株的基因組中有一個注釋為VspA的基因，但該基因的編碼蛋白與PG45標準菌株的VspA蛋白完全不同，該基因被命名為VpmaX[32]。VpmaX蛋白含229個氨基酸，分子量約為35 kDa。該蛋白具有1個典型的原核信號肽和2個重復(fù)單元，其中大單元重復(fù)3次，小單元重復(fù)7次，且該結(jié)構(gòu)與Vsp家族蛋白類似。該蛋白是一種具有纖連蛋白結(jié)合特性的黏附相關(guān)蛋白，能通過EBL細胞外基質(zhì)成分纖連蛋白介導(dǎo)其黏附EBL細胞[33]。同樣，這種對EBL細胞的黏附作用可被抗VpmaX血清阻斷[34]，表明牛支原體Hubei-1株中的VpmaX蛋白也是一種黏附素分子。

2.7 P41蛋白

牛支原體Hubei-1株p41基因和p41b基因分別編碼一個32 ku的蛋白P41及一個17 ku的蛋白P41b。其中P41b蛋白是P41蛋白的C端截短體。P41是牛支原體的一種膜蛋白，對EBL細胞具有明顯的黏附現(xiàn)象，該蛋白黏附效率與蛋白濃度呈正相關(guān)。而P41蛋白發(fā)揮其黏附性的為其蛋白結(jié)構(gòu)的C端。且這種黏附作用可被不同稀釋度的抗體不同程度的抑制，抑制程度也與抗體濃度成正比。同時，相對應(yīng)的兔源抗體對牛支原體的黏附過程也起著阻斷作用，證實了P41蛋白是牛支原體的黏附相關(guān)蛋白，對EBL細胞具有明顯的黏附作用[35]。但該蛋白是否具有纖溶酶原或纖連蛋白結(jié)合特性尚不清楚，有待通過相關(guān)研究進行驗證。

2.8 NADH氧化酶

NADH氧化酶(NOX)是一類催化NADH氧化為NAD+的氧化還原酶，由NOX基因編碼，該蛋白質(zhì)含有454個氨基酸，分子量為49 kDa[36]。根據(jù)產(chǎn)物的不同，可將NOX分為兩類：一類為產(chǎn)H2O2型NADH氧化酶(NOX-1)，另一類為產(chǎn)H2O型NADH氧化酶(NOX-2)[37]。除催化作用以外，某些生物NADH氧化酶還具有其他的功能。牛支原體NOX-1與NOX-2均參與其對宿主細胞的黏附。NOX 可以特異性黏附淀粉樣蛋白前體樣蛋白-2和纖連蛋白。NOX-1在牛支原體細胞膜上和細胞漿中均有分布且胞漿中含量較高[38]。牛支原體中的NOX-2蛋白是一種膜蛋白抗原，其抗體可介導(dǎo)補體依賴性的細胞毒性殺支原體作用，并可抑制支原體對宿主細胞的黏附，可能與支原體的免疫應(yīng)答和感染相關(guān)[39]。

2.9 核糖焦磷酸激酶(prsA)

prsA蛋白是一種新鑒定的牛支原體膜蛋白，可能參與牛支原體與宿主細胞間的相互作用。prsA蛋白存在于牛支原體細胞膜和細胞漿中，具有黏附的特性。該蛋白的血清抗體具有殺牛支原體活性。prsA蛋白可能參與牛支原體對宿主細胞的感染，但該蛋白是否具有纖溶酶原或纖連蛋白結(jié)合特性尚不清楚，有待通過相關(guān)研究進行驗證[40]。

2.10 丙酮酸脫氫酶(PDE)

PDE是由3個酶組合的復(fù)合體，負責催化丙酮酸脫羧，生成乙酰輔酶A的不可逆反應(yīng)，分布在線粒體基質(zhì)中，是連接糖酵解與脂代謝、糖異生及三羧酸循環(huán)的重要媒介?；褐гw中丙酮酸脫氫酶α亞基在細胞膜和細胞質(zhì)中均有分布，其原核表達產(chǎn)物具有纖溶酶原和纖連蛋白結(jié)合活性，且丙酮酸脫氫酶α亞基兔多抗能有效激活補體并能抑制滑液支原體對宿主細胞DF-1的黏附作用[41]。對丙酮酸脫氫酶α亞基與丙酮酸脫氫酶β亞基基因序列進行擴增、分析發(fā)現(xiàn)與其他已報道的相關(guān)序列具有較高的相似性，E1亞基和E1β亞基的表面可及性與抗原指數(shù)均較高，證實丙酮酸脫氫酶E1亞基可被呈遞至牛支原體細胞膜，并具有一定的黏附特性[42]。

2.11 其他黏附因子

迄今為止，已鑒定出數(shù)十種參與牛支原體黏附的蛋白，除上述蛋白外，富含亮氨酸鏈重復(fù)序列的脂蛋白[43]、TrmF0[44]、支原體免疫原性脂肪酶A[45]、24 kDa蛋白[46]、Mbov_0503編碼蛋白[47]等也是與牛支原體黏附作用相關(guān)的分子。

3 小結(jié)與展望

牛支原體對于不同年齡的牛都具有感染性，并能與其他病原菌混合與繼發(fā)感染，共同作用造成牛患病更加嚴重[48]，其中，黏附在牛支原體入侵感染宿主細胞的過程中起了重要作用，也將對宿主細胞造成損傷。近年來發(fā)現(xiàn)的較為重要的黏附相關(guān)因子有P26蛋白、P33蛋白、Vsps、α-烯醇化酶和FBA、VpmaX蛋白、P41、NOX、prsA等，這些黏附因子通過與宿主細胞相結(jié)合來實現(xiàn)牛支原體的黏附入侵，不同黏附因子與宿主細胞上的作用與分子機制有所不同。牛支原體的發(fā)現(xiàn)時間雖然已經(jīng)超過了60年，但研究的程度并不深入。目前，針對感染牛支原體而造成的疾病臨床治療效果不佳，市面上并未有針對牛支原體的疫苗，且對于不同抗生素低敏感甚至產(chǎn)生耐藥性的菌株不斷出現(xiàn)[49]?；谶@些情況，完全闡釋牛支原體黏附因子及黏附作用機制，有利于全面解析其致病機制，從而加快研發(fā)能靶向牛支原體黏附因子的抗生素藥物或小分子制劑，以及基于支原體免疫抗原的發(fā)掘而快速研發(fā)有效疫苗，能極大地減少因感染牛支原體而造成的經(jīng)濟損失，有利于我國特別是西部地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，為全國畜牧業(yè)的發(fā)展以及促進鄉(xiāng)村振興提供助力。