基因編輯技術(shù)在豬遺傳育種中的研究進展

鄭虎，高美娟，楊化強

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

基因編輯技術(shù)利用人工核酸酶系統(tǒng)靶向切割生物體基因組特定位點，誘導(dǎo)細胞DNA損傷修復(fù)，產(chǎn)生定點突變，從而實現(xiàn)定向改變生物遺傳信息的目的。基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不同，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將目的基因隨機整合到基因組位點上使其表達，但是這種隨機插入造成了轉(zhuǎn)基因表達在不同轉(zhuǎn)基因個體之間的不一致性，影響了轉(zhuǎn)基因生物表型的穩(wěn)定性；而基因編輯可以對目的基因位點進行定點突變，實現(xiàn)目的基因型和表型的預(yù)期改造。隨著基因編輯技術(shù)的進展，先后出現(xiàn)鋅指核酸酶系統(tǒng)(zinc finger nucleases，ZFN)，類轉(zhuǎn)錄激活樣受體因子核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和規(guī)律性短回文重復(fù)序列簇系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonucleases，CRISPR/Cas)[1-4]等多種基因編輯工具。當前基因編輯已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，為生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究、農(nóng)業(yè)作物和動物遺傳改良帶來突破性進展。

在畜牧業(yè)領(lǐng)域，降低養(yǎng)殖成本、提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效率是畜牧業(yè)發(fā)展的核心。畜禽遺傳資源是畜牧養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的源頭，動物遺傳育種繁殖新技術(shù)的變革和創(chuàng)新是促進優(yōu)質(zhì)種業(yè)發(fā)展的加速劑。隨著現(xiàn)代化生物育種技術(shù)(如動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯、胚胎工程等遺傳育種和繁殖相關(guān)技術(shù))的發(fā)展，家畜育種已經(jīng)從傳統(tǒng)育種發(fā)展到以調(diào)整基因為主的現(xiàn)代分子育種技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)在改良動物表型、加快遺傳進程上具有傳統(tǒng)育種技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢。在豬的遺傳育種上，基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于改善豬的生長性狀和生產(chǎn)性能、提升抗病性，促進了現(xiàn)代生豬種業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。同時，豬在生理學(xué)和遺傳學(xué)上與人類具有較高的相似性，利用基因編輯豬作為模型動物已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究[5-6]。本文聚焦于近年來基因編輯技術(shù)在豬育種領(lǐng)域的研究成果，綜述了基因編輯技術(shù)在豬遺傳育種改良中的研究和應(yīng)用進展。

1 基因編輯技術(shù)及基因編輯工具

基因編輯通過使用特異性核酸酶識別特定基因序列，誘導(dǎo)基因組斷裂，利用基因組修復(fù)機制對斷裂基因組進行修復(fù)，實現(xiàn)目的基因位點的定向突變，從而改變生物體的特定性狀和功能。其本質(zhì)是利用人工核酸酶靶向切割DNA雙鏈，使DNA靶位點發(fā)生雙鏈斷裂(double-strand-breaks，DSBs)，激活基因組非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修復(fù)(homologous-directed repair，HDR)機制，實現(xiàn)對目的基因的敲除或敲入[7]。其中NHEJ是真核生物DNA修復(fù)的主要方式[8]，其不需要相應(yīng)的同源序列就能將DNA斷裂后的2個末端重新連接起來，這種修復(fù)一般是易錯的，導(dǎo)致DSB區(qū)域堿基缺失或額外堿基插入，引起目的基因發(fā)生移碼突變而達到基因敲除的目的[9]。HDR的修復(fù)方式以同源DNA作為修復(fù)模板，在DSB兩端的同源區(qū)域之間添加所需的修飾序列，實現(xiàn)基因敲入的效果。只有細胞內(nèi)存在與損傷DNA同源序列時，才能激活HDR修復(fù)途徑。無論NHEJ還是HDR都依賴于DSB的產(chǎn)生，基因編輯工具通過誘導(dǎo)高效的定點DSB生成，從而實現(xiàn)高效的定點基因敲除或敲入。NHEJ修復(fù)的效率遠高于HDR，因此基因編輯介導(dǎo)的基因敲除效率遠高于基因敲入的效率。通過基因編輯工具產(chǎn)生DSB可引入一系列基因組編輯效果，從點突變到大片段定點插入，實現(xiàn)對目的基因的精確改造。

1.1 ZFNs

第一代基因編輯工具是利用限制性核酸內(nèi)切酶在某些特定位置識別和切割DNA序列，隨著技術(shù)的不斷革新，ZFNs作為基因組定點編輯技術(shù)誕生。1996年，Kim等[10]將鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP，其中1個鋅指單元識別3個堿基)與FokⅠ(非特異性限制性核酸內(nèi)切酶)融合，首次構(gòu)建出具有靶向切割DNA功能的ZFN，其中DNA識別域由3～4個Cys2His2鋅指蛋白(Cys2His2ZFP)連接而成，用于特異性識別堿基三聯(lián)體[11]；DNA結(jié)構(gòu)域C端為FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域二聚形成非特異性核酸酶才具有切割基因組活性[12]，同時有利于減少對DNA的非特異性剪切。當2個ZFN分別與靶位點結(jié)合時，F(xiàn)okⅠ亞基單體結(jié)合發(fā)生二聚形成功能性核酸酶作用產(chǎn)生靶向DSB，并誘導(dǎo)DSB修復(fù)通路[10]。ZFN的特異性取決于ZFP，單個ZFP的特異性取決于周圍鋅指所在的環(huán)境和目標DNA，并不是所有的DNA三聯(lián)都有相應(yīng)的鋅指結(jié)構(gòu)域可用；ZFP與FokⅠ在靶序列上的連接方式和位置同樣會影響ZFN的結(jié)構(gòu)活性和功能特異性[13]。ZFN靶向技術(shù)的最新進展可以改進鋅指單元之間跳過核苷酸的能力，Paschon等[14]對ZFN結(jié)構(gòu)蛋白進行改造，通過改變DNA結(jié)合域和ZFN結(jié)構(gòu)域的順序，利用新的接頭跳過鋅指單元之間的核苷酸序列，即如果相鄰的3 bp并沒有合適的一個單元，則可以跳過1 bp，大大增加了ZFP與目標序列匹配的幾率，提高ZFN的靶向精確度。

然而，ZFP載體構(gòu)建較為復(fù)雜，與配體結(jié)合力較弱，ZFN剪切的過程容易形成異源二聚體，誘導(dǎo)脫靶效應(yīng)；同時引起堿基錯配和DNA序列改變，產(chǎn)生一定的細胞毒性，導(dǎo)致細胞發(fā)生死亡、額外突變[15]。此外，ZFN在識別DNA位點時，存在著上下文依賴效應(yīng)，即識別DNA的重復(fù)氨基酸時會產(chǎn)生相互作用，改變特異性識別，影響基因編輯的效果。

1.2 TALENs

TALENs是利用變形菌屬植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的天然蛋白——激活因子樣效應(yīng)物(TAL effectors，TALEs)，通過人工添加一個在特定位點切斷DNA雙鏈的核酸酶，形成的具有DNA特異性識別和切割功能的蛋白質(zhì)工具。該技術(shù)最初由Christian等[16]建立。TALENs由一個N端結(jié)構(gòu)域——核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，一個DNA識別域——特異性識別基因組靶序列，以及一個FokⅠ內(nèi)切酶的C端結(jié)構(gòu)域組成。其中DNA識別域由保守的氨基酸重復(fù)序列單元組成，每個單元又由14～18個識別DNA特異序列的TALE單元連接而成[17-18]，每個TALE蛋白通過DNA識別域識別一個對應(yīng)的堿基從而結(jié)合到靶位點上；FokⅠ DNA切割結(jié)構(gòu)域與TALE融合形成二聚體TALENs，特異性切割靶序列，其切割DNA的原理與ZFN相似。TALENs的序列單元通過組裝成模塊化蛋白質(zhì)，用于特異性結(jié)合與靶向內(nèi)源性目的基因，解決ZFNs不能任意識別目的基因序列和識別序列存在著上下文依賴效應(yīng)等問題。

與ZFNs技術(shù)相比，TALENs與DNA靶位點結(jié)合具有高度特異性，識別DNA序列較長，同源序列較少，極大地降低了脫靶率；而且TALENs相較于ZFNs，其識別性更為廣泛、靈活性更強、切割效率和成功率高，細胞毒性小。但是，TALENs構(gòu)建比較困難，需要大量的試驗步驟和技術(shù)，技術(shù)門檻較高。此外，雖然相對于ZFNs已經(jīng)有了顯著的改進，TALENs仍然存在著一定的脫靶和細胞毒性問題，還需要進一步提高精確性和安全性。

1.3 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9普遍存在于古細菌和細菌體內(nèi)，是一種菌體特異性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)首次由Ishino等[19]在大腸桿菌堿性磷酸酶基因中發(fā)現(xiàn)，之后通過對其他細菌的基因結(jié)構(gòu)進行研究，Mojica等[20]和Jasen等[21]也發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的存在，并提出用CRISPR來命名該結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)細菌及古細菌中，該結(jié)構(gòu)是由一段保守的重復(fù)序列區(qū)(repeat)和一段間隔序列區(qū)(spacer)組成的重復(fù)性DNA序列，其中spacer區(qū)用于細菌捕獲的外源基因片段。2005年，Pourcel等[22]揭示了CRISPR的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，指出CRISPR系統(tǒng)中的spacer區(qū)具有與宿主菌胞質(zhì)同源的遺傳物質(zhì)，由此認為細菌可利用CRISPR進行體內(nèi)干擾從而抵抗外源基因的入侵。2007年，Barrango等[23]研究表明宿主菌可以進一步運用CRISPR系統(tǒng)干擾噬菌體入侵菌體。研究發(fā)現(xiàn)，Cas基因可以編碼多種功能的Cas蛋白，與CRISPR序列區(qū)域共同組成CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)生作用，進而特異性識別外源性遺傳物質(zhì)的靶序列，Cas蛋白可以與CRISPR啟動子前導(dǎo)區(qū)(leader)轉(zhuǎn)錄生成的CRISPR-RNAs(crRNA)相結(jié)合，靶向切割外源性DNA序列，對抗病毒對細菌體的入侵[24]。隨后，反式激活crRNA(transactivating crRNA，tracrRNA)與crRNA前體相結(jié)合形成向?qū)NA(single-strand RNA，sgRNA)，并與Cas核酸酶作用形成復(fù)合體，特異性識別并剪斷特定核苷酸序列[25]。2008年，Marraffini等[26]研究表明CRISPR/Cas系統(tǒng)能有效阻止外源基因在體內(nèi)的合成和表達，隨后研究者揭示CRISPR/Cas系統(tǒng)是微生物體內(nèi)一種可穩(wěn)定遺傳的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能將病毒的遺傳序列轉(zhuǎn)化為自身序列，保護自身進行二次免疫。

由于不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)在適應(yīng)階段具有高度保守性，且其在表達、干擾階段有所差異，故將其分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，適用于基因編輯最常用和最具特征的CRISPR/Cas系統(tǒng)是基于化膿鏈球菌發(fā)展而來的Ⅱ型基因編輯工具——CRISPR/Cas9系統(tǒng)。2012年，Jinek等[27]首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9可以通過sgRNA作為單一轉(zhuǎn)錄本進行編程用于體外靶向DNA切割。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的原理，Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9蛋白——核酸內(nèi)切酶活性、crRNA——靶向特異性和tracrRNA，其中crRNA和tracrRNA結(jié)合形成一條sgRNA，sgRNA與原間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列(NGG)毗鄰的靶DNA互補，由一段識別序列(20 bp)和一段重復(fù)序列組成，其中識別序列利用堿基互補原則靶向結(jié)合到基因位點上，Cas蛋白與重復(fù)序列形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)用以發(fā)揮核酸酶內(nèi)切功能，靶向切斷雙鏈核苷酸目的序列[1]]，形成DSB，雙鏈DNA斷裂后利用NHEJ和HDR兩種方式進行細胞自我修復(fù)，從而對靶點堿基進行隨機插入或刪除，使基因產(chǎn)生移碼突變或破壞基因組結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因組功能失效或基因敲除[9]。2013年，Cong等[28]首次利用CRISPR/Cas9在人293T細胞與小鼠Nero2A細胞進行靶向基因定點突變，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因編輯新技術(shù)的應(yīng)用，推動了基因編輯的不斷更新。隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究不斷深入，科學(xué)家將多個sgRNA表達框構(gòu)建到相應(yīng)靶點序列，然后將其整合在同一個載體中，從而實現(xiàn)sgRNA表達框的共同表達，其高切割活性允許在單個反應(yīng)中同時靶向單個細胞中的多個DNA序列位點，從而敲除多個基因或染色體長片段，實現(xiàn)更靈活和多樣化的基因修飾效果。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)相較于ZFN和TALEN，具有打靶特異性、高精度性和操作簡單等優(yōu)點，僅需sgRNA引導(dǎo)即可對基因組任意位點進行打靶，切割能力不受基因組甲基化影響[29]，編輯效率高、成本低，在動植物基因編輯中得到了廣泛的利用，大大降低了基因編輯的門檻。但是，CRISPR/Cas9在應(yīng)用上依賴PAM序列，依然存在脫靶效應(yīng)和大片段插入效率低等問題。表1對目前基因編輯系統(tǒng)的特點進行了相關(guān)比較(表1)。

表1 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的比較

2 基因編輯在豬育種中的應(yīng)用

基因編輯通過引入新的遺傳變異(如遺傳缺陷的修復(fù)、無關(guān)基因的滅活、有用的等位基因和單倍型在品種間的表達等)來加速畜禽遺傳改良，利用基因編輯技術(shù)對經(jīng)濟性狀相關(guān)基因進行編輯(敲除、插入或修飾)，增加群體中有利等位基因的頻率來提高群體遺傳效益，促進畜禽生產(chǎn)。在豬的育種工作中，種系傳播是最終目標，編輯后的目標基因必須穩(wěn)定傳遞給下一代，以進行群體或種系遺傳改良。常用的基因編輯育種策略主要利用體細胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer technique，SCNT)將編輯好的細胞系進行克隆，在一代內(nèi)即可產(chǎn)生基因純合修飾的基因編輯豬，但是該方案也存在核移植效率低以及基因編輯克隆后代出生率低的缺陷；另一種制備基因編輯豬的策略是直接對豬單細胞胚胎進行CRISPR注射，該方案操作較為簡便，同時也可避免基因編輯克隆豬制備效率低的問題，但是該種方案出生的后代一般都為嵌合體動物，需要繼續(xù)雜交1～2代以獲得純合基因編輯動物。基因編輯現(xiàn)階段已應(yīng)用于下述多個性狀的種豬遺傳育種改良。

2.1 提高生產(chǎn)性能

豬肉是最主要的肉類食物來源，改良豬肉相關(guān)經(jīng)濟性狀是豬育種工作的重點之一。肌肉的發(fā)育和體重的增長通過垂體和肝臟系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，主要由生長激素(growth hormone，GH)-胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)軸通過IGF-1R/Akt/mTOR信號通路進行調(diào)控[30]。1985年，Hammer等[31]將人源性GH通過胞質(zhì)注射導(dǎo)入母豬受精卵內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因豬，與野生型豬相比，GH轉(zhuǎn)基因顯著提高了豬的生長速度。另有研究將豬源性的GH轉(zhuǎn)入湖北白豬體內(nèi)獲得的轉(zhuǎn)基因豬，與野生型豬相比，其生物轉(zhuǎn)化率提高10%左右。GH由腦垂體釋放，刺激肌肉、肝臟等組織中的IGF-1表達，研究表明來自肌肉和肝臟中IGF-1均能刺激肌肉發(fā)育。Pursel等[32]通過向受精卵中注射DNA，成功地將編碼GH和IGF-1的基因引入豬體內(nèi)，其中表達GH轉(zhuǎn)基因的2個家系比野生型豬的體重增加了11.1%和13.7%，飼料轉(zhuǎn)化效率均提高了18%左右，皮下脂肪水平降低，肌肉、皮膚和骨骼發(fā)育速度增加。表達IGF-1的轉(zhuǎn)基因豬其生長速度雖與野生型豬類似，但脂肪含量顯著減少，瘦肉組織顯著增加。雖然在生長性能上有了明顯改善，但也發(fā)現(xiàn)GH轉(zhuǎn)基因豬存在跛行、嗜睡和胃潰瘍增加等生理缺陷，對壓力的有效反應(yīng)能力降低等問題。IGF-2是IGF-1的姐妹分子，也在肌肉發(fā)育和脂肪沉積中起關(guān)鍵作用，IGF-2基因調(diào)節(jié)區(qū)的突變調(diào)控豬肌肉生長水平。1999年，Jeon等[33]發(fā)現(xiàn)豬IGF-2第3個內(nèi)含子處的核苷酸突變使得IGF-2在骨骼肌發(fā)育過程中的表達顯著增加，有效提高瘦肉率。2018年，Xiang等[34]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對IGF-2基因第3個內(nèi)含子上的單核苷酸位點(第3 072位核苷酸)進行突變，培育出IGF-2基因修飾巴馬豬，與野生型豬相比，其產(chǎn)肉量和瘦肉率都顯著增加。2019年，Liu等[35]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts，PFFs)進行編輯，破壞與ZBED6結(jié)合的IGF-2第3個內(nèi)含子序列位點，從而消除了ZBED6阻遏物的結(jié)合，使其調(diào)節(jié)功能喪失，培育出具有較高瘦肉率的IGF2基因編輯豬。

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)是個體生長、肌肉發(fā)育和脂肪沉積研究的常見靶點，對肌肉生長起負調(diào)控作用，其突變會誘導(dǎo)肌肉發(fā)育或產(chǎn)生“雙肌”性狀。MSTN基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，其中第3個外顯子決定了MSTN成熟肽的作用，可以通過破壞第3個外顯子的結(jié)構(gòu)使MSTN生物活性喪失。2015年，Qian等[36]利用ZFN技術(shù)培育出MSTN基因突變的梅山豬，與野生型豬相比，MSTN突變體生長發(fā)育正常，肌肉質(zhì)量增加，脂肪沉積減少，純合MSTN突變體(MSTN-/-)具有明顯的“雙肌”表型。吳添文等[37]使用TALEN技術(shù)對MSTN基因進行編輯并培育出MSTN基因突變大白豬、梅山豬。華文君等[38]利用CRISPR/Cas9編輯MSTN位點，并結(jié)合SCNT技術(shù)獲得高產(chǎn)瘦肉基因編輯豬新種質(zhì)——中超916。2016年Bi等[39]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)產(chǎn)生無選擇性標記基因的MSTN基因單敲除克隆豬，其中MSTN表達量下降50%，肌源性基因表達顯著上升，提高了肌纖維數(shù)量，增加了豬體瘦肉率。2017年，Wang等[40]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯PFF細胞中MSTN基因，并運用SCNT技術(shù)成功培育出MSTN雙等位基因突變克隆豬，與野生型豬相比，基因編輯豬肌纖維數(shù)目增加，出現(xiàn)明顯的肌間溝，豬體瘦肉率得到顯著提高。2020年，Li等[41]使用CRISPR/Cas9將PVD20H和GP19del突變基因?qū)胫袊就霖i種的MSTN信號肽區(qū)，發(fā)現(xiàn)信號肽中的2個突變都增加了肌肉質(zhì)量，這種策略可以上調(diào)肌源性調(diào)節(jié)因子(MyoD、Myogenin和Myf-5)的表達，且不影響細胞中MSTN成熟肽的產(chǎn)生。該研究表明通過對MSTN信號肽進行精確編輯也可以提升豬肌肉的發(fā)育。然而，有報道指出，MSTN敲除豬雖然有效改善了產(chǎn)肉量和瘦肉率，但同時出現(xiàn)一系列動物健康問題，如MSTN純合基因敲除豬存在腿部發(fā)育異常、無法站立和行走以及高死亡率的問題。Kang等[42]報道了MSTN基因敲除豬具有肌肉發(fā)達、瘦肉增加和背膘減少的優(yōu)點，但在長白品種的MSTN純合敲除仔豬中存在前腿或后腿異常、無法站立和行走的問題，受影響的小豬無法競爭哺乳，并在出生后3 d內(nèi)死亡。

SCF E3泛素連接酶在許多細胞基礎(chǔ)活動過程中發(fā)揮重要作用，其由SKP1、Cullin-1/Cdc53和一種Fbox蛋白組成，F(xiàn)box蛋白賦予復(fù)合物底物特異性，其中Fbxo40誘導(dǎo)胰島素受體底物-1(IRS1)泛素化，從而使IGF-1/Akt通路失活[43]。Fbxo40表現(xiàn)出肌肉特異性表達模式[44]，在Fbxo40基因敲除小鼠中，IGF-1/Akt途徑激活，體重和肌肉質(zhì)量顯著增加。2018年，Zou等[45]利用CRISPR/Cas9技術(shù)和SCNT制備了Fbxo40基因敲除豬。在Fbxo40基因敲除豬的肌肉中，IRS1水平提高，IGF-1/Akt通路激活。與野生型對照相比，F(xiàn)bxo40敲除豬的肌肉質(zhì)量增加了約4%，瘦肉率也得到提升，且Fbxo40基因敲除豬沒有任何異常表型。因此，F(xiàn)bxo40可作為未來規(guī)避MSTN突變副作用的可能替代基因操作位點，然而這一觀點尚未被充分證實，需要進一步的研究來驗證其可行性和安全性。Fbxo40和MSTN基因敲除動物之間的差異可能是由于基因時空表達或調(diào)節(jié)的差異所致，F(xiàn)bxo40主要在出生后的動物骨骼肌中表達[44]，而MSTN在胚胎發(fā)育到成年期都有表達，其通過自分泌或旁分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)肌肉細胞原始細胞[46]。因此，MSTN可能更廣泛地影響包括肌肉在內(nèi)的多種器官發(fā)育，而Fbxo40的功能僅限于骨骼肌。表2匯總了目前已報道的采用基因編輯策略提升豬生產(chǎn)性能的研究(表2)。

表2 基因編輯技術(shù)在提高豬生產(chǎn)性能上的應(yīng)用

2.2 改善豬肉品質(zhì)

當前養(yǎng)豬業(yè)除了提高豬肉的產(chǎn)量，對豬肉品質(zhì)的要求也不斷提高。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids，UFAs)具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防血栓、調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)效用，有較高的營養(yǎng)價值。哺乳動物自身不能合成或合成的量不能滿足機體生長發(fā)育所需，需通過采食來攝取體內(nèi)所需的UFAs。2004年，Saeki等[47]在豬的基因組中導(dǎo)入菠菜根部脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase-2，F(xiàn)AD-2)基因，獲得了高不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acid，HUFA)轉(zhuǎn)基因豬，其不飽和脂肪酸的含量比野生型豬高20%。多不飽和脂肪酸(ploy unsaturated fatty acids，PUFAs)分為ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸兩大類，ω-6脂肪酸促進炎癥的發(fā)生，而ω-3脂肪酸卻能延緩身體自我防衛(wèi)機制中那些不利方面的過度反應(yīng)，抑制炎癥的發(fā)生，可有效改善心腦血管疾病。由于豬的體內(nèi)缺乏相應(yīng)脂肪酸轉(zhuǎn)化酶，ω-6脂肪酸不能自主轉(zhuǎn)化為ω-3脂肪酸[48]。秀麗隱桿線蟲體內(nèi)含有一種編碼脂肪酸去飽和酶的基因(Fat-1)，可以將ω-6多不飽和脂肪酸(ω-6 PUFAs)轉(zhuǎn)化為ω-3多不飽和脂酸(ω-3 PUFAs)。2006年，Lai等[49]將Fat-1基因引入豬的基因組中，生產(chǎn)出富含ω-3 PUFAs的轉(zhuǎn)基因豬，豬肉的營養(yǎng)價值得到顯著提高。2012年，Zhang等[50]將編碼子優(yōu)化的mFat-1基因插入真核表達載體中，生產(chǎn)表達mFat-1基因的轉(zhuǎn)基因豬。2018年，Li等[51]通過CRISPR/Cas9技術(shù)將Fat-1基因成功插入豬Rosa26(pRosa26)基因座上，培育出定點修飾的Fat-1轉(zhuǎn)基因豬。然而，由于這些轉(zhuǎn)基因豬缺乏Δ-12去飽和酶(Fat-2)基因，只將外源性而非內(nèi)源性產(chǎn)生的ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs。2019年，Tang等[52]利用SCNT技術(shù)成功培育出脂肪酸去飽和酶Fat1-Fat2共表達的轉(zhuǎn)基因豬，使肌間脂肪組織中ω-3和ω-6的含量得到顯著提高。2021年，You等[53]通過使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和SCNT技術(shù)，將Fat-1和IGF-1基因精確插入pRosa26基因座上，獲得定點修飾的雙基因轉(zhuǎn)基因豬，其中ω-3 PUFAs水平顯著增加，并降低ω-6/ω-3 PUFAs比率，提供了富含ω-3 PUFAs的肉類。生產(chǎn)中在提高豬肉ω-3 PUFAs含量的同時，人體也應(yīng)該合理控制對ω-3 PUFAs的攝入量，不宜過量，因為ω-3 PUFAs攝入過量會延長人體凝血時間，增加出血風險，同時引起機體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞損傷和炎癥反應(yīng)，抑制免疫系統(tǒng)，增加疾病感染風險等不良影響。

豬牛羊等肌肉細胞表面存在α-半乳糖苷抗原(galactose-α-1，3-galactose，α-gal)，食用紅肉(豬肉、牛肉和羊肉)可能會在部分人群誘發(fā)過敏[54]。同時紅肉細胞表面存在大量的N-甘氨酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)[55]，一旦被機體吸收，就會結(jié)合在人類細胞表面，引發(fā)慢性炎癥，從而導(dǎo)致結(jié)、直腸癌和動脈粥樣硬化。這些罕見的綜合征可以通過基因編輯培育基因敲除動物去除肌肉表面的過敏抗原來避免。CMPN-甘氨酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)基因敲除可以將豬中的Neu5Gc轉(zhuǎn)化為人源性Neu5Ac，消除Neu5Gc的副作用。Yen等[56]通過將CRISPR/Cas9制備的α-Gal敲除和Neu5Gc敲除豬進行雜交獲得雙基因敲除后代，發(fā)現(xiàn)雙基因敲除型豬比野生型豬誘發(fā)的炎癥更少，減少紅肉過敏現(xiàn)象，將其作為健康的紅肉來源。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor gammaco-activator 1 alpha，PGC1α)是一種調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化和線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄共激活因子。2017年，Zhang等[57]和Ying等[58]通過過表達豬肌肉中PGC1α基因，顯著增加了肌肉線粒體的生物發(fā)生，通過增強線粒體呼吸和脂肪酸氧化，將快速糖酵解纖維轉(zhuǎn)化為緩慢和氧化纖維，改善肉色，降低滴水損失，有效提高豬肉品質(zhì)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是脂肪形成的主要調(diào)節(jié)因子，在骨骼肌纖維形成和脂肪沉積中起重要作用，2021年，Gu等[59]制備了肌肉特異性過表達PPARγ的轉(zhuǎn)基因豬，PPARγ可通過激活脂肪細胞分化調(diào)節(jié)因子的增強表達來促進脂肪細胞分化，從而進行脂肪沉積，顯著增加PPARγ轉(zhuǎn)基因豬肌肉內(nèi)脂肪含量。特異性PPARγ的過表達也可以促進氧化纖維的形成，同時保持了胴體瘦肉率。表3對目前已報道的基因編輯改善豬肉品質(zhì)的研究做出相關(guān)匯總(表3)。

表3 基因編輯技術(shù)在改善豬肉品質(zhì)上的應(yīng)用

2.3 改善仔豬抗寒性

解偶連蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)位于線粒體內(nèi)膜，通過解偶聯(lián)ATP合成和質(zhì)子穿過內(nèi)膜產(chǎn)生熱量。UCP1是非寒顫產(chǎn)熱的關(guān)鍵因子，負責棕色脂肪組織(BAT)介導(dǎo)的產(chǎn)熱，在提高仔豬有效抗寒和調(diào)節(jié)體溫平衡方面起關(guān)鍵作用，UCP1還參與動物脂肪沉積，調(diào)節(jié)身體肥胖方面發(fā)揮重要作用。豬線粒體中的UCP1表達非常低甚至不存在，引起B(yǎng)AT功能表達較弱，機體產(chǎn)熱性能下降，加速脂肪沉積，盡管Lin等[60]證明了豬的冷適應(yīng)依賴于BAT細胞中的UCP3，但由于仔豬出生后體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)育不良，機體缺乏非寒顫產(chǎn)熱，仔豬表現(xiàn)出較差的熱調(diào)節(jié)。2017年，Zheng等[61]通過外源性小鼠UCP1的cDNA構(gòu)建了豬脂聯(lián)素啟動子，并使用CRISPR/Cas9技術(shù)將其定點插入到豬內(nèi)源性UCP1基因外顯子的第2位點位上，成功制備出能夠抗寒的轉(zhuǎn)UCP1基因豬。試驗發(fā)現(xiàn)，在4 ℃寒冷條件下，野生型仔豬體內(nèi)直腸溫度在急性冷暴露環(huán)境下的前2 h表現(xiàn)出體溫持續(xù)下降，在第3和第4小時略有恢復(fù)，但仍顯著低于UCP1轉(zhuǎn)基因仔豬的直腸溫度，而UCP1轉(zhuǎn)基因仔豬體內(nèi)直腸溫度可以保持38 ℃的正常體溫4 h，且比野生型仔豬體溫高2 ℃。由于脂聯(lián)素啟動子驅(qū)動脂肪細胞UCP1的表達，與野生型仔豬相比，轉(zhuǎn)UCP1基因豬生長正常，背膘厚度、脂肪細胞大小和體脂沉積均顯著減少，胴體瘦肉率得到顯著提高。

2.4 提高抗病性

當今養(yǎng)豬業(yè)高密度的飼養(yǎng)模式加速了豬傳染性疾病的發(fā)生和傳播，這些傳染性疾病造成生豬養(yǎng)殖死亡率上升、生產(chǎn)效率下降，極大地降低了養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟效益?；蚓庉嫾夹g(shù)的新突破從遺傳本質(zhì)上賦予動物對病原感染的抗性，為預(yù)防和控制養(yǎng)殖業(yè)傳染性疫病提供了新的思路。近年來，基因編輯技術(shù)在豬抗病育種研究中取得諸多進展，如利用全基因組學(xué)鑒別致病毒力基因、誘導(dǎo)基因靶向缺失或突變制備弱毒或減毒疫苗、進行動物抗病育種改良等。

2.4.1 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，即豬藍耳病，可引起妊娠后期母豬流產(chǎn)，感染仔豬呼吸系統(tǒng)，引起呼吸系統(tǒng)傳染病甚至死亡。PRRS的病原是豬繁殖和呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，具有高度傳染性，同時由于PRRSV的高進化率，PRRSV分離株顯示出高度的遺傳和抗原變異性，阻礙了疫苗免疫的有效性。PRRSV感染宿主細胞主要通過受體介導(dǎo)的途徑，PPRSV在宿主體內(nèi)表現(xiàn)出精準的細胞嗜性，靶向豬單核細胞或巨噬細胞的特定亞群，并通過硫酸乙酰肝素(heparan sulphate，HS)，唾液黏附素(sialoadhesin，Sn)和清道夫受體CD163(cluster of differentiation 163)等多個受體感染宿主細胞[62]。

2016年，Whitworth等[63]敲除豬受體基因CD163后對其進行攻毒，發(fā)現(xiàn)CD163基因敲除豬對PRRSV感染具有完全抗性，證實CD163是PRRSV入侵宿主時的關(guān)鍵受體。CD163第7個外顯子上富含與病毒互作位點——半胱氨酸結(jié)構(gòu)域5(scavenger receptor cysteine-rich domain 5，SRCR5)。目前，通過基因編輯技術(shù)對CD163的敲除、CD163基因第7個外顯子SRCR5的缺失和病毒感染袋中第7個外顯子的部分缺失已經(jīng)實現(xiàn)了對PRRSV感染的抗性提升。2017年，Burkard等[64]通過胚胎注射CRISPR/Cas9消除CD163的第7外顯子，成功制備了CD163基因外顯子7缺失的基因編輯豬，攻毒試驗顯示基因編輯豬對PRRSV-1和PRRSV-2感染具有抵抗力。2019年，Guo等[65]利用CRISPR/Cas9技術(shù)精確地敲除了兩廣小花豬和大白豬品種中CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域中一段長度為41個氨基酸片段，通過病毒感染試驗發(fā)現(xiàn)這些基因編輯豬對PRRSV-2具有抗性。2020年，Xu等[66]使用CRISPR/Cas9和SCNT成功地產(chǎn)生了CD163和pAPN(豬氨肽酶N，一種導(dǎo)致傳染性胃腸炎病毒TGEV感染的因子)雙基因敲除(double knock-out，DKO)的基因編輯大白豬，通過攻毒試驗發(fā)現(xiàn)這些DKO豬對PRRSV-2和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表現(xiàn)出完全抗性，且與野生型豬相比，其生產(chǎn)性能和繁殖性能沒有顯著差異。2021年，Tanihara等[67]通過電穿孔將靶向CD163基因第7外顯子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入豬體外受精的受精卵中，也制備了對PRRSV具有抗性的基因編輯豬。

2.4.2 非洲豬瘟

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種傳播速度快、致病性和死亡率高的傳染病，其發(fā)病過程短，可引起豬發(fā)生急性出血熱，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。ASF是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起，ASFV的基因組龐大且復(fù)雜，DNA大小在170 kb至190 kb，可編碼150多個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中包含50種結(jié)構(gòu)蛋白和100種宿主誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)蛋白[68]。豬巨噬細胞是ASFV攻擊的天然靶細胞，抗CD163基因的抗體能夠抑制ASFV對宿主細胞的攻擊，減弱ASFV與巨噬細胞的結(jié)合，推測其可以作為ASFV侵染宿主的潛在受體，然而，Popescu等[69]用ASFV攻擊CD163 KO豬，發(fā)現(xiàn)CD163基因編輯豬不能抵抗ASFV的感染，在CD163 KO和野生型豬之間觀察到臨床癥狀和毒理學(xué)幾乎沒有差異。由于疣豬和家豬感染ASFV后癥狀有顯著差異，Palgrave等[70]對二者進行比較分析發(fā)現(xiàn)疣豬和家豬之間RELA(NF-κB轉(zhuǎn)錄因子P65亞基)基因存在序列差異，推測RELA基因的多態(tài)性可能賦予豬對ASFV感染的不同敏感性，并有后者通過TALEN和ZFN制備了RELA點突變的基因編輯豬[71]。然而，通過替換3個氨基酸引起的RELA突變并沒有使家豬對ASFV產(chǎn)生明顯抗性，它只是延遲了臨床癥狀的發(fā)作，并導(dǎo)致一些動物鼻分泌物和血液中的病毒減少[72]。Hübner等[73]用編碼Cas9的質(zhì)粒和靶向ASFV CP204L的sgRNA轉(zhuǎn)染豬細胞，證明該CRISPR系統(tǒng)能在細胞水平抑制ASFV的感染，Cas9切割病毒基因組使病毒產(chǎn)量降低了4個數(shù)量級。

2.4.3 偽狂犬病

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是一種強急性自然疫源傳染病，病原是偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)，也稱(suid herpesvirus-1，SuHV-1)。豬是PRV的天然宿主和傳染源，在病豬中表現(xiàn)為消化道、呼吸道和神經(jīng)性疾病，其中仔豬極易患病，表現(xiàn)為高熱、腹瀉嘔吐和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，具有較高死亡率，妊娠母豬感染后出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等繁殖性障礙，嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。

目前已有多項利用基因編輯技術(shù)修飾宿主基因進行PRV抗病育種的研究。PRV對宿主細胞的感染可以由細胞膜蛋白Nectin1和Nectin2(PRV病毒糖蛋白gD候選受體)介導(dǎo)，2020年，Huang等[74]利用CRISPR/Cas9靶向PK15細胞中敲除Nectin1和Nectin2基因，與野生型(WT)細胞相比，Nectin1或Nectin2基因敲除細胞中的PRV載量顯著減少。通過同時敲除PK15細胞中的Nectin1和Nectin2，發(fā)現(xiàn)與單基因敲除細胞相比，雙基因敲除細胞對PRV的抵抗力沒有進一步增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Nectin1或Nectin2 KO不會顯著影響病毒對細胞的吸附和內(nèi)化，但會阻斷PRV在細胞間傳播。因此Nectin1和Nectin2可能是有效的PRV抗病育種候選基因位點。先前的研究報道，Nectin1的胞外N-末端可變區(qū)樣(V)結(jié)構(gòu)域?qū)Ζ涟捳畈《靖腥竞苤匾承埢械陌被崛〈鷷乐亟档蚉RV gD/Nectin1結(jié)合和PRV感染能力[75]。2022年，Yang等[76]將Nectin1的129位處的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼岙a(chǎn)生Nectin1(F129A)點突變小鼠，用PRV感染突變小鼠發(fā)現(xiàn)，純合突變小鼠顯著減輕了疾病表型，降低了血清與腦組織中的病毒載量和小鼠死亡率。Nectin1基因修飾是賦予動物PRV抗性的有效途徑，為培育PRV抗病豬提供方法參考。CRISPR/Cas9可直接剪切PRV基因組來清除胞內(nèi)病毒，從而有效防治PRV感染。2017年，Tang等[77]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向PRV基因組中的多個基因位點(多為病毒基因組UL和Us區(qū))，設(shè)計了75組sgRNA，通過熒光素酶(Luciferase)標記PRV進行sgRNA高通量篩選，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)sgRNA顯著抑制PRV復(fù)制，使用多個sgRNA同時靶向PRV可完全抑制細胞中PRV的復(fù)制。2018年，Ren等[78]構(gòu)建了靶向PRV UL30的CRISPR系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其可以在細胞水平顯著抑制PRV的感染。H?lper等[79]建立了豬sgRNA文庫，靶向豬基因組中所有注釋基因，并使用該文庫篩選PRV感染豬細胞的關(guān)鍵宿主基因。該研究鑒定出鞘磷脂合酶1(sphingomyelin synthase 1，SMS1)在PRV感染中發(fā)揮重要作用。表4對當前基因編輯在提高豬只抗病性方面的應(yīng)用進行了相關(guān)概括(表4)。

表4 基因編輯在提高豬只抗病性上的應(yīng)用

3 小結(jié)和展望

基因編輯技術(shù)可快速實現(xiàn)豬的生產(chǎn)性能、抗逆性和抗病性等方面的改良，對養(yǎng)豬業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展具有重要意義。雖然當前基因編輯在技術(shù)操作上并無顯著瓶頸，但該技術(shù)在應(yīng)用中仍存在一定的脫靶效應(yīng)、額外DNA插入等問題，基因編輯豬的生物安全具有一定風險性。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對農(nóng)業(yè)用基因編輯產(chǎn)品其脫靶性、載體片段隨機的整合和載體序列殘留等具有一定要求，且要求編輯后的基因在個體間無基因漂移的發(fā)生，這就需要提高基因編輯對目的基因定點修飾的效率、降低脫靶效應(yīng)，建立更加優(yōu)良的基因編輯系統(tǒng)，培育符合生物安全規(guī)范的基因編輯豬。

盡管基因編輯豬在實驗室中顯示出潛在優(yōu)勢，但其能否用于商業(yè)化生產(chǎn)還存在一定的生物安全性和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用問題，亟待我們進一步研究和解決。農(nóng)業(yè)部要求農(nóng)業(yè)用基因編輯產(chǎn)品的生物安全需滿足食用安全和環(huán)境安全，即不會對人類健康或環(huán)境造成危害，因此，基因編輯豬的食品安全需要經(jīng)過嚴格的實驗室試驗驗證，對基因編輯豬自身健康狀況、行為表現(xiàn)、生長和繁殖能力以及豬肉的營養(yǎng)價值、毒性和過敏原性等方面進行安全性評估，使優(yōu)良經(jīng)濟性狀的基因編輯豬肉滿足人體食用標準，同時對基因編輯豬進行嚴格的環(huán)境風險評估，以確保不會對環(huán)境造成負面影響。此外，基因編輯豬能否用于商業(yè)化生產(chǎn)，除了基于基因編輯豬對人類、自身和環(huán)境是否有益外，還取決于社會公眾的可接受性，當前人們對基因編輯的倫理問題還具有爭議，在基因編輯全面到來以前，人們?nèi)孕璞３志?、審慎、包容和?chuàng)新的態(tài)度接受該技術(shù)的應(yīng)用。因此，建立合理的基因編輯產(chǎn)品管理體系、強化監(jiān)管和審批流程，進行公眾教育，以提高公眾對基因編輯技術(shù)的認識和理解，推進基因編輯動物從實驗室走向市場。