基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路探討健骨顆粒對(duì)UMR-106細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響

陳賽楠，周 芬，黃云梅，林燕萍*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；

2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；

3 福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003；

4 福建中醫(yī)藥大學(xué)雜志社，福建 福州 350122

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是雌激素水平急劇降低引發(fā)骨量下降和骨微結(jié)構(gòu)破壞，致使骨強(qiáng)度減弱和脆性骨折發(fā)病率增加的全身性代謝性疾病，屬于高轉(zhuǎn)換型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥［1］。破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成是維持骨穩(wěn)態(tài)的重要因素，雌激素在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，PMOP 發(fā)生時(shí)骨吸收量和骨形成量均增強(qiáng)，但是骨吸收量大于骨形成量。雌激素還是一種抗氧化劑［2］，雌激素水平降低和衰老等因素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體活性氧（reactive oxygen species，ROS）過(guò)度堆積［3］，氧化還原平衡被打破，進(jìn)一步誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），近十年來(lái)許多研究顯示ERS 與PMOP 的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［4-5］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾等功能的正常發(fā)揮是細(xì)胞存活的必要條件，氧化還原狀態(tài)的改變和鈣離子流動(dòng)異常等引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，從而觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），輕度的UPR 可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，然而持續(xù)、過(guò)強(qiáng)的UPR 引起細(xì)胞凋亡；因成骨細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，特別容易受到ERS 引起的功能障礙影響，阻礙其增殖分化甚至凋亡，從而導(dǎo)致PMOP 的發(fā)生和發(fā)展。PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路是ERS 的最主要的信號(hào)通路之一，同樣在骨代謝調(diào)控中起關(guān)鍵作用［6］，為調(diào)控ERS相關(guān)疾病如PMOP提供新思路。

健骨顆粒是治療PMOP 的經(jīng)驗(yàn)方，臨床效果顯著，課題組前期研究顯示健骨顆粒可有效清除機(jī)體內(nèi)多余ROS，并且對(duì)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用［7］，然而是否通過(guò)PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路減輕ROS/ERS 引起的成骨細(xì)胞凋亡尚未涉及。本研究采用過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)UMR-106細(xì)胞形成ROS/ERS模型，觀察健骨顆粒含藥血清對(duì)ROS、細(xì)胞凋亡率和PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路的影響，探討健骨顆粒保護(hù)ROS/ERS 的UMR-106 細(xì)胞模型的潛在機(jī)制，為PMOP 的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)6 周齡雄性SD 大鼠40 只，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（閩）1908140006］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室［使用許可證：SYXK（閩）2019-0007］，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，本研究已通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員審核會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)［批準(zhǔn)號(hào)：福中醫(yī)倫理審字［2018］第（038）號(hào)］。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

UMR-106 成骨樣細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（目錄號(hào)：TCR11）。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1實(shí)驗(yàn)藥物 健骨顆粒由淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥、煅狗骨等組成，購(gòu)自福建省同春藥業(yè)股份有限公司（每克顆粒劑含原生藥2.9 g），由福建省中醫(yī)藥科學(xué)院內(nèi)試車間依照課題組制劑工藝標(biāo)準(zhǔn)煎煮濃縮，制備成健骨顆粒浸膏，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；FBS購(gòu)自于美國(guó)Gibco 公司；GSK2606414 購(gòu)自于美國(guó)APExBIO 公司；活性氧分析試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；HiScript Q RT SuperMix for qPCR、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 均購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PERK 一抗購(gòu)自于美國(guó)Cst 公司；eIF2α、ATF4、CHOP、β-actin 一抗均購(gòu)自于Pronteintech公司；Capase-12一抗購(gòu)自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Fluo-3 AM 購(gòu)自于株式會(huì)社日本同仁化學(xué)研究所。

1.3.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自于香港力康公司；低速離心機(jī)購(gòu)自于德國(guó)Eppendorf 公司；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自于日本TKO 光學(xué)儀器株式會(huì)社；激光共聚焦掃描顯微鏡購(gòu)自于卡爾蔡司光學(xué)有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自于美國(guó)BD 公司；7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自于美國(guó)Life technologies 公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1生理鹽水血清和健骨顆粒含藥血清制備 將40 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水血清組和健骨顆粒含藥血清組，每組20只。生理鹽水組采用生理鹽水灌胃，健骨顆粒灌胃劑量根據(jù)人和大鼠的體表面積進(jìn)行換算，按照7.8 g/（kg·d）生藥量連續(xù)灌胃7 d，最后一次灌胃后2 h后腹主動(dòng)脈取血，靜置4 h 后3 000 r/min 離心15 min 取血清，56 ℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體，0.22 μmol/L 過(guò)濾器過(guò)濾后分裝，存儲(chǔ)于-80 ℃超低溫冰箱。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組干預(yù) 選用UMR-106細(xì)胞，采用10% FBS、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（NC組）、模型組（H2O2組）、健骨顆粒組（H2O2＋JG組）和陽(yáng)性對(duì)照組（H2O2＋GSK2606414組）。NC組和H2O2組采用10%生理鹽水血清干預(yù)12 h，H2O2＋JG 組采用10%健骨顆粒含藥血清干預(yù)12 h，H2O2＋GSK2606414組采用0.03 μmol/L 的GSK2606414 和10%生理鹽水血清干預(yù)12 h，除NC 組外，其余各組在不更換新培養(yǎng)基的情況下，再分別加入10 μmol/L H2O2干預(yù)12 h制備ERS模型。

1.4.3CCK8法篩選GSK2606414最佳干預(yù)濃度 將UMR-106 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種在96 孔板中并培養(yǎng)24 h，采用不同濃度（0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 μmol/L）的GSK2606414 處理細(xì)胞，每個(gè)濃度重復(fù)6 次，孵育12 h，每孔加入CCK8 10 μL，37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度，選取對(duì)UMR-106細(xì)胞活力沒(méi)有影響的最大濃度作為GSK2606414 的最佳干預(yù)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GRP78 和Caspase-12 熒光表達(dá)情況 將UMR-106 細(xì)胞按8×104個(gè)/mL 接種至共聚焦皿，分別培養(yǎng)24 h，棄液，PBS 洗滌3 min×3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌；3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min×3 次；SABC 室溫孵育10 min，PBS 洗滌；封閉液孵育1 h，棄液，分別加入GRP78（1∶1 000）和Caspase-12（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜；棄液，PBS 洗滌，避光加入1∶1 000 熒光二抗室溫孵育1 h；PBS 洗凈，加入500 μL DAPI 孵育10 min，PBS 洗凈后激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

1.4.5DCFH-DA 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS 含量 將UMR-106 細(xì)胞按8×104個(gè)/mL 接種至共聚焦皿，分別培養(yǎng)24 h，棄液，用DMEM 洗滌3 次；按照1∶1 000加入DCFH-DA 熒光探針，37 ℃避光孵育20 min；激光共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.6激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化 將UMR-106 細(xì)胞按8×104個(gè)/mL 接種至共聚焦皿，培養(yǎng)24 h，棄液，Hank's 平衡鹽溶液（HBSS溶液）洗滌5 min×3次，加入30 μmol/L Fluo-3 AM 工作液1.25 μL，再加入0.05% Pluronic F-127 工作液1.25 μL，輕晃混勻，避光37 ℃孵育30 min；棄液，HBSS 溶液洗滌3 min，加入500 μL HBSS，再加入5 μL Hoechst33342 孵育10 min；棄液，HBSS 溶液洗滌5 min×3 次。根據(jù)組別分別滴加10%生理鹽水血清及10 μmol/L H2O2，激光共聚焦顯微鏡拍攝，設(shè)置拍攝視頻時(shí)長(zhǎng)約40 min，ZEN軟件分析。

1.4.7Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 UMR-106細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板，分組干預(yù)，棄液，PBS洗滌，每孔加入200 μL 不含EDTA 胰酶消化2 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液至15 mL 離心管，2 000 r/min 離心3 min；棄液，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心3 min；每管加入500 μL Binding Buffer，輕柔吹打混勻移入流式管，每管加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PrPidium Lodide 充分混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)LOWJO 軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.8qPCR檢測(cè)細(xì)胞ERS標(biāo)志基因GRP78及PERK通路關(guān)鍵指標(biāo)mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 分別收集4 組細(xì)胞，加入TriZol 1 mL 充分混勻，靜置10 min；加入氯仿200 μL，震蕩30 s 混勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min；取400 μL上清至新EP管中，再加入400 μL異丙醇，充分混勻后冰上靜置15 min，放入離心機(jī)中4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min；棄液，加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min 離心5 min，棄液，加入20 μL DEPC 溶解總RNA；nanodrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280值。HiScript QRT SuperMix 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，AceQ-qPCR SYBR Green Master Mix 配置qPCR反應(yīng)體系，條件如下：95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s共40 個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s 共1 個(gè)循環(huán)得到溶解曲線，GAPDH 作為內(nèi)參，2-ΔΔct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.9Western blot 檢測(cè)細(xì)胞ERS 標(biāo)志蛋白GRP78及PERK 通路關(guān)鍵指標(biāo)蛋白含量 分別收集4 組細(xì)胞，棄液，PBS 洗滌，加入100 μL RIPA 裂解液、1 μL PMSF 和1 μL 磷酸酶抑制劑，冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r/min 離心18 min，取蛋白上清，按照1∶4 比例加入25 μL 5×Loading Buffer，充分混勻，95 ℃變性5 min，-80 ℃保存。采用6～10% SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF 膜上，QuickBlock?快速封閉液室溫孵育5 min，分別采用GRP78（1∶1 000）、PERK（1∶1 000）、eIf2α（1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000），一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌，1∶10 000 二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌，滴加顯影液曝光成像，以β-actin 作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD-t法，方差不齊時(shí)用Games-Howell 法。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSK2606414抑制劑的最佳干預(yù)濃度

與0 μmol/L 的空白對(duì)照組相比，0.01、0.02 和0.03 μmol/L GSK2606414處理后細(xì)胞活力沒(méi)有顯著變化，0.04、0.05 μmol/L GSK2606414 可觀察到細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明GSK2606414干預(yù)UMR-106細(xì)胞12 h后對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響的最大濃度為0.03 μmol/L，故使用該濃度作為后續(xù)H2O2＋GSK2606414組的實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件。

圖1 不同濃度GSK2606414對(duì)UMR-106細(xì)胞活力的比較Figure 1 Comparison different concentrations of GSK260 6414 on the viability of UMR-106 cells

2.2 NC 組和H2O2組GRP78 和Caspase-12 蛋白熒光表達(dá)比較

本實(shí)驗(yàn)沿用課題組前期成熟的體外細(xì)胞氧化應(yīng)激造模條件，采用10 μmol/L H2O2干預(yù)UMR-106細(xì)胞12 h 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［8］。免疫熒光染色觀察ERS標(biāo)志物蛋白GRP78 和ERS 細(xì)胞凋亡指標(biāo)Caspase-12 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與NC 組相比，H2O2處理后GRP78 和Caspase-12 的熒光強(qiáng)度顯著增加，表明H2O2誘導(dǎo)UMR-106 細(xì)胞ROS/ERS 模型的成功建立。見(jiàn)圖2。

圖2 UMR-106細(xì)胞GRP78和Caspase-12蛋白熒光強(qiáng)度比較（×400）Figure 2 Comparison of fluore scence intensity of GRP78 and Caspase-12 of UMR-106 cells (×400)

2.3 NC組和H2O2組鈣離子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化比較

Fluo 3-AM 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示：NC組細(xì)胞內(nèi)鈣離子流隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化，處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；H2O2處理后H2O2組熒光強(qiáng)度和鈣離子流速隨時(shí)間推移而增加，進(jìn)一步表明H2O2誘導(dǎo)UMR-106 細(xì)胞ROS/ERS 模型的成功建立。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞鈣離子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化比較（×400）Figure 3 Comparison of real-time dynamic changes in cellular calcium ions (×400)

2.4 NC組和H2O2組ROS含量比較

線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS 的主要來(lái)源，DCFH-DA探針證實(shí)H2O2處理后UMR-106 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著升高（P＜0.01）；健骨顆粒和GSK2606414 干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。結(jié)果表明健骨顆粒可抑制ROS/ERS 模型細(xì)胞中ROS的生成。

圖4 ROS含量比較（×400）Figure 4 Comparison of ROS content (×400)

2.5 4組細(xì)胞晚期凋亡率比較

與NC 組比較，H2O2組細(xì)胞晚期凋亡率升高（P＜0.01），健骨顆粒和GSK2606414 干預(yù)后細(xì)胞晚期凋亡率均有所下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 4組細(xì)胞晚期凋亡率比較Figure 5 Comparison of advanced cell apoptosis rates in four groups

2.6 4 組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路關(guān)鍵基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

與NC 組相比，H2O2組GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高（P＜0.01）；與H2O2相比，健骨顆粒和GSK2606414干預(yù)后GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖6 4組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路關(guān)鍵基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較Figure 6 Comparison of mRNA expression level of key genes in the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP pathway

2.7 4 組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與NC 組相比，H2O2組GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.01）；與H2O2組相比，健骨顆粒和GSK2606414 干預(yù)后GRP78、PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 4組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 7 Comparison of expression level of key proteins in the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP pathway in four groups

3 討 論

PMOP 發(fā)病率顯著高于老年性骨質(zhì)疏松癥，嚴(yán)重影響中老年女性的生活質(zhì)量?，F(xiàn)階段治療藥物分為四大類：抑制骨吸收藥物（雌激素類、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽類和降鈣素），促進(jìn)骨形成藥物（甲狀旁腺激素等），雙重作用藥物（雷尼酸鍶等）和骨礦化促進(jìn)劑（鈣劑、維生素D）。雖然雌激素水平急劇降低是PMOP 的主要病因，然而雌激素替代治療可引起子宮癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加［9］。雙膦酸鹽類抑制骨吸收量的同時(shí)新生骨量和質(zhì)量相應(yīng)減少，可能引起頜骨壞死等嚴(yán)重不良反應(yīng)［10］。甲狀旁腺激素（特立帕肽）的最長(zhǎng)持續(xù)使用時(shí)間是2 年。中醫(yī)藥因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)受到醫(yī)患的廣泛關(guān)注［11-13］，進(jìn)一步明確其作用機(jī)制勢(shì)在必行。

ROS 包括氧和含氧的高反應(yīng)活性分子，例如H2O2、超氧陰離子（O2-）和羥基自由基（·OH）等，氧化應(yīng)激可損傷成骨細(xì)胞的細(xì)胞成分，是骨質(zhì)流失的致病因素之一［14］。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2制備細(xì)胞模型，其直接攻擊維持蛋白折疊酶活性所必需的游離巰基，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)被氧化修飾，觸發(fā)ERS，ERS是重要的細(xì)胞自我防御機(jī)制，適當(dāng)?shù)腅RS 有助于成骨分化，然而持續(xù)、過(guò)度的ERS 抑制成骨分化并誘導(dǎo)其凋亡，ERS 在PMOP 的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［15-16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10 μmol/L H2O2干預(yù)UMR-106 細(xì)胞12 h，在ROS 水平達(dá)到峰值的同時(shí)GRP78和Caspase-12 表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流速度隨時(shí)間推移顯著加快，并且細(xì)胞凋亡率顯著增加，以上結(jié)果均提示H2O2引起ERS 細(xì)胞凋亡的發(fā)生，即ROS/ERS模型構(gòu)建成功。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞的鈣庫(kù)，Ca2+是重要的第二信使，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程［17］。同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝和鈣離子貯存等功能是細(xì)胞命運(yùn)決定的關(guān)鍵因素。GRP78 是伴侶蛋白，在蛋白質(zhì)的折疊和組裝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)UPR 迅速啟動(dòng)，并作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信號(hào)通路是調(diào)控ERS的3 個(gè)主要通路之一［18］，同時(shí)也是調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成的主要信號(hào)通路之一［19］。

PERK 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，PERK 基因敲除小鼠出現(xiàn)骨骼缺陷包括成骨細(xì)胞數(shù)量不足、成骨細(xì)胞分化礦化受損、Ⅰ型膠原分泌減少、骨質(zhì)疏松和異常致密骨發(fā)育等［20-21］；在生理?xiàng)l件下PERK 處于無(wú)活性狀態(tài)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量最豐富的分子伴侶GRP78 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，UPR 時(shí)PERK 與GRP78 解離，游離GRP78 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白結(jié)合，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力，緩解ERS；然而反應(yīng)是有限的，當(dāng)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)過(guò)度堆積，機(jī)體為保護(hù)其他細(xì)胞的正常功能啟動(dòng)凋亡路徑［4，22］。游離PERK 引起下游eIF2α 磷酸化導(dǎo)致蛋白翻譯水平整體下降或者停止，但誘導(dǎo)ATF4 的優(yōu)先翻譯和合成，ATF4 也是成骨細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子［23-25］，進(jìn)而激活其下游轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 同源蛋白CHOP 的轉(zhuǎn)錄，CHOP 是啟動(dòng)應(yīng)激凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中H2O2處理后PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，表明該信號(hào)通路在UMR-106 細(xì)胞的ERS凋亡中起重要作用。

SU 等［26］發(fā)現(xiàn)葉酸可能通過(guò)抑制ERS 減少成骨細(xì)胞凋亡，MENG 等［27］發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)eIF2α/ATF4通路的激活誘導(dǎo)hFOB 1.19 細(xì)胞凋亡，而POSTN 可能通過(guò)抑制eIF2α/ATF4通路保護(hù)成骨細(xì)胞；LI等［28］發(fā)現(xiàn)OVX小鼠中增強(qiáng)eIF2α磷酸化可引起骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)的增加。GSK2606414 是PERK 的選擇性抑制劑，可通過(guò)抑制PERK 磷酸化和降低PERK含量，阻礙下游ATF4 和CHOP 的激活，廣泛用于驗(yàn)證PERK 信號(hào)通路在各種疾病模型中的作用［29］。本實(shí)驗(yàn)中GSK2606414 干預(yù)后ROS 含量和細(xì)胞凋亡率均顯著降低，PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的下降；上述結(jié)果表明減輕ERS 可能在保護(hù)成骨細(xì)胞對(duì)抗PMOP中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

健骨顆粒是治療PMOP 的驗(yàn)方，主要由淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥和煅狗骨等組成，具有補(bǔ)腎健脾、強(qiáng)筋健骨之功效，臨床效果顯著。課題組前期系列研究發(fā)現(xiàn)：健骨顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的6 個(gè)靶蛋白相對(duì)表達(dá)量，增強(qiáng)去卵巢大鼠成骨細(xì)胞分化能力以發(fā)揮治療作用［30］；通過(guò)p38MAPK 信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞增殖［31］；健骨顆粒氯仿萃取部位調(diào)控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［32-33］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：健骨顆粒干預(yù)可顯著降低ROS 含量和細(xì)胞凋亡率，PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白相對(duì)表達(dá)量不同程度降低；提示健骨顆粒可通過(guò)調(diào)控PERK/eIf2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路減輕過(guò)度的ERS，從而降低UMR-106 細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮成骨細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，調(diào)控PERK/eIf2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路可能是健骨顆粒治療PMOP的潛在作用機(jī)制之一；但本實(shí)驗(yàn)僅限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，存在一定的局限性，后續(xù)還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該作用機(jī)制。