角膜緣干細(xì)胞缺乏動物模型建立方法研究進(jìn)展

郭笑霄 綜述 李新宇 審校

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科,武漢 430030

角膜緣干細(xì)胞缺乏(limbal stem cell deficiency,LSCD)是由于角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cell,LSC)數(shù)量減少和/或功能異常導(dǎo)致的角膜上皮穩(wěn)態(tài)失衡,臨床上表現(xiàn)為角膜上皮細(xì)胞結(jié)膜化、持續(xù)或反復(fù)的角膜上皮缺損,可伴有角膜新生血管、眼表炎癥反應(yīng)或角膜瘢痕的形成,最終可導(dǎo)致角膜盲[1]。根據(jù)病因,LSCD分為獲得性LSCD和遺傳性LSCD兩大類,目前在我國眼表化學(xué)燒傷和熱燒傷是LSCD的首要病因。根據(jù)角膜上皮結(jié)膜化的受累范圍是否為全周累及,LSCD可分為部分性和完全性兩大類。根據(jù)臨床檢查發(fā)現(xiàn)的角膜和角膜緣受累程度,LSCD國際共識進(jìn)行了臨床分期,其中病變未累及視軸或角膜中央直徑5 mm區(qū)域為LSCD Ⅰ期,累及角膜中央直徑5 mm區(qū)域為LSCD Ⅱ期,累及全角膜為LSCD Ⅲ期。LSCD的分類及分期對于選擇治療方式和設(shè)計手術(shù)方案至關(guān)重要[1]。目前,LSCD的治療主要是通過手術(shù)行角膜緣干細(xì)胞移植(limbal stem cell transplantation,LSCT),由于LSCT需要切取健康的角膜緣組織進(jìn)行移植,該治療方式本身會對供給處角膜緣造成創(chuàng)傷;此外,對于單次LSCT未能治愈的LSCD,需多次重復(fù)手術(shù),而健康的角膜緣組織來源比較受限。因此,利用培養(yǎng)的LSC進(jìn)行移植也被推薦用于LSCD的治療[2-4],但遠(yuǎn)期效果并不明確,依然面臨著諸多挑戰(zhàn)[5]。因此,需要進(jìn)行更為全面的基礎(chǔ)研究,對LSCD的發(fā)生機(jī)制及發(fā)展演變過程進(jìn)行更為深入的探索。而建立理想的動物疾病模型是對LSCD進(jìn)行細(xì)胞水平和分子水平研究以及評價新的治療措施必不可少的方法和手段。近年來,國內(nèi)外許多研究對LSCD的造模方法進(jìn)行了報道,涉及了不同動物種類、不同干預(yù)方式。本文綜述了近年來LSCD研究常用的動物模型,總結(jié)分析動物模型的建立方法、優(yōu)缺點(diǎn)以及用于研究LSCD的動物和類型選擇,以期為后續(xù)研究人員構(gòu)建合適模型提供參考。

1 LSCD動物模型的建立方法

1.1 機(jī)械法造模

1.1.1手術(shù)刀等工具刮削造模 1971年,Davanger等[6]首次提出LSC位于角膜緣組織Vogt柵欄內(nèi),早期研究LSCD的方法主要通過機(jī)械方法去除角膜緣組織。手術(shù)切除角膜緣上皮,鈍刀片、鈍鏟或新月形刀去除角膜緣組織都曾被用于制作LSCD模型[7-10]。

Gipson等[8]最早開始利用鈍刀片刮除角膜上皮及角膜緣組織,用于研究角膜上皮的遷移愈合情況。劉先寧等[11]用機(jī)械法進(jìn)行新西蘭白兔LSCD造模,研究者提出了2種造模方法:(1)單純?nèi)コ悄ぞ墐?nèi)外寬約2 mm、深100～150 μm的角膜緣淺板層組織;(2)在上述方法的基礎(chǔ)上去除中央角膜深100～150 μm的淺板層組織。該研究顯示,單純?nèi)コ悄ぞ墱\板層組織的動物模型成功率為40%,造模成功需耗時(29.5±1.3)d;而角膜緣聯(lián)合角膜中央淺板層組織共同去除的造模成功率為100%,造模成功需耗時(15.8±0.8)d;因此,2種方法都證實了機(jī)械法進(jìn)行兔LSCD造模的可行性,此外角膜緣聯(lián)合中央角膜淺板層組織去除既可提高造模成功率,又可縮短造模時間。隨后,柯紅琴等[12]也采用角膜緣聯(lián)合中央角膜淺板層組織的方法對日本大耳白兔進(jìn)行造模,該團(tuán)隊切除了厚100～150 μm的角膜緣內(nèi)1 mm、外2 mm的角膜緣淺板層以及厚約100 μm的中央角膜淺板層組織,在手術(shù)2周時造模成功率為12.5%,但在5周時可提高到87.5%。

以上2個研究團(tuán)隊使用了相同的方法造模,但是造模成功率和成模時間有明顯差異。分析產(chǎn)生差異的可能原因為:(1)不同的研究團(tuán)隊、不同的操作者在造模過程中操作細(xì)節(jié)有差異;(2)2個團(tuán)隊使用的動物品種不同,而不同物種的角膜厚度可能存在一定差異。據(jù)報道,日本大耳白兔的中央角膜厚度為(382.0±25.1)μm[13],而新西蘭白兔中央角膜厚度為(356.8±25.6)μm[14]。故在切除相同厚度的淺板層角膜緣組織的情況下,新西蘭白兔損失的角膜組織更多,可能對模型的成功有一定影響。

為了對角膜緣及中央角膜進(jìn)行規(guī)則地切削并保證切削后角膜表面的平整性,藺琪等[15]先借助9 mm環(huán)鉆標(biāo)記并去除新西蘭白兔中央角膜上皮,然后再向周邊薄板層剖切至角膜緣外1 mm,深度達(dá)淺基質(zhì)層,為0.1～0.2 mm,并環(huán)形剪除,該研究造模成功率為84.2%,較劉先寧等[11]研究的造模成功率稍低,這可能與中央角膜切削深度不同有關(guān)。

此造模法應(yīng)用的時間較久,建模方法成熟,可靠性高;對基質(zhì)的損傷小,角膜基質(zhì)微環(huán)境保存良好。該系列方法缺點(diǎn)包括:(1)鈍刮刀等機(jī)械去除角膜上皮的方法易導(dǎo)致?lián)p傷不均勻,尤其近角膜緣處。該方法的改良可以參考藺琪等[15]提出的環(huán)鉆劃界加板層切除法,以期得到更平整的角膜。(2)手術(shù)中不可避免地殘留有LSC和角膜上皮細(xì)胞,殘留細(xì)胞借助于基底層重建了完整的角膜上皮層,致使一部分動物模型制作失敗[9,16]。(3)對術(shù)者的技巧要求高,增加了可重復(fù)性難度。在進(jìn)行角膜緣切除術(shù)時,可能導(dǎo)致基質(zhì)損傷、前房穿孔,造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷。

1.1.2旋轉(zhuǎn)毛刺工具造模 使用旋轉(zhuǎn)毛刺工具(AlgerBrush Ⅱ)是目前制作角膜損傷的首選方法[17-19]。Li等[20]將AlgerBrush Ⅱ旋轉(zhuǎn)毛刺作為誘導(dǎo)新西蘭白兔LSCD的造模工具,同時與手術(shù)和化學(xué)法進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)毛刺工具造模更安全、更有效。其具體方法:每次清創(chuàng)前在距角膜緣約1.5 mm處進(jìn)行全周結(jié)膜切開,使用1 mm尖頭鉆的AlgerBrush Ⅱ進(jìn)行360°角膜緣切除,然后使用2.5 mm圓頭鉆去除剩余的角膜上皮,或直接用2.5 mm圓形鉆頭360°去除淺層角膜緣及整個角膜上皮;最后用生理鹽水沖洗眼表,使用潤濕的棉簽去除眼表的碎屑。但是,Afsharkhamseh等[21]利用毛刺旋轉(zhuǎn)工具制作小鼠LSCD模型時,發(fā)現(xiàn)必須經(jīng)過多次重復(fù)清創(chuàng),才能徹底地去除角膜緣細(xì)胞。

此造模法的優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單、一致性較好、穩(wěn)定時間較長[16]。相比機(jī)械刮削工具損傷更均勻,同時可以去除基底膜;相比化學(xué)造模法,對角膜基質(zhì)層或其他眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的損傷小,術(shù)后出現(xiàn)炎癥和瘢痕的可能性小,更有利于結(jié)果的判讀及評估[22]。其缺點(diǎn)是有細(xì)胞殘留可能,需反復(fù)多次清創(chuàng);同時,毛刺的速度、放置的角度、施加在角膜上的壓力以及停留的時間等因素對于實驗結(jié)果影響較大,這也可能是不同研究結(jié)果之間存在差異性的潛在原因之一[23]。

1.2 灼燒法造模

通過灼燒破壞角膜緣組織是建立熱損傷誘導(dǎo)LSCD的一種方法。Majo等[24]為了模擬小鼠的LSCD,對野生型小鼠的角膜緣組織進(jìn)行灼燒,由于灼燒的不可控性,導(dǎo)致角膜緣上皮及基質(zhì)層完全受損,甚至傷及睫狀體。隨后,Afsharkhamseh等[16]將灼燒法進(jìn)一步改進(jìn)并與AlgerBrush Ⅱ工具相結(jié)合,建立C57BL/6J小鼠LSCD模型。該研究利用AlgerBrush Ⅱ去除角膜緣和中央角膜上皮后,使用一種可調(diào)節(jié)的電燒灼器對角膜緣進(jìn)行受控?zé)釗p傷,并通過研究得出致角膜損傷但又不穿孔的最佳溫度為(50±1)℃。其具體操作方法是把一根彎曲的長約1.5 cm的實心銅線一端綁在灼燒器上,形成一個細(xì)且鈍的尖端,使其加熱150 ml的水,通過測量水溫來間接測量尖端的溫度,然后作用于角膜緣2～3 s來誘發(fā)角膜緣損傷。

此造模方法較為復(fù)雜,操作難度較大;并且由于灼燒導(dǎo)致的熱損傷可加重角膜混濁的程度,模型的損傷也更嚴(yán)重,故此模型更適合用于模擬基質(zhì)損傷及愈合反應(yīng)等研究。

1.3 化學(xué)法造模

1.3.1堿燒傷法造模 化學(xué)性燒傷角膜組織是制作LSCD實驗?zāi)Ｐ偷某Ｓ梅椒ㄖ?尤其是使用堿性試劑[25-26]。其主要原理是破壞角膜緣和角膜上皮及其基底層,使殘留的LSC不能再次建立完整的角膜上皮層。

NaOH是化學(xué)造模法中常用的一種試劑,目前常用于眼表灼傷的NaOH濃度主要為1 mol/L和0.5 mol/L,處理時間為20、30、45和60 s,濃度和時間根據(jù)模型動物角膜厚度會有一定區(qū)別[27]。盧建民等[28]利用圓形濾紙片對新西蘭白兔進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞缺損模型的制備。具體方法:全身麻醉后,將直徑8 mm圓形濾紙片用1 mol/L NaOH浸濕,瀝干后覆蓋于角膜中央1 min,生理鹽水沖洗角膜表面和結(jié)膜囊3 min,再用無菌干棉球吸干,虹膜復(fù)位器刮拭角膜表面,去除全部角膜上皮層。出現(xiàn)角膜深實質(zhì)層水腫、混濁呈瓷白色,虹膜紋理窺不清及角膜緣缺血視為造模成功。郭濱等[29]將18只新西蘭白兔隨機(jī)分為3個組,分別用外徑為16 mm、內(nèi)徑為8 mm的1 mol/L NaOH溶液浸泡的環(huán)形濾紙在角膜緣貼附60 s并結(jié)膜囊內(nèi)滴入30 s、角膜緣貼附30 s并結(jié)膜囊內(nèi)滴入30 s、僅角膜緣貼附30 s,結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)膜囊滴入NaOH溶液的組均不同程度地出現(xiàn)了角膜穿孔、眼球萎縮、瞼球粘連等并發(fā)癥;而僅進(jìn)行角膜緣堿燒傷的兔在第4周行激光掃描共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)角膜緣柵欄結(jié)構(gòu)消失、角膜結(jié)膜化,角膜上皮中出現(xiàn)杯狀細(xì)胞。研究證明了環(huán)形濾紙浸潤NaOH溶液燒傷角膜緣組織,可以成功構(gòu)建LSCD動物模型,同時也表明聯(lián)合結(jié)膜囊滴入NaOH溶液可導(dǎo)致廣泛的組織損傷及壞死。不同物種之間對堿燒傷造模引起的LSCD特征中存在一定差異。Kethiri等[30]通過單眼滴入1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行堿燒傷30 s,然后用生理鹽水沖洗,并將C57BL/6小鼠和新西蘭白兔的LSCD堿燒傷模型與化學(xué)燒傷誘導(dǎo)的人LSCD角膜進(jìn)行比較,結(jié)果顯示小鼠和兔角膜新生血管發(fā)生率分別為50%和67%,而人角膜全部出現(xiàn)新生血管;小鼠和兔角膜均有67%可能出現(xiàn)基質(zhì)炎癥反應(yīng),而人角膜則全部出現(xiàn)炎癥表現(xiàn);三者分別有50%、50%和83%的角膜中存在杯狀細(xì)胞。研究數(shù)據(jù)表明,小鼠、兔和人在堿燒傷造模引起的角膜血管化程度、炎癥和杯狀細(xì)胞形成等結(jié)果中存在顯著差異。因此,在利用動物模型獲取LSCD結(jié)果類推到人眼時,要注意這些差異的影響。

Zhang等[27]利用NaOH燒傷法造模,同時與機(jī)械法切除角膜緣及角膜上皮制作的完全性兔LSCD模型進(jìn)行了比較,結(jié)果表明堿燒傷組的角膜混濁、新生血管化程度較機(jī)械切除組嚴(yán)重,適合用于與新生血管相關(guān)的研究;而角膜緣機(jī)械切除聯(lián)合上皮刮除對角膜基質(zhì)的損傷較小,角膜基質(zhì)的微環(huán)境保存良好,更適合于研究干細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞相互作用、微環(huán)境及干細(xì)胞替代療法。

KOH溶液與NaOH同為強(qiáng)堿性物質(zhì),也是常被用于造模的化學(xué)試劑品之一。Li等[3]采用1 mol/L KOH溶液浸泡后的直徑4 mm的圓形濾紙灼燒顳上方角膜30 s,隨后立即用100 ml生理鹽水沖洗,建立兔部分性LSCD模型;高晴琴等[31]也用了同樣的方法建立新西蘭白兔部分性LSCD模型,除麻醉意外死亡的實驗兔外,所有實驗動物均造模成功,且在觀察的2個月時間內(nèi),未出現(xiàn)角膜穿孔情況。該研究團(tuán)隊還將此方法用于建立C57小鼠的LSCD模型,將直徑為3 mm的圓形濾紙片用1 mol/L KOH溶液浸潤后,作用于中央角膜表面30 s,用20 ml生理鹽水充分沖洗,麻醉后順利蘇醒的24只小鼠,僅2只分別在第7天和第14天出現(xiàn)了角膜穿孔,其余22只發(fā)生不同程度完全性LSCD,誘導(dǎo)成功率為92%[31]。

堿燒傷法造模的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,易實施,病因與臨床病例的吻合度較高;但此方法的一個重要缺點(diǎn)是結(jié)果的不可預(yù)測性,因為難以控制化學(xué)損傷的深度及程度,存在對深層基質(zhì)或周圍組織造成溶解、穿孔或損傷的風(fēng)險,難以保證模型的統(tǒng)一以及避免堿燒傷的后續(xù)影響。

1.3.2苯扎氯銨造模 化學(xué)灼傷和機(jī)械去除角膜緣組織誘導(dǎo)動物獲得的LSCD模型,均屬于急性角膜破壞,對局部組織損傷過重,伴隨較重的炎癥反應(yīng)。然而,對于需要研究眼表慢性及長期損傷形成LSCD的模型并不合適,可考慮采用目前研究較多的苯扎氯銨溶液造模。

苯扎氯銨是滴眼液中常用的防腐劑,由于存在細(xì)胞毒性,長期使用含防腐劑的外用藥物是多種眼表疾病的潛在風(fēng)險,往往導(dǎo)致角膜上皮、內(nèi)皮、結(jié)膜以及支配神經(jīng)出現(xiàn)不同程度的損傷[32]。Pauly等[33]系統(tǒng)地研究了長期給予不同劑量的苯扎氯銨溶液對大鼠眼表的毒性作用,觀察到了角膜上皮侵蝕、炎癥反應(yīng)以及新生血管的形成。Lin等[34]將苯扎氯銨配置成不同濃度的滴眼液點(diǎn)眼,分別為0.1%、0.25%、0.5%,每天4次,持續(xù)28 d,結(jié)果顯示使用0.5%的苯扎氯銨溶液成功誘導(dǎo)BALB/c小鼠出現(xiàn)了LSCD的典型表現(xiàn),包括角膜新生血管、基質(zhì)炎癥反應(yīng)和彌漫的上皮缺損等,證實了長期給予防腐劑苯扎氯銨可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠LSCD。

此造模法雖然操作簡單,但造模周期較長,時間和經(jīng)濟(jì)成本較高,比較適合于需要探索LSCD慢性發(fā)展及機(jī)制演變過程的研究。此外,該造模方法所造成的病變部位難以完全集中在角膜緣及角膜,可能造成整個眼表結(jié)構(gòu)的損傷。

1.3.3硫芥子氣造模 硫芥子氣是一種能對人體皮膚、呼吸道及眼等器官產(chǎn)生損害的烷化劑,可以液滴態(tài)、霧態(tài)、蒸氣態(tài)長期儲存,損傷眼部時可導(dǎo)致角膜上皮反復(fù)糜爛、延遲不愈,故也被用于LSCD的研究[35-36]。Kadar等[36]將新西蘭白兔眼暴露于10 μl純度超過95%的硫芥子氣蒸氣中4 min,在暴露后的4 h～4周的不同時間點(diǎn)對眼進(jìn)行組織學(xué)和分子生物學(xué)評估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與角膜中央上皮的損傷不同,LSC在硫芥子氣暴露后的急性期并未受到損傷,而是在暴露2周后,干細(xì)胞逐漸丟失,表現(xiàn)出LSCD的典型癥狀,這表明與硫芥子氣眼部毒性相關(guān)的LSCD并非源自直接的細(xì)胞毒性,而是由于角膜緣基質(zhì)的病變致使微環(huán)境異常,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此造模方法目前實際應(yīng)用較少,主要用于再現(xiàn)士兵在戰(zhàn)爭中眼部損傷情況的相關(guān)研究。

1.4 化學(xué)+手術(shù)切除法造模

手術(shù)切除角膜緣可以與正庚醇、甲醇等有機(jī)溶劑相結(jié)合,首先利用有機(jī)溶劑去除角膜上皮,再通過手術(shù)去除角膜緣[37]。Chen等[7]使用正庚醇聯(lián)合機(jī)械方法進(jìn)行全角膜上皮清除,發(fā)現(xiàn)不同持續(xù)時間的正庚醇處理方法可導(dǎo)致不同程度的角膜結(jié)膜化及血管化。Avila等[38]用此方法建立了新西蘭白兔的LSCD模型,具體操作是先用正庚醇去除角膜上皮,然后全周板層切除角膜緣上皮;為確保完全破壞角膜和角膜緣上皮,3周后重復(fù)上述步驟。術(shù)后1個月所有眼均出現(xiàn)中至重度角膜新生血管,伴表面不規(guī)則及角膜混濁,造模成功率為100%。隨后,Sitalakshmi等[39]用同樣的方法建立兔完全性LSCD模型,術(shù)后2～3周,角膜表面逐漸不規(guī)則、基質(zhì)混濁,角膜結(jié)膜化導(dǎo)致上皮屏障不良,熒光素染色呈陽性;印跡細(xì)胞檢查示結(jié)膜杯狀細(xì)胞存在于角膜表面。

此造模法的優(yōu)點(diǎn)是使用正庚醇去除角膜上皮是一種簡單、易行、有效的方法,正庚醇處理后的角膜無上皮細(xì)胞殘留,基質(zhì)面光滑,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整規(guī)則,適于干細(xì)胞貼附、移植等相關(guān)研究;缺點(diǎn)是角膜緣環(huán)形切除的厚度可能與正庚醇去除上皮的厚度不一致,導(dǎo)致中央出現(xiàn)一個較高的角膜淺基質(zhì)島,使新生血管難以長入角膜中央,多沿周邊環(huán)形生長,故可能對模型的評分和確立產(chǎn)生一定影響[15]。

1.5 基因敲減法造模

除了上述方法造模外,還可以將攜帶Pax6敲低基因的小鼠模型用于研究角膜上皮傷口愈合及其對無虹膜相關(guān)LSCD的潛在影響[40];也有研究者研究斑馬魚模型中與角膜營養(yǎng)不良有關(guān)的其他基因[41]。由于LSCD的遺傳病因較少,由突變引起的LSCD表型可能不那么嚴(yán)重;并且轉(zhuǎn)基因動物難以生產(chǎn)和飼養(yǎng),故遺傳模型的使用率較低。

LSCD動物模型不同造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)、適用范圍、具體方法、動物種類等信息詳見表1。

表1 LSCD動物模型

2 LSCD模型的動物選擇

關(guān)于LSCD模型動物的選擇要求包括:(1)所選的動物應(yīng)盡量與人體的生理學(xué)、解剖學(xué)、基因?qū)W等特點(diǎn)相近;(2)要考慮實驗動物的倫理、來源、經(jīng)濟(jì)成本、飼養(yǎng)難度以及造模操作難度等問題;(3)動物的建模周期、重復(fù)性、成功率、死亡率等因素應(yīng)控制在最佳水平;(4)在建立動物模型后,能夠比較全面地模擬人類疾病發(fā)生和發(fā)展過程以及病理生理變化是要考慮的重要因素。

目前,研究LSCD的動物模型主要限于少數(shù)哺乳動物,如小鼠、大鼠、兔和山羊等。其中,兔是常選動物之一,并且也常用于研究其他眼表疾病,如淚膜、結(jié)膜、角膜疾病等[12,16,21,31,39]。分析其原因:(1)兔的角膜大小與人類相似,因此有利于成功造模和手術(shù)操作。(2)兔性情溫順,極少傷人,在制作LSCD模型時更易操作和觀察,拍攝照片時也更加清晰。因此,兔是建立角膜疾病動物模型的首選動物[16]。但是,Ti等[42]在建立完全性LSCD兔模型時,發(fā)現(xiàn)鼻側(cè)的新生血管多于其他方向,考慮與兔眼存在瞬膜有關(guān);因此在用兔眼造模時,建議去除瞬膜,避免影響操作及觀察記錄。

其次,小鼠也是制作LSCD模型的常選動物之一[17,22,25,34]。小鼠經(jīng)濟(jì)且容易獲得,既能模擬人類的表型,又能持續(xù)足夠長的時間,適合用于研究疾病的病理生理學(xué)以及新療法的評估;同時,小鼠可供選擇的抗體較兔齊全,有利于在同類研究中的比較。缺點(diǎn)是小鼠眼球較小,進(jìn)行操作、測量新生血管面積及照相的難度較大;尤其在使用化學(xué)試劑誘導(dǎo)LSCD造模時,堿液可能會累及小鼠結(jié)膜,導(dǎo)致瞼球粘連等病變,故利用化學(xué)法造模時不適合選取小鼠作為動物模型。另外,值得注意的是,小鼠角膜緣缺乏柵欄狀結(jié)構(gòu),并且角膜緣起始處前彈力層的位置與人類不同,因此在類推到人類時要注意這些差異的影響[43-44]。

另外,山羊也被用于建立LSCD模型,但山羊造模價格昂貴,體型較大,活動度大,麻醉時可能導(dǎo)致效果不理想,必須在全身麻醉聯(lián)合球周麻醉下進(jìn)行,給實驗操作帶來一定難度,因此使用山羊做此類研究較少[45-46]。

除了哺乳動物模型外,水生動物斑馬魚和兩棲動物非洲爪蟾也用于LSCD的相關(guān)研究。其中,非洲爪蟾的角膜形態(tài)和發(fā)育在很大程度上與人類相似[47-48],這使其成為研究角膜上皮、干細(xì)胞等角膜疾病病理學(xué)的合適模型,主要用于發(fā)育機(jī)制、再生、細(xì)胞重編程及細(xì)胞克隆等方面的研究[49-50]。

3 LSCD模型的類型選擇

根據(jù)LSCD角膜上皮結(jié)膜化的受累范圍,可將LSCD分為部分性及完全性兩大類。部分性LSCD的特征是角膜上皮部分結(jié)膜化,留有部分功能正常的角膜緣以產(chǎn)生正常的角膜上皮細(xì)胞;完全性LSCD是指角膜緣360°干細(xì)胞丟失,角膜表面完全被結(jié)膜上皮覆蓋。

根據(jù)目前的研究報道,完全性LSCD模型的研究要多于部分性[17,51-54]。但是制作完全性LSCD模型在控制病變部位、觀察實驗結(jié)果以及檢驗治療效果時,因其較重的眼表損傷,往往具有一定的局限性,尤其在利用角膜化學(xué)傷誘導(dǎo)LSCD時,往往角膜損傷范圍較大合并嚴(yán)重的角膜基質(zhì)混濁,甚至出現(xiàn)角膜潰瘍、穿孔等導(dǎo)致造模失敗。例如,郭濱等[29]應(yīng)用不同堿燒傷方法制作兔完全性LSCD模型時,由于NaOH在角膜緣停留時間過長,6眼全部出現(xiàn)角膜穿孔、眼球萎縮而造模失敗;Ma等[55]在研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重建大鼠化學(xué)燒傷眼表模型時發(fā)現(xiàn),36%的大鼠因出現(xiàn)了嚴(yán)重的前房積膿、前房積血或角膜穿孔而造模失敗。

而建立的部分性LSCD模型,角膜容易暴露便于觀察,眼前節(jié)照相時動物配合情況相對較好,操作時易精確控制部位和時間,成功率高。其中,化學(xué)法是制作部分性LSCD模型的常用方法之一。例如,高晴琴等[31]在制作兔部分性LSCD模型時,采用堿燒傷造模方法,作用于顳上方角膜。造模后2個月時,2只新西蘭白兔角膜新生血管累及2個象限,其余10只均累及1個象限,平均累及(1.17±0.39)個象限。同時,動物模型的損傷比較局限,相比于完全性LSCD,能更早地進(jìn)入無充血、角膜上皮化的炎癥穩(wěn)定階段,便于獲取眼表改善、視覺改善等陽性指標(biāo),有利于客觀定量評價治療效果。在研究LSCD微環(huán)境重建,如角膜緣微環(huán)境細(xì)胞的移植時,更適合采用仍存有部分自體LSC的部分性LSCD模型[31]。

4 結(jié)語

LSC位于角膜緣上皮基底層的特殊結(jié)構(gòu)“Vogt柵欄”處,屬于成體單能干細(xì)胞,是正常角膜上皮細(xì)胞增生和分化的來源[56-57]。臨床上,角膜直接損傷或角膜干細(xì)胞微環(huán)境破壞均有可能導(dǎo)致LSCD的發(fā)生。建立理想的LSCD動物模型是研究LSC的生理、病理以及觀察體外構(gòu)建的角膜組織移植效果的基礎(chǔ)。

文中系統(tǒng)闡述給予不同的方法(機(jī)械法、灼燒法、化學(xué)法、化學(xué)+手術(shù)法、基因敲減等)建立的LSCD動物模型,以及LSCD動物種類的選擇及制作類型的選擇。機(jī)械法應(yīng)用時間較久,建模方法成熟,可靠性高,但具有侵入性,可能會導(dǎo)致基質(zhì)損傷、前房穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥,對操作者個人技巧要求較高。其中,使用旋轉(zhuǎn)毛刺工具造模是目前推薦制作角膜損傷的首選方法,損傷均勻創(chuàng)傷小,結(jié)果可控性強(qiáng),但對于工具的使用需要一定的經(jīng)驗。灼燒法造模表型穩(wěn)定,但操作復(fù)雜,熱損傷的可控性差?；瘜W(xué)方法破壞角膜組織是一種快速、操作簡單的方法,且病因與臨床病例的吻合度較高,但損傷的深度及范圍控制困難,難以保證模型的統(tǒng)一,需在操作精確度方面進(jìn)一步改進(jìn)?；瘜W(xué)+手術(shù)法在上述造模手段的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn),研究結(jié)果也證明其可行,此方法造模基質(zhì)表面光滑,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,但易形成角膜中央基質(zhì)島,影響新生血管生長?；蚯脺p法由于操作較為復(fù)雜,造模動物難以產(chǎn)生和飼養(yǎng)而相對應(yīng)用較少。

綜上所述,LSCD動物模型用于相關(guān)研究多年,提升了臨床及科研人員對LSCD的理解、研究和治療。但是,目前造模方法眾多,許多研究在進(jìn)行LSCD診斷時對角膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用不足,導(dǎo)致各研究造模質(zhì)量參差不齊。因此,仍需要進(jìn)一步深入探索,建立更理想、更完善的動物模型為LSCD的基礎(chǔ)及臨床研究提供更有價值的幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突