降鈣素介導CD36、IL-17的表達對創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的影響

曾錦威 黃浩 何元平

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)生于韌帶損傷、半月板損傷或骨折后的骨關(guān)節(jié)炎[1]。關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、運動性損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨損傷[2]。至今，人們對軟骨損傷后的自然演變過程和創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制的了解還不夠深入。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎的進展與損傷軟骨細胞外基質(zhì)的酶降解引發(fā)的炎癥有關(guān)[3]。隨著軟骨下骨在關(guān)節(jié)疾病中的作用越來越受到專家學者的關(guān)注，針對軟骨下骨細胞外基質(zhì)降解的藥物越來越多地被應(yīng)用于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)病的治療。降鈣素是一種有效的破骨細胞骨吸收抑制劑，已廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療[4]。柏明曉[5]研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素能促進軟骨分泌糖氨多糖和Ⅱ型膠原（typeⅡ collagen，Col Ⅱ），或抑制這2 種物質(zhì)的分解，并與基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）等蛋白的表達水平的增加關(guān)系密切。在本研究中，以人軟骨細胞為研究對象，通過白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導建立軟骨細胞損傷模型，探討降鈣素對軟骨細胞損傷的保護作用，并進一步研究其可能的分子機制。此文的研究結(jié)果為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎后期標準制定提供了借鑒內(nèi)容，以期為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的深入研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2022年7月21日—11月10日于廣東醫(yī)瑞貝生物醫(yī)學科技有限公司進行實驗。試驗材料及來源：人軟骨細胞（Cell Applications 公司，美國），胎牛血清、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，中國），青霉素-鏈霉素、PBS 緩沖液（Hyclone 公司，美國），IL-1β（北京索萊寶科技有限公司，中國），降鈣素[華中海威（北京）基因科技有限公司，中國]，F(xiàn)ITC anti-human CD36 抗體（BioLegend公司， 美國），CCK-8 試劑盒（cell counting kit CCK 8，CCK-8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物科技有限公司，中國），SYBR Green qPCR SuperMix 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor heat protein domain associated protein 3，NLRP3）一抗（CST 公司，美國），消皮素D（gasdermin-D，GSDMD）一抗、GSDMD-N 一抗（Abcam 公司，美國），蛋白酶抑制劑（Sigma 公司，美國），磷酸酶抑制劑、BCA 法蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國），熒光二抗（Southern biotech，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將人軟骨細胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，選取第3 代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 篩選降鈣素最佳濃度

將對數(shù)生長期的人軟骨細胞以1×105個/cm2的密度接種于不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中饑餓處理24 h，再將人軟骨細胞與濃度為10 ng/mL IL-1β 共同孵育30 min 建立創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎細胞模型。用0.1、0.5、1、5、10、50 nM 5 個濃度的降鈣素處理細胞24 h。通過CCK-8 檢測與乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性測定篩選出降鈣素最佳作用濃度進行后續(xù)實驗，其他不使用降鈣素進行治療的細胞加入等量生理鹽水作為對照。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖活性

將細胞以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，室溫下培養(yǎng)過夜。3 組細胞分別經(jīng)過處理培養(yǎng)0、24、48 和72 h 時，將細胞懸浮于90 μL培養(yǎng)基中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，處理繼續(xù)培養(yǎng)4 h，通過酶聯(lián)免疫檢測儀記錄450 nM 光密度下的讀數(shù)評估細胞增殖能力。

1.2.4 細胞處理

按照處理方式的不同將細胞分為3 組，其中，對照組：人軟骨細胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。疾病組：人軟骨細胞用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與10 ng/mL 濃度的IL-1β 共同孵育30 min。治療組：人軟骨細胞用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與10 ng/mL 濃度的IL-1β 共同孵育30 min，然后用篩選出的最佳作用濃度的降鈣素處理24 h。

1.2.5 流式細胞術(shù)分析各組CD36 和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）表達

將各組細胞用胰蛋白酶消化并重懸細胞，經(jīng)PBS 充分洗滌細胞2 次后，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，每管加入100 μL 細胞，再向管中加入5 μL 抗體，室溫，避光，反應(yīng)30 min，用PBS 洗滌2 次，通過流式細胞儀觀察熒光強度，分析CD36 和ROS 的表達情況。

1.2.6 酶標法檢測各組細胞SOD 和MDA 水平

離心后收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞，收集上清液。根據(jù)制造商的說明分別采用硫代巴比妥酸法和羥胺法檢測各組細胞MDA 和SOD 的含量。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測mRNA 的相對表達量

使用總RNA 提取試劑盒，按說明書要求提取總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，通過SYBR Green 實時PCR 對樣品進行擴增。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算降鈣素、白介素-17（interleukin17，IL-17）、MMP13、Col Ⅱ的相對表達量。

1.2.8 蛋白印跡法（Western blot）檢測蛋白的相對表達量

收集各組細胞，提取細胞內(nèi)總蛋白并用蛋白定量試劑盒測定濃度。蛋白通過PAGE 聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDSPAGE）電泳分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加1 ∶1 000 稀釋的NLRP3、GSDMD、GSDMD-N 和GAPDH 一抗。4 ℃過夜后，用含有辣根的過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育2 h，將化學熒光發(fā)光底物加到膜的表面，對蛋白條帶進行灰度掃描、定量，蛋白表達水平根據(jù)GAPDH 進行標化。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗，3 組比較使用F檢驗；基因間相關(guān)性研究采用Pearson 分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法篩選降鈣素最佳作用濃度結(jié)果

采用0.1、0.5、1、5、10、50 nM 5 個濃度的降鈣素分別處理人軟骨細胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著降鈣素濃度的增加，人軟骨細胞的活力逐漸升高，這種變化具有濃度依賴性，因此選擇50 nM 濃度的降鈣素作為治療組進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 不同濃度降鈣素對人軟骨細胞增殖活性和細胞毒性的影響。

2.2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞軟骨退化相關(guān)因子的影響

與對照組比較，疾病組人軟骨細胞肥大標志物MMP13的mRNA 相對表達量升高，而軟骨形成標志物Col Ⅱ的mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）。但在降鈣素治療后人軟骨細胞軟骨退化得到了緩解，與疾病組比較，治療組人軟骨細胞MMP13 的mRNA 表達降低，同時Col Ⅱ的mRNA表達升高（P＜0.05）。見表1。

表1 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中MMP13、Col Ⅱ含量的影響（±s）

表1 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中MMP13、Col Ⅱ含量的影響（±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.05；疾病組MMP13 的mRNA 相對表達量、Col Ⅱ的mRNA 相對表達量與對照組比較，t ＝10.312、8.380，P ＝0.002、0.001。與疾病組比較，②P ＜0.05；治療組MMP13 的mRNA 相對表達量、Col Ⅱ的mRNA 相對表達量與疾病組比較，t ＝18.730、7.878，P ＜0.001、P ＝0.001。

組別MMP13 mRNA（相對表達量）Col Ⅱ mRNA（相對表達量）對照組（n ＝8）1.00±0.091.00±0.09疾病組（n ＝8）2.23±0.19①0.47±0.06①治療組（n ＝8）0.19±0.03②1.83±0.16②F 值216.800113.700 P 值＜0.001＜0.001

2.3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞氧化應(yīng)激水平的影響

與對照組比較，IL-1β 處理使人軟骨細胞中的ROS 的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）及MDA含量增加，同時伴隨SOD 活力的下降（P＜0.05）。然而，與疾病組比較，降鈣素處理細胞后，ROS 的MFI 及MDA含量下降，且SOD 活力增強（P＜0.05）。見表2。

表2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ROS、MDA、SOD 含量的影響（±s）

表2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ROS、MDA、SOD 含量的影響（±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.05；疾病組ROS（MFI）、MDA、SOD 與對照組比較，t ＝46.970、8.049、6.460，P ＜0.001、P ＝0.001、P ＝0.003。與疾病組比較，②P ＜0.05；治療組ROS（MFI）、MDA、SOD 與疾病組比較，t ＝33.623、6.369、4.670，P＜0.001、P ＝0.003、P ＝0.010。

組別ROS（MFI）MDA（nmol/mL）SOD（U/mL）對照組（n ＝8）1 192.21±15.105.85±0.56242.33±21.17疾病組（n ＝8）2 026.45±26.80①13.93±1.64①151.14±12.26①治療組（n ＝8）1 404.34±17.58②7.14±0.83②214.23±19.93②F 值1 348.00045.62019.710 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應(yīng)標志物的影響

與對照組比較，疾病組人軟骨細胞中炎癥反應(yīng)標志物NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達水平上升，而GSDMD-N 蛋白表達水平下降（P＜0.05）。然而，降鈣素治療后，人軟骨細胞中NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達受到抑制，而GSDMD-N 的蛋白表達則上升（P＜0.05）。見圖2。

圖2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應(yīng)標志物的影響。A：Western blot檢測降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應(yīng)標志物蛋白的影響；B：降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應(yīng)標志物蛋白影響的量化；與對照組比較，①P ＜0.05；與疾病組比較，②P ＜0.05。

2.5 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響

與對照組比較，疾病組的CD36 陽性率降低；同時，IL-17 的mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）。但是，降鈣素治療后可緩解這些改變，與疾病組比較，治療組細胞中CD36 陽性率升高，而IL-17 的mRNA 相對表達量受到抑制（P＜0.05）。見表3。

表3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響（n ＝8， ±s）

表3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響（n ＝8， ±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.001；疾病組CD36 陽性率、IL-17 的mRNA 相對表達量與對照組比較，t ＝13.974、10.700，P ＜0.001。與疾病組比較，②P ＜0.001；治療組CD36 陽性率、IL-17 的mRNA 相對表達量與疾病組比較，t ＝13.512、16.610，P ＜0.001。

組別CD36 陽性率（%）IL-17 mRNA（相對表達量）對照組1.50±0.161.00±0.11疾病組0.17±0.02①2.58±0.24①治療組11.20±1.23②0.34±0.03②F 值210.900180.300 P 值＜0.001＜0.001

2.6 降鈣素與CD36、IL-17 表達的相關(guān)性

通過Pearson 分析降鈣素與CD36、IL-17 之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，降鈣素與CD36 呈正相關(guān)（r＝0.922，P＝0.001），與IL-17 呈負相關(guān)（r＝-0.881，P＝0.002）。另外，同樣通過Pearson 分析探討CD36 與IL-17 的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者的表達水平呈負相關(guān)（r＝-0.650，P＝0.023）。

3 討論

透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨在人體中發(fā)揮多種作用，包括在關(guān)節(jié)和椎間盤中承受載荷，提供關(guān)節(jié)潤滑，形成外耳和鼻子，支撐氣管，并在發(fā)育和生長過程中形成長骨[6]。因為軟骨的摩擦力比較小，很容易在運動中因為破裂而受傷。作為骨關(guān)節(jié)炎的常見類型之一，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的主要特征就是軟骨損傷，而軟骨組織自我修復(fù)能力較差，一旦損傷很難自然愈合[1-2]。軟骨和關(guān)節(jié)損傷容易使軟骨退化，轉(zhuǎn)變?yōu)楣顷P(guān)節(jié)炎，嚴重影響人類的生活和工作，目前尚無治愈方法[7]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨和關(guān)節(jié)損傷時伴隨多個微環(huán)境的變化，包括炎癥、骨重塑、血管、神經(jīng)的出現(xiàn)以及細胞外和細胞周圍基質(zhì)、氧張力、生物力學、關(guān)節(jié)軟骨組織下、pH 值的改變[8]。

目前臨床對于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的治療多以鎮(zhèn)靜、止痛、抗感染等藥物治療為主，然而這些方法只能短期改善關(guān)節(jié)功能，停藥后易復(fù)發(fā)，且后期可能會導致軟骨退化[7，9]。降鈣素是由甲狀腺濾泡旁細胞分泌的激素，其能夠通過降低血鈣水平，抑制破骨細胞介導的骨吸收，從而降低骨折的發(fā)生率，刺激成骨細胞的形成并增加其活性[10]。細胞外基質(zhì)是由軟骨細胞合成分泌并起著保護軟骨細胞的屏障作用。王康等[11]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)合成和失衡是引起創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)病的重要原因之一。作為細胞外基質(zhì)的兩大主要成分之一，ColⅡ是關(guān)節(jié)軟骨中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其在維持軟骨的生物力學功能方面具有重要的作用[12]。MMP13 是一種依賴于Zn2+的蛋白酶，催化Col Ⅱ的裂解，過多的MMP13活性導致骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退化，使這種蛋白酶成為一個有吸引力的治療靶點[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素治療后IL-1β 誘導的軟骨細胞的增殖能力升高，MMP13 的mRNA 表達降低，同時Col Ⅱ的mRNA 表達升高。這些結(jié)果證實降鈣素有助于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞活力恢復(fù)，抑制軟骨細胞退化。

ROS 已被確定為炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，控制氧化應(yīng)激和抗氧化酶活性，從而促進炎癥活性的增加[15]。當ROS 的產(chǎn)生速度快于關(guān)節(jié)軟骨清除活性氧的速度時，關(guān)節(jié)軟骨就會受到氧化應(yīng)激的影響。在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的背景下，軟骨中氧化應(yīng)激水平高，導致慢性炎癥，這反過來又可以驅(qū)動滑膜炎癥、關(guān)節(jié)內(nèi)病變形成、軟骨細胞合成代謝處理和軟骨變性[16]。CD36 其廣泛存在于多種組織細胞中，在多個生理過程中參與細胞的清除。同時，CD36 被多種炎癥因子抑制其表達，目前已成為間接研究炎癥反應(yīng)的熱點[17-18]。IL-17 是T 細胞誘導的炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可以通過促進釋放前炎癥細胞因子來放大炎癥反應(yīng)。馮方等[19]研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17 的水平高于健康患者，且IL-17 的水平與膝關(guān)節(jié)VAS 評分呈正相關(guān)（r＝0.914，P＜0.01），即IL-17 可反映膝骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛程度及功能損傷程度，臨床通過減少關(guān)節(jié)滑液中IL-17，可能會減輕膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀。本研究通過檢測軟骨細胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子及炎癥反應(yīng)標志物的變化來探討降鈣素的作用機制。實驗發(fā)現(xiàn)，人軟骨細胞經(jīng)IL-1β 損傷后CD36 陽性率、SOD 活力及GSDMD-N 蛋白表達降低，同時MMP13 和IL-17 的mRNA 相對表達量、NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達水平、ROS 的MFI 及MDA 的含量升高。然而，降鈣素治療能夠逆轉(zhuǎn)上述指標的變化。所有結(jié)果表明降鈣素對軟骨細胞的保護機制可能與抑制IL-17 的表達，增強CD36 的表達及緩解軟骨細胞的應(yīng)激炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果闡明降鈣素對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，其有助于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞活力恢復(fù)，抑制軟骨細胞退化，緩解軟骨細胞的應(yīng)激炎癥反應(yīng)，其機制與抑制IL-17 的表達，增強CD36 的表達有關(guān)。該研究為軟骨損傷的深入研究及降鈣素治療軟骨損傷的臨床應(yīng)用提供參考。