miRNAs對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響及中醫(yī)藥的干預作用

李晨輝，彭孟凡，孔小莉，白明*，苗明三*（.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046；.黃淮學院，河南 駐馬店 463000）

食管癌是常見惡性腫瘤，統(tǒng)計顯示，其患病率和死亡率在全球惡性腫瘤中分別居第七位和第六位[1]。早期的食管癌癥狀不明顯，且病灶局限，影像學檢查檢出率及準確性有限，腫瘤標志物檢測（CYFRA21-1、CEA、SCCA、p53蛋白抗體等）的特異性與靈敏度也不高，不利于早期食管癌的診斷和治療[2]。MicroRNAs（miRNAs）是由18～24個核苷酸組成的內源性非編碼小分子RNA，是近年來腫瘤檢測標志物和腫瘤研究領域的一大熱點。miRNAs可通過與長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）、信使RNA（mRNA）、蛋白分子等相互作用，參與調控細胞的增殖、周期、分化、凋亡等生理過程，介導包括食管癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3]。

中醫(yī)藥在食管癌的防治、預后等方面效果明顯，可增強臨床療效，提高患者生活質量[4]。近年來，中醫(yī)藥通過miRNAs干預腫瘤進展的研究日益增多，因此，文章就miRNAs在食管癌發(fā)生發(fā)展中的雙重調控機制及中醫(yī)藥經(jīng)miRNAs干預食管癌的作用機制進行系統(tǒng)綜述，旨在為食管癌的臨床診斷、治療和預后評估等提供新思路。

1 miRNAs的概述

miRNAs是在動物、植物和一些病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，第一個人類miRNAslet-7于2000年被發(fā)現(xiàn)，目前已有2000多種人類miRNAs在數(shù)據(jù)庫中被注釋[5]。miRNAs可通過與特定的功能蛋白形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）來調控細胞的生物過程，其調控途徑主要為與mRNA堿基、靶片段互補配對，抑制靶基因翻譯，以及調控靶基因啟動子CpG島（CpG island）的甲基化來影響靶基因的轉錄[6]。miRNAs在惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用，miRNAs既可作為促癌基因參與食管癌的發(fā)生，誘導腫瘤細胞放化療抵抗，減弱臨床治療效果，促進腫瘤細胞無限增殖、侵襲和轉移等多種惡性生物學行為；又可作為抑癌基因降低食管癌的發(fā)生率，阻斷其惡性發(fā)展[7]。部分參與的miRNAs如表1所示。

表1 部分miRNAs對食管癌的影響Tab 1 Impact of part of miRNAs on esophageal cancer

2 miRNAs對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響

2.1 miRNAs對食管癌動物模型的影響

體內動物實驗表明，過表達miRNAs-200c的Eca109細胞皮下成瘤的腫瘤的體積和重量與Eca109細胞相當，放療可以降低皮下瘤的體積和瘤重。miRNAs-200c可通過抑制細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）、細胞分裂周期基因cdc2（cell division cycle gene，cdc2）和促進P21蛋白表達抑制體內腫瘤進展，具體表現(xiàn)為，過表達miRNAs-200c的Eca109細胞皮下成瘤的腫瘤的體積和重量經(jīng)放射治療后均顯著低于Eca109細胞皮下瘤[8]。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)，與順鉑抵抗食管癌細胞株OE19/CDDP相比，過表達miR-181a-5p的細胞株OE19/CDDP具有更小的腫瘤體積和瘤重，且經(jīng)順鉑治療后，后者腫瘤體積減小和瘤重降低更為顯著。Li等[10]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-29c的細胞株KYSE410FR皮下成瘤能力較KYSE410弱，且經(jīng)氟尿嘧啶（5-FU）治療后，前者皮下瘤體積顯著減小，表明miR-29c可在體內水平促進腫瘤細胞對5-FU的敏感性，增強抗腫瘤效果，且該作用是通過靶向結合FBXO31mRNA進而升高腫瘤組織cleaved caspase-3、p-p38和降低Ki67蛋白實現(xiàn)的。Wu等[11]發(fā)現(xiàn)，順鉑干預可抑制食管癌細胞Eca109的皮下成瘤能力，減小腫瘤體積和降低瘤重。與順鉑比，干擾Eca109細胞miR-10b表達后聯(lián)合順鉑治療更能顯著減小腫瘤體積和降低瘤重。

2.2 miRNAs對離體食管癌的影響

2.2.1 miRNAs對食管癌細胞的影響 分化抑制因子3（ID3）在食管癌中扮演致癌基因的角色，可通過激活ERK/MAPK通路誘導食管癌細胞增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為[12]。體外實驗表明，miRNAs-340-5p能通過結合ID3 3'-UTR端在轉錄和翻譯水平降低ID3表達，從而抑制食管癌Eca109細胞增殖、遷移和侵襲[13]。GEPIA數(shù)據(jù)庫中臨床數(shù)據(jù)表明，lncRNA DLEU2在食管癌組織中高表達，并與患者不良預后相關，還可在體外促進食管癌細胞Eca-109和KYSE-150惡性表型。miR-30e-5p可通過內源性結合lncRNA DLEU2解除其對轉錄因子-7（E2F7）的正調控作用，抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，增加細胞凋亡[14]。

相反，部分研究表明miRNAs在食管癌中發(fā)揮抑癌作用。miR-301a-3p參與多種腫瘤的發(fā)病，包括食管癌，其在正常食管黏膜細胞系Het-1A中的表達顯著低于食管癌細胞Eca109和TE-1，過表達miR-301a-3p則可顯著增強Eca109細胞增殖能力和克隆形成率，該作用是通過miR-301a-3p靶向PTEN基因的3'-UTR端，進而抑制PTEN/PI3K/AKT通路實現(xiàn)的。而抑制miR-301a-3p表達，則可抑制PTEN/PI3K/AKT通路、降低Bcl-2蛋白、升高Bax蛋白，從而抑制Eca109細胞的增殖[15]。高棟才[16]發(fā)現(xiàn)，食管癌TE-1細胞中miR-103a-2-5p的表達低于KYSE-150細胞，在TE-1細胞中過表達miR-103a-2-5p可增加其增殖、侵襲和遷移能力，而敲低KYSE-150細胞miR-103a-2-5p可抑制其增殖、侵襲和遷移能力。進一步研究表明，與高水平miR-103a-2-5p的外泌體共培養(yǎng)也可促進食管癌細胞TE-1和KYSE-150的增殖、侵襲和遷移。

2.2.2 miRNAs對腫瘤相關巨噬細胞的影響 腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是在腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞，具有異質性，常具有M1型和M2型兩種分化狀態(tài)，一般而言，M1型具有抗腫瘤作用，M2型具有促腫瘤作用?，F(xiàn)有研究表明，miRNAs在巨噬細胞的分化和活性維持中具有重要作用。miR-21-5p在EC109及其外泌體中高表達，同時miR-21-5p可由外泌體作為傳遞介質，被巨噬細胞攝取，抑制巨噬細胞吞噬功能，促進巨噬細胞增殖和極化為M2型。EC109 細胞轉染miR-21-5p mimic與巨噬細胞共培養(yǎng)可增加轉化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素（IL）-10、CD206 mRNA、CD209 mRNA等M2型巨噬細胞標志物表達，促進其向M2型極化。此外，抑制M2型巨噬細胞miR-21-5p可抑制其表型M2型。而且外泌體miR-21-5p誘導的M2型巨噬細胞可通過釋放TGF-β，進而激活食管癌細胞TGF-β/Smad2/EMT通路，促進其遷移、侵襲能力[17]。

相反，miR-34a、miR-543、miR-765等可通過抑制巨噬細胞M2型極化，發(fā)揮抗食管癌作用。如蓋宇等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-34a在M2型巨噬細胞中的表達顯著低于M1型，過表達miR-34a可顯著降低M2型巨噬細胞標志物CD206、CD163、CCL18、CCL22等的表達，抑制巨噬細胞向M2型極化。將過表達miR-34a的M2型巨噬細胞與食管癌細胞共培養(yǎng)后，可顯著抑制EC109細胞的遷移能力，增加其早期和晚期凋亡率。過表達circRNA TCFL5可通過誘導巨噬細胞向M2型極化促進食管癌細胞Eca109和KYSE150的增殖、侵襲和遷移，而miR-543 mimics則可通過靶向結合circRNATCFL5，抑制巨噬細胞向M2型極化，最終抑制食管癌細胞的惡性生物學行為[19]。lncRNA RP11-465B22.8參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展，在食管癌組織中高表達。在食管癌細胞TE-1和KYSE150中轉染miR-765 mimics可通過靶向吸附lncRNA RP11-465B22.8減弱其對M2型巨噬細胞的極化作用，消除其對食管細胞增殖、遷移和微管形成的增強作用[20]。

2.2.3 miRNAs對食管癌細胞放療抵抗的影響miRNAs通過調節(jié)細胞凋亡、與放射相關的通路和細胞周期進程等方式，參與對腫瘤細胞放射敏感性的調控。其中，調控細胞周期是miRNAs影響腫瘤細胞對放療敏感性的主要方式。研究表明，相比正常KYSE150細胞，放療抵抗性食管癌KYSE150細胞（KYSE150R）的細胞周期在G0/G1期受阻、Cyclin D1蛋白水平降低，而miR-193b水平升高。免疫熒光素酶報告實驗表明，miR-193b可通過靶向結合Cyclin D1的3'-UTR端使細胞阻滯于G0/G1期，進而降低食管癌細胞的敏感性[21]。

相反，miRNAs-200c在放療抵抗食管癌患者腫瘤組織及Eca109細胞中低表達，過表達miRNAs-200c可通過下調Cyclin B1、P21和升高P21蛋白誘導細胞周期阻滯，尤其是G2/M期和亞G1期阻滯，從而增強Eca109細胞放射敏感性[8]。miRNAs-30a-3p在EC9706和EC109細胞株中表達顯著低于食管正常上皮細胞，并與腫瘤細胞的放射敏感性有關，即miRNAs-30a-3p可通過靶向食管癌細胞 IGF-1R的3'-UTR端降低IGF-1R mRNA和蛋白表達提高EC9706和EC109對射線的敏感性，從而降低基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表達，使細胞阻滯于G1期，抑制細胞增殖，降低EMT標志蛋白N-cadherin和vimentin表達，升高E-cadherin蛋白表達，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力[22]。過表達miR-301a介導的WNT1抑制能通過降低轉錄因子4（TCF4）和Cyclin D1的mRNA表達干擾細胞周期，從而增強KYSE150R細胞對放射線的敏感性，抑制細胞活力和侵襲能力。反之，干擾miR-301a可降低放射敏感性KYSE150細胞對放射線的敏感性，增強其增殖和遷移能力[23]。

2.2.4 miRNAs對食管癌細胞化療抵抗的影響食管癌在診斷時多處于中晚期，錯過手術治療的最佳時機，臨床多采用化療結合放療的手段進行治療。然而，在持續(xù)性治療中，機體常產(chǎn)生一定的耐藥性，腫瘤細胞對藥物的敏感性降低，難以維持治療。miRNAs作為腫瘤治療的新興靶點，在食管癌化療抵抗中發(fā)揮重要作用。彭潔[24]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇處理的耐藥食管癌TE-1細胞中18個miRNAs上調，28個miRNAs下調。沉默miR-378d后的細胞系 TE-1、KYSE150較對照組細胞均有顯著的5-FU和順鉑耐藥性，表現(xiàn)為細胞半數(shù)致死量升高、克隆形成能力增強、細胞骨架重排（肌動蛋白絲骨架以及更延展的形態(tài)）、以TE-1細胞系差異最顯著。雙熒光素酶基因報告表明，沉默miR-378d而導致的細胞化療藥物抵抗是由于miR-378d水平降低，其靶向結合AKT基因的3'-UTR抑制AKT-β-catenin通路作用減弱而導致的。miR-29c在5-FU耐藥食管癌細胞（KYSE150FR、KYSE410FR）水平較親本細胞KYSE150、KYSE410顯著降低，過表達miR-29c可逆轉KYSE150FR和KYSE410FR細胞對5-FU的耐藥性，抑制細胞增殖和活性。相反，敲低miR-29c可進一步加重KYSE150、KYSE410細胞對5-FU的抵抗性，增強細胞活力和增殖能力[10]。

相反，miR-21在食管癌細胞株TE-1和Eca109/CDDP（順鉑抵抗細胞株）中表達顯著高于正常食管上皮細胞Het-1A，且在順鉑抵抗的癌細胞株中表達更高。過度表達miR-21可降低食管癌細胞對順鉑的敏感性，抑制miR-21可增強TE-1對順鉑的敏感性，雙熒光素酶報告證實，miR-21降低食管癌細胞對順鉑的敏感性是通過靶向程序化細胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR端進而抑制其轉錄和翻譯產(chǎn)物實現(xiàn)的[25]。較之正常食管上皮細胞和組織，miR-10b在食管癌細胞EC109、TE10和組織中高表達，且miR-10b介導的PPARγ抑制能通過激活AKT/mTOR/P70S6K信號通路，增強腫瘤細胞的順鉑抵抗。干擾miR-10b表達可增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性，從而抑制EC109和TE10細胞活力和克隆形成能力、降低順鉑的半抑制濃度（IC50）值、抑制Bcl-2蛋白表達、升高Bax蛋白表達，最終促進腫瘤細胞凋亡[11]。

綜上，部分參與的miRNAs對食管癌的影響的匯總情況見表1。

3 中醫(yī)藥經(jīng)miRNAs干預食管癌的作用機制

食管癌屬中醫(yī)學“噎膈”范疇，是“風、癆、臌、膈”四大頑癥之一。“噎膈”病因復雜，體虛外感、七情內傷、飲食不節(jié)等致氣、痰、瘀、熱交阻，津氣耗傷，食管梗阻成病。中醫(yī)藥防治食管癌以辨證論治為主，在應用方面涉及單味中藥及有效成分、中藥復方等，多從清熱解毒、化痰散瘀、益氣活血、解毒散結等方面入手，結合手術、放療或化療，以降低術后不良反應、減輕放化療抵抗和相應不良反應的發(fā)生率[26]。

3.1 中藥單味藥及提取物

藤梨根是獼猴桃科植物中華獼猴桃植物的干燥根，首次記載于《開寶本草》?，F(xiàn)代研究表明，藤梨根活性成分對多種惡性腫瘤有防治作用，其抗腫瘤機制主要包括抑制腫瘤細胞增殖生長、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管生成等[27]。研究顯示，藤梨根提取物在一定濃度范圍內可以上調miR-451的表達水平，從而對細胞株內CDKN2D、AKT、BCL-2等DNA表達基因進行調節(jié)，腫瘤細胞的分裂多停留在DNA合成前期，進而削減細胞的侵襲能力，促使腫瘤細胞凋亡速度加快[28-29]。

毛葉香茶菜是一種少見的中草藥，其活性提取物表諾多星（epinodosin，EP）是具有抗腫瘤活性的五環(huán)二萜類化合物。李亞妹[30]發(fā)現(xiàn)，EP在4種食管鱗癌細胞中均可誘導miR-143-3p的表達，降低靶向基因Bcl-2的表達量；此外，還可顯著抑制MAPKs信號通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的表達，抑制MAPKs信號通路的激活，抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移與侵襲。

南蛇藤是我國傳統(tǒng)中藥，在我國分布廣泛，其根、莖、葉均可入藥，具有活血、解毒、祛風、消腫的功效。于耀洋等[31]將miR-302體外轉染至食管癌TE-1細胞，與南蛇藤提取物（COE）聯(lián)合作用于TE-1細胞，發(fā)現(xiàn)COE和過表達miR-302可抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制TE-1細胞增殖、侵襲和遷移，且兩者聯(lián)合使用效果強于單一因素作用。提示COE聯(lián)合miR-302能夠協(xié)同抑制食管癌TE-1細胞增殖、侵襲和遷移。

丹參酮ⅡA（tanshinone IIA，TSⅡA）是丹參的主要有效成分之一，向文杰[32]發(fā)現(xiàn)將其與硒-甲基硒代半胱氨酸（se-methylselenocysteine，MSC）聯(lián)合使用能顯著上調抑癌基因miR-203a-3p的表達水平，且相比于同等劑量的丹參酮ⅡA差異有統(tǒng)計學意義，miR-203a-3p能調控GATA6從而抑制ESCC細胞的增殖和侵襲，而MSC顯著有效地放大了丹參酮ⅡA對腫瘤細胞增殖活力的抑制能力，miR-203a-3p很有可能是發(fā)揮該作用的重要因子。

3.2 中藥復方

啟膈散記載于《醫(yī)學心悟》，為治療“噎膈”之名方，臨床常用于食管癌的治療，其藥方含丹參、沙參、川貝母、茯苓、砂仁、郁金，為行氣化痰法代表方劑。miR-133a/PI3K/Akt等信號通路是影響食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的重要信號通路。研究顯示，啟膈散能通過調控食管癌EC9706細胞miR-133a/PI3K/Akt信號環(huán)路甲基化，促進miR-133a在腫瘤細胞的表達，抑制PI3K/Akt信號通路的激活；下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的蛋白表達，抑制食管癌EC9706細胞的增殖[33-34]。啟膈散與順鉑聯(lián)用在抑制食管癌細胞EC9706增殖方面具有協(xié)同作用，其機制可能與抑制miR-21表達從而升高PDCD4和PTEN基因表達相關[35]。

六君子湯作為健脾和胃的經(jīng)典代表方，臨床應用廣泛，是治療和輔助治療食管癌的有效方藥，其搭配營養(yǎng)管理能夠減輕患者放化療毒副作用，改善患者的營養(yǎng)和免疫狀態(tài)[36]。miR-34a/STAT3/IL-6R反饋環(huán)在多種類型腫瘤中存在，與癌癥的侵襲與轉移、免疫抑制等相關，六君子湯可通過提高miR-34a的表達，逆轉IL-6R/STAT3信號通路介導的miR-34a抑制，從而抑制免疫檢查點PD-L1的表達，抑制免疫逃逸，調節(jié)機體免疫反應，介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展，參與腫瘤微環(huán)境免疫抑制[37]。

消癌解毒方是國醫(yī)大師周仲瑛教授結合多年臨床經(jīng)驗總結而形成的有效驗方，抗腫瘤效果顯著，該方與化療藥聯(lián)用，有提高腫瘤化療療效的作用。丁艷[38]發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p高表達，并與淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度有關，中藥消癌解毒方聯(lián)合放療可降低患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p水平，減輕臨床癥狀，提高生活質量。

綜上，不同中藥抑制食管癌的作用機制歸納總結見表2。

表2 不同中藥通過miRNAs抑制食管癌的作用機制Tab 2 Mechanism of different Chinese medicines in inhibiting esophageal cancer via miRNAs

4 總結和展望

食管癌發(fā)病隱匿、早期癥狀不典型，是導致其確診時已處于中晚期的主要原因，因此有必要尋找敏感性高的生物標志物，以便在食管有癌變趨勢或腫瘤早期進行干預，降低食管癌發(fā)病率和減緩惡性進展速度。miRNAs在基因表達調控中起著至關重要的作用，更是腫瘤診斷、治療和預后的潛在標志物和治療靶點。中醫(yī)藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學中的特色，可調控相關miRNAs影響B(tài)ax/Bcl-2、ERK/MAPK、AKT/mTOR/P70S6K、PTEN/PI3K、TGF-β/Smad2/ EMT等信號通路，腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞與腫瘤細胞交叉通路等參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，為臨床治療提供新方法、新思路。