pH值對(duì)氟馬西尼注射液質(zhì)量的影響研究

郭丹峰，金怡平，肖利輝，袁金橋（嘉實(shí)（湖南）醫(yī)藥科技有限公司，長沙 410217）

氟馬西尼作為一種苯二氮?類藥物的拮抗劑，可與苯二氮?受體特異性結(jié)合，減少γ-氨基丁酸的釋放[1]，臨床主要用于逆轉(zhuǎn)苯二氮?類藥物所致的中樞鎮(zhèn)靜作用[2]，如終止用苯二氮?類藥物誘導(dǎo)及維持的全身麻醉。根據(jù)其特定的臨床用途以及肝臟首過效應(yīng)的影響[3]，目前國內(nèi)外上市的劑型均為注射液[4]。氟馬西尼是一種酯類化合物，易水解生成雜質(zhì)A，如圖1所示，可能導(dǎo)致氟馬西尼注射液的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒和含量在貯藏期間發(fā)生改變，影響藥品的安全性和有效性。pH值作為影響雜質(zhì)A降解速度的關(guān)鍵因素之一，暫無文獻(xiàn)報(bào)告其對(duì)氟馬西尼注射液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響。本文參考國內(nèi)外藥典規(guī)定的pH值范圍，按照參比制劑的處方制備不同pH值的氟馬西尼注射液，考察自制氟馬西尼注射液與參比制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性，為制劑工藝中pH值的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 氟馬西尼的水解反應(yīng)Fig 1 Hydrolysis reaction of flumazenil

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS105DU型分析天平（精度：0.01 mg）、FE28型pH計(jì)（瑞士梅特勒托利多）；FCD-2000型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Milli-Q純水儀（德國默克）；YXQ-LS-50A型立式高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；AGL-2型安瓿拉絲灌封機(jī)（長沙益廣制藥機(jī)械有限公司）；SHH-12W-SD型穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶康誠永生試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；YB-2型澄明度檢測儀（天大天發(fā)科技有限公司）；LE100型微粒檢測儀（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）。

氟馬西尼對(duì)照品（批號(hào)：100727-202003，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)：190901，純度：99.4%，自制）；氟馬西尼（原料藥，批號(hào)：180101，湖南華納大藥廠手性藥物有限公司）；依地酸二鈉（輔料級(jí)，批號(hào)：102320180301，湖南爾康制藥股份有限公司）；醋酸（輔料級(jí)，批號(hào)：20180403，臺(tái)山市新寧制藥有限公司）；氯化鈉（輔料級(jí)，批號(hào)：01170803，天津壽光藥業(yè)股份有限公司），氫氧化鈉（輔料級(jí)，批號(hào)：180901，四川金山制藥有限公司），甲醇（色譜純，Sigma，批號(hào)：WXBC3660V）；水為超純水；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180315）；四氫呋喃（色譜純，Sigma，批號(hào)：WXBC6565V）；氟馬西尼參比制劑（批號(hào)：F4001F02，規(guī)格：5 mL/0.5 mg，Cheplapharm Arzneimittel GmbH）。

2 方法與結(jié)果

2.1 氟馬西尼注射液的制備

取純化水400 mL，水浴維持60～70℃，依次加入?yún)⒈戎苿┨幏搅康穆然c、依地酸二鈉和冰醋酸，攪拌使溶解，再加入氟馬西尼50 mg，攪拌使溶解，冷卻，平行配制6份，用稀冰醋酸溶液或0.1%氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、3.4、3.8、4.2、4.6和5.0，再分別用純化水定容至500 mL，用0.22 μm濾膜過濾，照每支5 mL灌裝，熔封，于121℃濕熱滅菌15 min，放冷，即得。

2.2 有關(guān)物質(zhì)和含量分析方法的驗(yàn)證

2.2.1 色譜條件 照《中國藥典》2020年版二部氟馬西尼注射液有關(guān)物質(zhì)和含量測定方法的色譜條件[5]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，以稀磷酸溶液（取水1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.0）-甲醇-四氫呋喃（80∶13∶7）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 取冰醋酸、依地酸二鈉、氯化鈉和氫氧化鈉適量，用水溶解并稀釋制成處方濃度的溶液，作為空白輔料溶液；以流動(dòng)相作為空白溶液；取雜質(zhì)A適量，加甲醇適量使溶解，再用水定量稀釋制成每l mL中約含雜質(zhì)A 0.5 μg的溶液，作為雜質(zhì)A溶液；取氟馬西尼注射液作為樣品溶液。取各溶液進(jìn)樣，結(jié)果空白溶液和輔料不干擾主峰和雜質(zhì)峰檢測，樣品溶液色譜圖中無未知雜質(zhì)，雜質(zhì)A峰與主峰之間的分離度為22.2，主峰拖尾因子為1.1，說明本方法具有良好的專屬性，典型圖譜見圖2。

圖2 氟馬西尼注射液色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of flumazenil injection

2.2.3 檢測限和定量限 取雜質(zhì)A對(duì)照品和氟馬西尼對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，再用水稀釋至信噪比等于3的溶液（即檢測限溶液），信噪比等于10的溶液（即定量限溶液）。結(jié)果雜質(zhì)A和氟馬西尼檢測限分別為0.001和0.002 μg·mL－1，定量限分別為0.003和0.006 μg·mL－1。雜質(zhì)A和氟馬西尼定量限濃度相當(dāng)于樣品溶液中主成分濃度的0.003%和0.006%，說明本方法具有較好的靈敏度。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取雜質(zhì)A對(duì)照品和氟馬西尼對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，再用水稀釋至含雜質(zhì)A和氟馬西尼0.05、0.2、0.8、1.0、1.2和1.5 μg·mL－1的溶液，作為線性溶液。雜質(zhì)A濃度（X）與峰面積（Y）的線性方程為Y＝7.758×104X－72，r＝1.000；氟馬西尼濃度（X）與峰面積（Y）的線性方程為Y＝7.074×104X－51，r＝1.000。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比法測定雜質(zhì)A的校正因子，所得校正因子在0.9～1.1，因此雜質(zhì)A可按照不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算[6]。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 取雜質(zhì)A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，按照50%、100%和150%的雜質(zhì)限度濃度加入氟馬西尼注射液（pH 3.8）中；另取氟馬西尼對(duì)照品適量，精密稱定，按照80%、100%和120%的理論濃度加入空白輔料溶液中，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算雜質(zhì)A和氟馬西尼的回收率。結(jié)果低、中、高濃度水平雜質(zhì)A的回收率在97.2%～101.2%，氟馬西尼的回收率在100.3%～101.2%，RSD值均小于2.0%，說明本方法能準(zhǔn)確檢測氟馬西尼注射液中雜質(zhì)A和主藥含量。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取氟馬西尼注射液（pH 3.8）6支，精密量取樣品溶液適量，加水定量稀釋制成每l mL中約含氟馬西尼1 μg的溶液，作為對(duì)照溶液，按不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算重復(fù)性樣品溶液中有關(guān)物質(zhì)，按外標(biāo)法計(jì)算主藥含量。6份重復(fù)性樣品溶液中雜質(zhì)A平均含量為0.05%，RSD為0.83%；氟馬西尼平均含量為100.9%，RSD為0.36%，說明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取氟馬西尼注射液作為樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，氟馬西尼主峰面積的RSD為0.26%，雜質(zhì)A峰面積的RSD為0.92%，說明本方法具有良好的精密度。

2.3 pH值對(duì)氟馬西尼注射液質(zhì)量的影響

2.3.1 初始質(zhì)量屬性對(duì)比 取不同pH值的自制氟馬西尼注射液與參比制劑，解析性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒、有關(guān)物質(zhì)和含量等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，結(jié)果見表1，所有樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒和含量結(jié)果基本一致，符合國內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)以及通則要求；有關(guān)物質(zhì)除雜質(zhì)A外，均未檢出其他雜質(zhì)。當(dāng)pH值在3.4～4.6，自制氟馬西尼注射液中雜質(zhì)A含量相對(duì)較低，說明當(dāng)pH值控制在上述范圍時(shí)，氟馬西尼注射液在生產(chǎn)過程中穩(wěn)定性較好，不易降解。參比制劑中雜質(zhì)A含量明顯高于自制氟馬西尼注射液，這可能與參比制劑所用原料藥中雜質(zhì)A含量較高以及參比制劑在貯藏期間降解有關(guān)。

表1 不同pH的氟馬西尼注射液和參比制劑檢測結(jié)果Tab 1 Determination of flumazenil injections at different pH and reference preparations

2.3.2 pH值對(duì)氟馬西尼注射液穩(wěn)定性的影響 取不同pH值的氟馬西尼注射液，與參比制劑同時(shí)置于長期（30℃，65% RH）和加速（40℃，75%RH）穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，于1、3和6個(gè)月后分別取樣，評(píng)估不同pH值的氟馬西尼注射液與參比制劑的穩(wěn)定性差異。所有樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒在加速和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下基本不變；有關(guān)物質(zhì)除雜質(zhì)A外，未檢出其他雜質(zhì)，雜質(zhì)A檢測結(jié)果見表2，氟馬西尼含量測定結(jié)果見表3。不同pH的氟馬西尼注射液中雜質(zhì)A呈現(xiàn)不同幅度增長，當(dāng)pH值在3.8～4.6內(nèi)，自制氟馬西尼注射液中雜質(zhì)A在長期和加速穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下的增長速率與參比制劑相當(dāng)。含量在長期試驗(yàn)條件下變化較小，受檢測誤差的影響，變化趨勢不明顯，在加速試驗(yàn)條件下總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但未發(fā)生顯著變化。當(dāng)pH為3.0時(shí)，加速3、6個(gè)月的氟馬西尼注射液中雜質(zhì)A含量已超出國內(nèi)外藥典限度，樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒檢測結(jié)果不變，說明氟馬西尼降解不會(huì)導(dǎo)致本品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒在貯藏期間改變。

表2 雜質(zhì)A的含量檢測結(jié)果(%)Tab 2 Content of impurity A (%)

表3 氟馬西尼注射液中氟馬西尼的含量(%)Tab 3 Content of flumazenil in flumazenil injection (%)

3 討論

3.1 有關(guān)物質(zhì)檢測方法

本文對(duì)《中國藥典》2020年版二部氟馬西尼注射液有關(guān)物質(zhì)檢測方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法具有較好的專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確度、線性、重復(fù)性和精密度，能有效檢測降解雜質(zhì)A和其他雜質(zhì)。氟馬西尼注射液無需稀釋直接注入色譜系統(tǒng)，輔料濃度較高，使用該方法檢測有關(guān)物質(zhì)時(shí)，應(yīng)注意識(shí)別空白輔料峰。

3.2 氟馬西尼注射液的制備方法

氟馬西尼在冰醋酸中易溶，在水中幾乎不溶，室溫下氟馬西尼溶解速率非常緩慢，升高溫度氟馬西尼溶解速率增加，但雜質(zhì)A降解加劇。如何增加氟馬西尼的溶解速率，提升配液效率，減少雜質(zhì)降解是氟馬西尼注射液配制時(shí)需要關(guān)注的重點(diǎn)。有專利報(bào)道了氟馬西尼注射液的制備方法[7]，專利處方與參比制劑基本一致，配液溫度為室溫。重現(xiàn)該專利方法配制氟馬西尼注射液時(shí)，盡管有關(guān)物質(zhì)未增長，但原料藥完全溶解所需時(shí)間長達(dá)2 h，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本文介紹的氟馬西尼注射液配制方法為充分評(píng)估氟馬西尼溶解速率以及雜質(zhì)增長后制訂的，當(dāng)配液溫度為60～70℃，氟馬西尼完全溶解所需時(shí)間縮短至30 min以內(nèi)，雜質(zhì)A增長可忽略不計(jì)，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3 pH值控制范圍

在氟馬西尼注射液的法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中，《中國藥典》規(guī)定的pH值為3.5～4.2，《美國藥典》規(guī)定的pH值是3.4～4.6。根據(jù)pH值對(duì)氟馬西尼注射液穩(wěn)定性影響的研究結(jié)果，當(dāng)pH值控制在3.8～4.6時(shí)，氟馬西尼注射液在生產(chǎn)和貯藏過程中穩(wěn)定性好，與參比制劑的穩(wěn)定性一致，說明《美國藥典》制定的pH值范圍上限更加合理。當(dāng)pH等于3.4，雜質(zhì)A增長速度顯著加快，不利于本品在貨架期內(nèi)貯藏。為嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，生產(chǎn)過程中應(yīng)將氟馬西尼注射液的pH值控制在3.8～4.6。