基于UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接研究五味清濁顆粒治療腹瀉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

李偉，孫佳，李思雨，余秋香，王添敏，宋慧鵬，張慧（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

五味清濁顆粒又名當(dāng)瑪-5、通拉嘎-5，為蒙古族驗方，始載于《后序醫(yī)典》，1985年版《中國藥典》首次將其載入[1]，由石榴、紅花、肉桂、蓽茇、豆蔻五味藥材組成，具有開郁消食、暖胃的功效[2]。方中石榴為君藥，以溫胃增火，清肝熱為主；紅花為臣藥，以清熱、增強體質(zhì)為輔；蓽茇、肉桂、豆蔻均為佐使藥，蓽茇溫中散寒、止瀉化腐；肉桂散寒止痛，益胃火；豆蔻溫胃腎[3]。臨床上常用于治療腹瀉[4-6]且效果較好，寒證、熱證均可使用，但迄今為止，處方藥效物質(zhì)潛在的有效成分及作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)是目前預(yù)測復(fù)方有效成分的有效手段，但目前多以文獻(xiàn)報道或TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄的化學(xué)成分為對象，對五味清濁顆粒進(jìn)行活性成分的預(yù)測，目標(biāo)性不強，導(dǎo)致預(yù)測的活性成分在中藥中檢測不到，預(yù)測的結(jié)果沒有意義，為此需要在五味清濁顆粒成分確定存在的基礎(chǔ)上，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的預(yù)測。

本論文采用質(zhì)譜分析技術(shù)，對五味清濁顆粒進(jìn)行分析，以檢測到的成分為對象，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析，篩選活性成分，揭示作用機(jī)制，為五味清濁顆粒研究奠定基礎(chǔ)，指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6550型三重四極桿高分辨質(zhì)譜儀（配置Dual AJS ESI 離子源）[安捷倫科技（中國）有限公司]、KQ250DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、十萬分之一天平（梅特勒 ME55C137550880，精度：0.01 mg）。

1.2 試藥

五味清濁顆粒（批號：20211010，規(guī)格：3 g/袋，祈蒙股份有限公司），對照品沒食子酸（純度≥98.0%，批號：B20851）、胡椒堿（純度≥98.0%，批號：B20516）、羥基紅花黃色素A（純度≥98.0%，批號：B20968）、木犀草素（純度≥98.0%，批號：B20888）、山柰酚（純度≥98.0%，批號：B21126）、肉桂醛（純度≥98.0%，批號：B21081）（上海源葉生物科技有限公司）；鞣花酸（純度≥98.0%，批號：BP0529，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）。乙腈、甲酸、甲醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Eclipsepius C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫：0～13.3 min，7%～22%B；13.3～14.6 min，22%～31%B；14.6～22 min，31%～40%B；22～29 min，40%～60%B；29～35 min，60%～80%B；35～39 min，80%～90%B。檢測波長為310 nm；進(jìn)樣體積為3 μL；柱溫為30℃；流速為0.4 mL·min－1；分析時間為39 min；柱色譜洗脫液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子模式下檢測，二級質(zhì)譜采集采用Auto MS/MS模式；干燥氣體溫度為250℃，干燥氣體流速為14 L·min－1；毛細(xì)管電壓為3500 V，碎裂電壓為3500 V，霧化器壓力為35 psi，二級質(zhì)譜碰撞電壓為20 eV；質(zhì)譜采集范圍為（m/z）50～2000。

2.2 供試品溶液的制備

取五味清濁顆粒0.75 g置10 mL的量瓶中，加70%甲醇定容，超聲（頻率40 kHz，功率100 W）30 min，冷卻后用70%甲醇補足體積，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別稱取沒食子酸、胡椒堿、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山柰酚、肉桂醛、鞣花酸適量，加甲醇制成各對照品質(zhì)量濃度均為50 μg·mL－1的混合對照品溶液，即得。

2.4 結(jié)果

2.4.1 化學(xué)成分的鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，按“2.1”項下方法對五味清濁顆粒進(jìn)行正、負(fù)離子全掃描，獲得總離子流圖，見圖1。結(jié)合化學(xué)對照品，共鑒定和推測出86個化學(xué)成分，見表1[7-14]。

圖1 五味清濁顆粒的HPLC-Q-TOF-MS/MS負(fù)離子模式（A）和正離子模式（B）總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS/MS by negative ion mode（A）and positive ion mode（B）for Wuwei Qingzhuo granules

續(xù)表1

2.4.2 生物堿類化合物 生物堿類化合物主要來源于蓽茇，如胡椒堿、蓽茇寧、蓽茇酰胺等，質(zhì)譜裂解規(guī)律為胺部分容易失去一個中性哌啶或甲?；哙?，末端結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生丙烯基亞甲二氧基苯和甲基亞甲二氧基苯[12]。在五味清濁顆粒中鑒別出生物堿類化合物共25個，分別是4、24、58、60、62～65、68～81、84～86。

以65為例，闡述酰胺類生物堿的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在正離子模式下，其保留時間為19.416 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z286.1448[M＋H]＋，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C17H19NO3。母離子在質(zhì)譜高能碰撞下，丟失C5H11N形成m/z201.0550的碎片離子，再丟失CO形成m/z173.0594的離子碎片，脂肪酸末端產(chǎn)生m/z161.0593[C10H8O2＋H]＋的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0441[C8H6O2＋H]＋的甲基亞甲二氧基苯。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[12]，確認(rèn)該化合物為胡椒堿?？赡艿牧呀馔緩揭妶D2。

圖2 胡椒堿的質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 2 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of piperine

2.4.3 黃酮類化合物 黃酮類化合物主要來源于紅花，如山柰酚、槲皮素、羥基紅花黃色素A等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為逆狄爾斯-阿德爾（RDA）裂解和丟失中性碎片，在ESI多級質(zhì)譜中，CO、CO2、C2H2O等中性碎片的丟失首先發(fā)生在C環(huán)，然后發(fā)生在A環(huán)上，B環(huán)上沒有中性碎片的丟失[13]。在五味清濁顆粒中鑒別出黃酮類化合物共23個，分別是15、16、20、22、23、26、28、31、34～36、39～45、47、48、52、53、59。

以53為例，闡述黃酮類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下，保留時間為12.418 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0405 [MH]－，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C15H10O6，母離子在質(zhì)譜高能碰撞下丟失CO形成m/z257.0446的離子碎片，再丟失CO形成m/z229.0500的離子碎片。RDA裂解產(chǎn)生m/z153.0181的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[13]，確認(rèn)該化合物為山柰酚?？赡艿牧呀馔緩揭妶D3。

2.4.4 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物來源于石榴、紅花，如綠原酸、沒食子酸、蘋果酸等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為一般丟失CO2和H2O的特征碎片[13]，在五味清濁顆粒中鑒別出有機(jī)酸類化合物共12個，分別是1、2、5、8、9、19、32、49、57、67、82、83。

以19為例，闡述有機(jī)酸類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下，保留時間為1.889 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z353.0882[MH]－，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C16H18O9，母離子在質(zhì)譜高能碰撞下丟失C7H11O5-H2O、C7H11O5-CO2，形成m/z161.0244、m/z135.0453的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[13]，確認(rèn)該化合物為綠原酸?？赡艿牧呀馔緩揭妶D4。

圖4 綠原酸的質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 4 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of chlorogenic acid

2.4.5 鞣質(zhì)類化合物 鞣質(zhì)類化合物主要來源于石榴，如原花青素B、安石榴林、石榴皮亭B等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為通常發(fā)生RDA裂解、失去H2O而產(chǎn)生碎片離子峰[9]，在五味清濁顆粒中鑒別出鞣質(zhì)類化合物共16個，分別是6、7、10～14、18、21、25、27、29、30、33、37、55。

以21為例，闡述縮合鞣質(zhì)類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下，保留時間為2.662 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z577.1364[MH]－，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C30H26O12，母離子在質(zhì)譜高能碰撞下脫去C8H8O3，發(fā)生RDA裂解重排得到m/z425.0861離子碎片，接著脫去一個H2O，得到m/z407.0773離子碎片，兩個兒茶素斷裂，形成m/z289.0719離子碎片，再脫去C9H8O3，經(jīng)重排裂解得到m/z125.0248離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[9]，確認(rèn)該化合物為原花青素B?？赡艿牧呀馔緩揭妶D5。

2.4.6 苯丙素類化合物 苯丙素類化合物主要來源于肉桂，如桂皮醛、香豆素。質(zhì)譜裂解規(guī)律為內(nèi)酯環(huán)容易丟失CO、CO2產(chǎn)生質(zhì)量損失28和44的碎片離子[16]。在五味清濁顆粒中鑒別出苯丙素類化合物共2個，分別是38、51。

以38為例，闡述苯丙素類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在正離子模式下，保留時間為6.581 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z147.0437[M＋H]＋，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C9H6O2，母離子在質(zhì)譜高能碰撞下失去1分子CO，產(chǎn)生m/z119.0486的離子碎片，再失去1分子CO，得到m/z91.0547的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[16]，確認(rèn)該化合物為香豆素?？赡艿牧呀馔緩揭妶D6。

圖6 香豆素的質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 6 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of coumarin

2.5 治療腹瀉的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 活性成分和疾病的靶點篩選 將UPLC-QTOF-MS/MS鑒別獲得的86個化學(xué)成分代入TCMSP中，根據(jù)藥代動力學(xué)特征（ADME）篩選得到活性成分。利用TCMSP 和 Swiss Target Prediction得到候選靶點1014個。以“Diarrhea”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫篩選得到腹瀉相關(guān)靶點320個。最終篩選出五味清濁顆粒治療腹瀉疾病潛在靶點57個。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，將活性成分按度值（Degree）排序，篩選排名靠前的6個成分，分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。

2.5.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建與分析 將“活性成分-疾病”交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，繪制PPI。利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化，見圖7。利用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以Degree為基準(zhǔn)排序，最終篩選排名靠前的6個靶點，分別為IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8。

圖7 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 7 PPI network of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.3 GO功能及KEGG通路富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫，對GO功能排名前10的條目及KEGG排名前20的通路進(jìn)行可視化。GO分析得到生物過程（BP）條目3251個，細(xì)胞組分（CC）條目287個，分子功能（MF）條目478個。KEGG通路富集分析得到107條通路，富集的主要信號通路包括PI3K-Akt、JAK-STAT、HIF-1等信號通路，見圖8。

圖8 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病靶點基因的GO及KEGG富集分析Fig 8 GO and KEGG enrichment analysis of target genes of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.4 “核心成分-作用靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建五味清濁顆粒核心成分-作用靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。由圖9可知，五味清濁顆?；钚猿煞滞ㄟ^作用于多個靶點、多條通路發(fā)揮作用，且成分、靶點、通路間存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系。

圖9 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病 “核心成分-作用靶點-通路”圖Fig 9 “Core ingredient-target-pathway” diagram of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.5 分子對接驗證 利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接驗證，見表2。對接結(jié)合能均小于－20 kJ·mol－1，表明核心成分與核心靶點結(jié)合穩(wěn)定，部分對接構(gòu)象見圖10。

表2 五味清濁顆粒核心成分和核心靶點的結(jié)合能Tab 2 Binding energy of core components and core targets of Wuwei Qingzhuo granules

4 討論

腹瀉是一種臨床常見的消化道疾病，主要表現(xiàn)為排便次數(shù)增加和大便流動性增加[17]。腹瀉會導(dǎo)致機(jī)體丟失大量體液，引起脫水和電解質(zhì)平衡紊亂，引起腹瀉的病因較多，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，可能是由于腸道吸收減少、滲透性活性電解質(zhì)分泌增加、胃腸道快速轉(zhuǎn)運引起的[18-19]。五味清濁顆粒是蒙醫(yī)臨床治療腹瀉的經(jīng)驗方，本文以其作為研究對象，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討治療腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出6個核心成分，分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。相關(guān)藥理研究表明，槲皮素、山柰酚可抑制腸道運動，降低腹腔毛細(xì)血管的通透性、抑制腸內(nèi)水分和電解質(zhì)的分泌以及修復(fù)上皮黏膜治療腹瀉[20-21]，鞣花酸對腸道上皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)容物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，防止腸道中的致病菌在腸道上皮細(xì)胞中定植[22]。木犀草素具有抗炎作用，在調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和治療慢性炎癥性腸病中發(fā)揮重要作用，可以減少小腸內(nèi)容物的體積和重量，從而發(fā)揮止瀉作用[23]。胡椒堿、蓽茇寧具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多重藥理功效，在止瀉和調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)起著重要作用[22-23]。

五味清濁顆粒治療腹瀉共51個相關(guān)靶點，根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果最終篩選出6個核心靶點，主要包括IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8等，體現(xiàn)中藥治療疾病的多靶點特點。其中IL-6作為關(guān)鍵促炎因子[24]，通過刺激趨化因子的產(chǎn)生并激活腸道黏膜局部免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸道動力改變以及腸道敏感度增高，炎癥細(xì)胞也隨之增多，激活腸道免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道通透性的增高，進(jìn)而引起腹痛、腹瀉[19]。動物實驗表明，TNF-α抗體或基因的缺失可有效減輕炎癥性腸病[25]。EGFR通過與其受體結(jié)合激活多個信號通路來刺激上皮細(xì)胞的生長、增殖和分化，在調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能方面發(fā)揮重要作用[21]。IFNG在免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量的IFNG，其能誘導(dǎo)NF-κB等炎癥因子釋放[26]。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，51個交集靶點顯著富集于PI3KAkt、JAK-STAT、HIF-1信號通路等關(guān)鍵信號通路。JAK-STAT信號通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，可通過調(diào)控其來抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕腸黏膜損傷。HIF-1為腸道炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，腹瀉會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)并會造成機(jī)體局部缺氧，使得HIF-1信號通路激活[19]，可通過抑制其激活，減輕腸道炎癥反應(yīng)。PI3K-Akt信號通路與腹瀉的發(fā)生最為密切，可通過抑制其活化，促進(jìn)細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡，降低促炎癥因子 IL-6釋放，減輕腸道炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)腸道黏膜的作用[22，27]。分子對接結(jié)果顯示，核心成分與核心靶點間均具有良好的結(jié)合性能。

綜上，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)充分表明五味清濁顆?？赏ㄟ^多成分、多靶點、多途徑協(xié)同發(fā)揮治療腹瀉作用，可為后期五味清濁顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。