薔薇紅景天總黃酮提取物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其活性部位篩選

劉忠毅，王啟文，阿孜古麗·阿里木，王曉梅，胡君萍，王新玲（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

薔薇紅景天（RhodiolaroseaL.）為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola）多年生草本植物，是新疆的重要植物資源之一，據(jù)《新疆藥用植物志》記載[1]，其主要分布于新疆天山山脈1600～2700米的高寒地區(qū)，藥用部位主要為根及根莖，具有清肺止咳、止血、止帶等功效，也用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥[2]。近年研究表明薔薇紅景天還具有強(qiáng)壯機(jī)體、抗腦缺氧、抗疲勞、增強(qiáng)記憶、延緩衰老等作用[3]。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種多發(fā)于老年人的由多種因素引起的中樞神經(jīng)退行性疾病，臨床癥狀主要為患者記憶力喪失、認(rèn)知功能障礙等，嚴(yán)重影響著老年人的身心健康，也加重了國(guó)家醫(yī)療體系負(fù)擔(dān)[4]。目前臨床治療以緩解癥狀為主，減輕或阻止疾病的進(jìn)程并不理想。中藥在治療AD方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，也是藥物研發(fā)的重要來(lái)源?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)以及增強(qiáng)認(rèn)知功能等方面的作用[5-6]，可從多靶點(diǎn)改善AD模型動(dòng)物的認(rèn)知功能障礙，減輕AD樣病理癥狀，抑制AD的病理進(jìn)程[7]。課題組前期從新疆薔薇紅景天中得到了山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷及其苷元山柰酚、5，7，3'，5'-四羥基二氫黃酮及草質(zhì)素-7-O-α-L-鼠李糖苷等黃酮類(lèi)化合物[8]，并對(duì)總黃酮進(jìn)行了提取和純化工藝研究，得到的提取物和純化物的總黃酮含量分別為56.97%和82.83%[9]，藥理作用結(jié)果表明，其總黃酮提取物具有較好的抗炎和對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，且安全無(wú)毒[10]。鑒于前期所選純化工藝存在流速慢而耗時(shí)、收率低而不利于工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)，故本研究以薔薇紅景天總黃酮提取物（total flavonoids extract，TFE）為研究對(duì)象，經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離，得不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫物；測(cè)定不同洗脫物總黃酮含量同時(shí)，利用Aβ25-35誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞構(gòu)建AD炎癥細(xì)胞模型，通過(guò)觀察PC12細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)PC12細(xì)胞活力及細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的水平，探究不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫物對(duì)β-淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，篩選活性部位并闡明其中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用新疆薔薇紅景天提供理論依據(jù)。

1 材料

薔薇紅景天購(gòu)于新疆伊犁，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院叢媛媛教授鑒定為景天科紅景天屬植物薔薇紅景天（RhodiolaroseaL.）的干燥根莖，標(biāo)本保存于新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室。薔薇紅景天總黃酮提取物（TFE，總黃酮含量56.97%）由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室自制[9]。

胎牛血清（VivaCell，批號(hào)：2148389）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Servicebio，貨號(hào)：G4511-500 mL）；磷酸緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶消化液、青霉素＋鏈霉素（VivaCell公司）；Aβ25-35（美國(guó)Sigma公司，HPLC≥97%，批號(hào)：A4559-1MG）；MTT（德國(guó)Biofroxx公司）；BCA總蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，批號(hào)：20220311）；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20220706、20220705）；IL-6、TNF-α、COX-2、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為JL13202、JL20896、JL20884、JL21044）；鹽酸多奈哌齊片（植恩生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：H20010723）；蘆?。兌龋?8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0080-9705）；PC12細(xì)胞（高分化，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，武漢普賽諾生命科技有限公司）。

UV2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平（Mettler Toledo公司），Heracell型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）；KS12型超凈工作臺(tái)、KS12型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社）；W-HL828型－80℃超低溫冰箱（中科美菱）；01562型熒光倒置顯微鏡（上海蔡司光學(xué)儀器）；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物母液的制備 稱(chēng)取薔薇紅景天TFE適量，采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱色譜法分離，分別經(jīng)3倍柱體積的蒸餾水及20%、40%、60%、80%及95%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，得不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，得干浸膏，計(jì)算收率。分別記為T(mén)FE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%。精密稱(chēng)取不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物干浸膏10 mg，用70%乙醇溶解，定容于10 mL量瓶中，搖勻，即得1.0 mg·mL－1各洗脫物樣品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 總黃酮含量測(cè)定方法 參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]并對(duì)測(cè)定方法略加優(yōu)化。在全波長(zhǎng)掃描所確定的508 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A），以蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程A＝11.631X＋0.008，r＝0.9999，線(xiàn)性范圍為0.016～0.080 mg·mL－1。

2.1.3 蘆丁對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品8.0 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.16 mg·mL－1蘆丁對(duì)照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4% NaOH溶液4.0 mL，70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min；以70%乙醇溶劑為空白。

2.1.5 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物中總黃酮含量的測(cè)定 分別精密量取適量TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物母液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量。

2.2 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 PC12細(xì)胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清和青霉素100 U·mL－1＋鏈霉素100 U·mL－1的DMEM高糖培養(yǎng)基中37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d傳代1次，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

PC12細(xì)胞損傷模型采用20 μmol·L－1Aβ25-35建立。分組如下：陰性組（只加完全培養(yǎng)液）、空白組（含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液）、模型組（20μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-0%組（TFE-0%＋20μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-20%組（TFE-20%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-40%組（TFE-40%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-60%組（TFE-60%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-80%組（TFE-80%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-95%組（TFE-95%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、鹽酸多奈哌齊組（鹽酸多奈哌齊＋20 μmol·L－1Aβ25-35）。

2.2.2 溶液配制

① Aβ25-35溶液：將1 mg Aβ25-35溶解于940μL PBS溶液中，放入37℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使其老化形成凝聚態(tài)，再分裝成每支100 μL放入－20℃冰箱保存，使用前取出，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

② 藥物溶液：TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物（TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%）與鹽酸多奈哌齊用二甲基亞砜（DMSO）溶解，加入完全培養(yǎng)基使DMSO終濃度為0.1% mmol·L－1，4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用完全培養(yǎng)基對(duì)藥物溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)玫剿璧臐舛取?/p>

2.2.3 MTT法檢測(cè)TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)PC12細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行消化，加入DMEM完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，將濃度稀釋至5×104個(gè)·mL－1，接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，各組分別加入TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%及鹽酸多奈哌齊不同濃度與PC12細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞存活率確定藥物的安全濃度。

2.2.4 MTT法檢測(cè)TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 將PC12細(xì)胞按5×104個(gè)·mL－1接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組，除空白組和模型組外，其他各組分別加入TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%及鹽酸多奈哌齊進(jìn)行干預(yù)4 h，再加入20μmol·L－1Aβ25-35共同培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將PC12細(xì)胞按5×104個(gè)·mL－1接種于12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法分組給藥，共同培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并記錄。

2.2.6 PC12細(xì)胞中LDH漏出量和SOD水平的測(cè)定 細(xì)胞以每孔1 mL的體積接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去上清液。按照“2.2.1”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組均每孔給藥500 μL，空白組加無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后，每孔加入500 μL 40 μmol·L－1Aβ25-35損傷（終濃度為20 μmol·L－1），共同培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)在450 nm處測(cè)定吸光度值OD，按下列公式計(jì)算各組LDH漏出量和SOD活力。

LDH漏出量（IU·L－1）＝（OD測(cè)定孔－OD對(duì)照孔）/（OD標(biāo)準(zhǔn)孔－OD空白孔）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 μmol·mL－1）×1000

SOD活力（U·mgprot－1）＝SOD抑制率/50%×稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白濃度

2.2.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的分泌量 按照“2.2.6”項(xiàng)下方法干預(yù)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心并收集上清液，嚴(yán)格按照IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。450 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，然后計(jì)算細(xì)胞炎癥因子IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6的分泌水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物中總黃酮的含量

計(jì)算TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物浸膏得率，賦予浸膏得率0.3權(quán)重，再根據(jù)“2.1.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算不同洗脫物中總黃酮濃度，賦予總黃酮濃度0.7權(quán)重，以總得分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得分越高，表明該洗脫物越優(yōu)。結(jié)果見(jiàn)表1，TFE-40%洗脫物總黃酮濃度可達(dá)91.12%，浸膏得率為23.17%，總得分為70.74，高于其他體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫物。

表1 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物浸膏得率及總黃酮含量及其得分(n＝3)Tab 1 Extract yield and total flavonoid content of TFE different volume fractions ethanol elution and their scores (n＝3)

2.4.2 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，與空白組相比，鹽酸多奈哌齊在50 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TFE-40%、TFE-60%及TFE-95%在800 μg·mL－1時(shí)，PC12細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；TFE-0%、TFE-20%及TFE-80%組在800 μg·mL－1時(shí)細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TFE各洗脫物在給藥劑量為400 μg·mL－1時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響較小，均未表現(xiàn)出明顯毒性，見(jiàn)表2。為保持單一變量，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均選擇400 μg·mL－1為T(mén)FE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物的給藥濃度。

表2 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on the survival rate of PC12 cells (±s，n＝3)

表2 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on the survival rate of PC12 cells (±s，n＝3)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量細(xì)胞存活率/%空白組－100鹽酸多奈哌齊組12.5 μmol·L－1115.99±7.18*25 μmol·L－1119.10±5.04**50 μmol·L－1106.10±8.87 TFE-0%組200 μg·mL－1118.41±7.66**400 μg·mL－1117.11±4.57*800 μg·mL－1105.65±9.54 TFE-20%組200 μg·mL－1107.54±3.92 400 μg·mL－1101.30±5.75 800 μg·mL－1 95.65±6.90 TFE-40%組200 μg·mL－1100.21±3.13 400 μg·mL－1 90.72±10.01 800 μg·mL－1 76.09±5.01*TFE-60%組200 μg·mL－1106.13±5.68 400 μg·mL－1102.96±4.58 800 μg·mL－1 85.51±3.62**TFE-80%組200 μg·mL－1133.04±4.94**400 μg·mL－1129.86±5.90**800 μg·mL－1 99.57±3.01 TFE-95%組200 μg·mL－1137.97±1.33**400 μg·mL－1136.81±2.96**800 μg·mL－1 78.12±4.65**

2.4.3 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響 表3結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，400 μg·mL－1的TFE-0%與TFE-20%組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%與鹽酸多奈哌齊組細(xì)胞存活率均明顯上升（P＜0.01）。

表3 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 3 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on Aβ25-35 induced PC12 cell viability (±s，n＝3)

表3 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 3 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on Aβ25-35 induced PC12 cell viability (±s，n＝3)

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量細(xì)胞存活率/%LDH漏出量/（U·L－1）SOD水平/（U·mgprot－1）空白組－100160.42±13.01336.08±3.04模型組 20 μmol·L－169.75±1.96##333.33±15.73##227.32±28.35##TFE-0%組400 μg·mL－169.43±2.56289.58±19.09*258.09±32.04*TFE-20%組400 μg·mL－172.80±2.34279.17±25.26**275.80±2.02**TFE-40%組400 μg·mL－181.16±0.88**233.33±21.95**296.97±8.50**TFE-60%組400 μg·mL－180.49±3.88**222.92±21.95**287.59±1.23**TFE-80%組400 μg·mL－176.22±0.97**243.75±10.83**284.64±8.67**TFE-95%組400 μg·mL－176.26±0.75**247.92±23.66**309.29±7.25**鹽酸多奈哌齊組 50 μmol·L－175.63±3.08**220.83±19.09**321.88±9.27**

2.4.4 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH漏出量和SOD水平的影響 與空白組相比，模型組LDH漏出量明顯升高（P＜0.01），SOD水平明顯下降（P＜0.01），說(shuō)明Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞有一定程度的損傷。與模型組相比，TEF-0%組SOD水平明顯上升，LDH漏出量明顯下降（P＜0.05），TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%組及鹽酸多奈哌齊組的SOD水平明顯升高（P＜0.01），LDH漏出量明顯下降（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 由圖1可知，空白組PC12細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，多呈梭形結(jié)構(gòu)，有多個(gè)突觸。模型組細(xì)胞經(jīng)20 μmol·L－1Aβ25-35誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯損傷，細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞數(shù)目減少，且突觸明顯減少。與模型組相比，TFE-0%組、TFE-20%組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，但細(xì)胞碎片增加，細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)明顯損傷；TFE-40%組、TFE-60%組和鹽酸多奈哌齊組細(xì)胞形態(tài)均有一定程度改善，細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞突觸增加，且細(xì)胞形態(tài)較為完整；TFE-80%與TFE-95%組的細(xì)胞突觸變長(zhǎng)，但細(xì)胞碎片、間隙無(wú)明顯改善。說(shuō)明TFE-40%組、TFE-60%組和鹽酸多奈哌齊組對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)均有一定程度的保護(hù)作用。

圖1 倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)變化（×100）Fig 1 Morphological changes of PC12 cells under inverted microscope（×100）

2.4.6 TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6水平的影響 與空白組相比，模型組中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量均明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比，TEF-0%與TEF-20%組對(duì)細(xì)胞中COX-2、TNF-α和IL-6的分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TEF-20%組中細(xì)胞IL-6的分泌量明顯下降（P＜0.05）；TFE-40%組、TFE-60%組、TFE-80%組、TFE-95%組及鹽酸多奈哌齊組使細(xì)胞中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6的分泌量均明顯下降（P＜0.05），且TFE-40%組對(duì)IL-1β和TNF-α的影響強(qiáng)于其他給藥組，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量(±s，n＝3)Tab 4 Secretion of IL-1β，COX-2，TNF-α and IL-6 in the supernatant of PC12 cells (±s，n＝3)

表4 PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量(±s，n＝3)Tab 4 Secretion of IL-1β，COX-2，TNF-α and IL-6 in the supernatant of PC12 cells (±s，n＝3)

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量IL-1β/（pg·mL－1）COX-2/（ng·mL－1）TNF-α/（pg·mL－1）IL-6/（pg·mL－1）空白組－ 27.82±2.17 0.99±0.13 23.59±1.98 40.15±3.46模型組 20 μmol·L－1 50.26±4.51## 3.23±0.25## 58.72±7.62## 79.19±1.69##TFE-0%組400 μg·mL－1 46.40±4.12 3.24±0.14 58.99±4.27 72.95±1.65 TFE-20%組400 μg·mL－1 44.52±3.31* 2.82±0.16 54.16±1.05 70.81±3.37 TFE-40%組400 μg·mL－1 33.96±2.37** 2.34±0.08** 39.21±1.86** 62.58±1.76**TFE-60%組400 μg·mL－1 35.01±2.34** 2.21±0.18** 41.56±2.09** 61.16±1.71**TFE-80%組400 μg·mL－1 38.73±2.21** 2.67±0.09* 44.23±1.65** 63.41±1.93**TFE-95%組400 μg·mL－1 38.01±1.85** 2.56±0.26** 40.84±3.81** 60.86±2.26**鹽酸多奈哌齊組 50 μmol·L－1 32.86±1.63** 2.06±0.11** 35.67±2.51** 56.36±1.37**

3 討論

在正常生理情況下，Aβ淀粉中的蛋白堆積量與其水解時(shí)間基本是趨于一致的；但病理?xiàng)l件下，Aβ蛋白質(zhì)的分解數(shù)量會(huì)增加，水解次數(shù)減少，過(guò)量降解產(chǎn)生的Aβ蛋白易凝結(jié)形成一個(gè)寡聚體，寡聚體間的過(guò)度聚集會(huì)形成一種難溶性的淀粉斑塊，并沉積在大腦皮層；高濃度的Aβ淀粉聚集具有神經(jīng)毒性，會(huì)導(dǎo)致全身各種特異性免疫的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)毒性級(jí)聯(lián)排斥反應(yīng)以及大量神經(jīng)元細(xì)胞壞死、變性甚至死亡，最終導(dǎo)致AD的形成[12-13]。目前臨床上可用于治療AD的藥物較少，目前有單克隆抗體（阿杜那單抗與侖卡那單抗）和典型的小分子化合物如多奈哌齊、美金剛和卡巴拉汀外，還有來(lái)源于天然植物的EGb 761和GV-971，EGb 761是銀杏葉的標(biāo)準(zhǔn)化提取物，其主要活性成分為類(lèi)黃酮和銀杏內(nèi)酯[14]。天然黃酮化合物是一類(lèi)具有廣泛活性的成分，可經(jīng)腸道吸收，穿過(guò)血腦屏障，通過(guò)抑制腦組織炎癥因子的表達(dá)和分泌、減輕氧化應(yīng)激造成的損傷、抑制神經(jīng)元凋亡、降低膽堿酯酶活性、減少Aβ聚集和形成而改善與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙[15]。因此黃酮類(lèi)化合物已成為一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑，有望開(kāi)發(fā)成為抗AD的藥物[16]。

本研究通過(guò)考察薔薇紅景天TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物總黃酮含量、浸膏得率、對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞的存活率、細(xì)胞形態(tài)及拮抗炎癥因子的能力，發(fā)現(xiàn)TFE-40%組總黃酮濃度（91.12%）和浸膏得率（23.17%）的綜合評(píng)分高于其他各組；20 μmol·L－1Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞形態(tài)明顯受損，當(dāng)薔薇紅景天TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)TFE-40%組與TFE-60%組中細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善，細(xì)胞存活率明顯上升。

SOD屬于抗氧化酶類(lèi)，通過(guò)清除自由基及減少過(guò)氧化物的生成而發(fā)揮抗氧化損傷的作用，其水平高低可間接反映自由基含量的高低；當(dāng)PC12細(xì)胞受到具有神經(jīng)毒性的Aβ蛋白損傷后，細(xì)胞膜通透性增加而致LDH從細(xì)胞質(zhì)中溢出，反映出細(xì)胞受損的程度。本研究結(jié)果顯示20 μmol·L－1Aβ25-35誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞的存活率和SOD水平均顯著下降，LDH漏出量顯著升高，而薔薇紅景天TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物干預(yù)后，可不同程度地提高PC12細(xì)胞存活率和SOD水平，降低LDH漏出量；提示薔薇紅景天TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)PC12細(xì)胞生成SOD而清除氧自由基，通過(guò)降低LDH漏出量而維持細(xì)胞膜的完整性，其中TFE-40%洗脫物組的作用強(qiáng)于其他各洗脫物組。

PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能與神經(jīng)元細(xì)胞相似，因此，在AD的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷研究中，通常選擇Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型[17-18]。有研究表明，Aβ引起的NLRP3炎癥小體激活是AD患者和APP/PS1小鼠疾病進(jìn)展中炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵過(guò)程[19]，過(guò)量堆積的Aβ蛋白斑塊會(huì)激活NLRP3炎癥小體分泌各種促炎癥分子，如IL-1、IL-6、TNF-α、自由基和趨化因子等而損傷神經(jīng)元[20]。已有研究證實(shí)在AD患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2等炎癥因子的水平高于正常人[21]，Aβ25-35誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和突觸損失，COX-2通過(guò)炎癥信號(hào)、生長(zhǎng)因子、缺氧等誘導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[22]，進(jìn)而會(huì)加速Aβ的沉積和AD的進(jìn)展[23]。本研究顯示，20 μmol·L－1Aβ25-35誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞后，刺激TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2等炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)一步誘發(fā)加重炎癥反應(yīng)，細(xì)胞存活率下降，形態(tài)發(fā)生變化，突觸減少。薔薇紅景天TFE不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物中，除TFE-0%組和TFE-20%組外，其他各洗脫物組均能明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2的水平，拮抗Aβ25-35誘發(fā)的炎性神經(jīng)毒性，降低細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率；且發(fā)現(xiàn)TFE-40%組抑制TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2的釋放能力強(qiáng)于其他各洗脫物組。

綜上所述，總黃酮濃度最高的薔薇紅景天TFE-40%可通過(guò)促進(jìn)清除Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞中的氧自由基，維持細(xì)胞膜的完整性，拮抗Aβ25-35誘發(fā)的炎性神經(jīng)毒性，抑制細(xì)胞凋亡而起到保護(hù)損傷細(xì)胞的作用，TFE-40%中總黃酮含量可達(dá)91.12%，提示TFE-40%是以總黃酮為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的具有保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞作用的活性部位，結(jié)合本課題組前期研究基礎(chǔ)和洗脫溶劑極性大小推測(cè)，TFE-40%中主要為極性大的游離黃酮類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)及其苷類(lèi)成分。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)TFE-40%在保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞作用機(jī)制及其活性成分方面進(jìn)行深入研究，為開(kāi)發(fā)薔薇紅景天在抗AD方面提供理論依據(jù)。