連翹種子品質(zhì)檢驗(yàn)及質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究

鄒晨鑫，彭毅丹，劉亦欣，譚啟怡，顏永剛，孫靜，楊新杰（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

連翹Forsythiasuspensa（Thunb.）Vahl.為木犀科連翹屬落葉灌木，早春先花植物，具觀賞價(jià)值，為重要的園林綠化植物[1]。在中醫(yī)臨床中以其干燥果實(shí)作為藥用，通常在果實(shí)剛成熟還帶有綠色時(shí)進(jìn)行采收，通過(guò)蒸熟或者沸水煮片刻后曬干，將其稱為“青翹”，在果實(shí)成熟后采收曬干，稱之為“老翹”。連翹始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，其性味苦、微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、散結(jié)消腫、疏散風(fēng)熱等功效，主治癰疬，風(fēng)熱感冒，溫病初起，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋澀痛等病癥[3]，用途較廣。連翹果實(shí)中含黃酮類、苯乙烷類、揮發(fā)油類等成分[4]?，F(xiàn)代研究表明，連翹具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、抗氧化、解熱[8]、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤[9-10]、調(diào)節(jié)免疫[10]等作用。

連翹的藥材商品主要來(lái)源于野生資源，被列為國(guó)家計(jì)劃管理品種[11]。近年來(lái)隨著連翹的觀賞和藥用價(jià)值的不斷被開(kāi)發(fā)利用，野生資源的保有量難以滿足市場(chǎng)需求，尋求人工播種育苗為最簡(jiǎn)單有效的途徑之一[12]?？茖W(xué)的種植栽培是確保藥材品質(zhì)的一個(gè)重要措施，優(yōu)質(zhì)的種子是進(jìn)行連翹種植栽培的重要保證，這也是對(duì)連翹種子做質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)的重要原因。制訂出連翹種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以為連翹種子的篩選和使用提供參考價(jià)值。

有文獻(xiàn)對(duì)連翹種子品質(zhì)進(jìn)行過(guò)相關(guān)的研究，但所收集的連翹種子范圍較小，制訂的標(biāo)準(zhǔn)較低[13-14]。此次研究過(guò)程中擴(kuò)大了連翹種子的范圍，采集16份來(lái)自全國(guó)連翹主產(chǎn)區(qū)的連翹種子，評(píng)價(jià)連翹種子品質(zhì)，進(jìn)行種子的質(zhì)量分級(jí)研究，以期為連翹種子品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考依據(jù)。

本研究主要對(duì)種子形態(tài)色澤、千粒重、含水量、生活力、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)進(jìn)行測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用到的方法有四分法測(cè)量?jī)舳?、徒手減半法測(cè)量千粒重、TTC法測(cè)定種子生活力、高溫烘干法測(cè)定含水量以及水培法測(cè)定種子發(fā)芽率。以上實(shí)驗(yàn)方法在種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂中較為經(jīng)典，被廣泛用于種子相關(guān)實(shí)驗(yàn)，具有科學(xué)性。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)運(yùn)用K-均值聚類法和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，K-均值聚類法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)大型數(shù)據(jù)集也是簡(jiǎn)單高效，時(shí)間復(fù)雜度、空間復(fù)雜度低。最終參考綜合影響因素和實(shí)際情況在所得數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行連翹種子的質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制訂。

1 材料與方法

1.1 儀器

FA2104萬(wàn)分之一電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；MGC-300H人工氣候培養(yǎng)箱、DHG-9030電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC，含量≥98%，福州飛凈生物科技有限公司）。于2020年9月下旬選擇陜西、山西、河北、河南、山東等五省種植基地對(duì)連翹種子進(jìn)行收集，用于質(zhì)量檢驗(yàn)方法評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。種子編號(hào)和具體產(chǎn)地見(jiàn)表1。所有的種子都通過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，均為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.的種子。

表1 連翹種子來(lái)源Tab 1 Source of Forsythia suspensa seeds

1.3 方法

1.3.1 凈度分析 參照GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦取樣品，采用四分法[15]。取種子近5 g，置于桌面上分離凈種子。使用電子天平進(jìn)行精密稱重，并且計(jì)算凈種子含量的百分比，所有樣品重復(fù)稱量3次，最終取其平均值。凈度公式如式（1）所示。

1.3.2 千粒重的測(cè)定 將凈種子混合均勻，采用徒手減半法[16-17]從樣本中取250粒取4份，共1000粒為1組，用分析天平稱重，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 含水量的測(cè)定 采用高溫烘干法[18]，稱取0.5 g種子放入干燥培養(yǎng)皿中，放置在溫度達(dá)（131±2）℃的恒溫烘箱內(nèi)烘1 h后取出放入干燥器內(nèi)冷卻后稱重。計(jì)算種子含水量，公式如式（2）所示。

式中M1為培養(yǎng)皿質(zhì)量，M2為培養(yǎng)皿及樣品烘干前質(zhì)量，M3為培養(yǎng)皿及樣品烘干后質(zhì)量。

1.3.4 生活力的測(cè)定 采用TTC法測(cè)定[19]連翹種子的生活力，活的種子具有一定的呼吸作用，而呼吸作用產(chǎn)生的脫氫酶可使無(wú)色的氧化態(tài)TTC還原成紅色物質(zhì)，該方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確率高，是測(cè)定種子生活力的常用方法。使用0.5%的TTC溶液對(duì)連翹種子進(jìn)行染色，拿刀片將種子縱切成兩瓣取其中一瓣于常溫染色12 h后倒出TTC溶液并使用清水沖洗種子，觀察種子染色情況，若種子大部分或者全部被染紅說(shuō)明種子有生活力。

1.3.5 發(fā)芽率測(cè)定 從收集的連翹果實(shí)中收取種子，置于干燥處貯藏。把樣品種子置于培養(yǎng)皿中并加自來(lái)水浸泡2 h，取沉于水中的飽滿種子，使用1%高錳酸鉀溶液消毒30 min，最后使用自來(lái)水、蒸餾水依次沖洗備用。將培養(yǎng)皿、鑷子以及濾紙放入高壓滅菌鍋中滅菌，在培養(yǎng)皿的底部放2層劃有網(wǎng)格線的濕濾紙作為發(fā)芽基質(zhì)，將處理好的連翹種子放入培養(yǎng)基中，用滴管定期補(bǔ)清水，使種子保持濕潤(rùn)狀態(tài)，連翹種子以胚根露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[18]。

每個(gè)培養(yǎng)皿（d＝90 mm）放入50粒種子，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，均在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中溫度為25℃，濕度為60%，光照強(qiáng)度均為12 000 lx[14]。記錄種子發(fā)芽情況，觀察14 d后，統(tǒng)計(jì)種子的總發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，公式如式（3）所示。發(fā)芽勢(shì)是發(fā)芽期間日發(fā)芽數(shù)達(dá)到最大值，發(fā)芽的種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率。

1.3.6 種子基本特征鑒定 將健康飽滿的種子置于桌面上，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量30粒種子的長(zhǎng)和寬，并觀察種子顏色、形態(tài)及表面特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子凈度

從表2、3可以看出不同地區(qū)的連翹種子凈度差異較大，分布在31.86%～94.60%，平均值為60.47%。由此可知，不同地區(qū)連翹種子的凈度差別較大，含果皮、果梗、短枝、石子等雜質(zhì)，其中河北省保定市安國(guó)市河西村（Z10）的連翹種子凈度最高，陜西省商洛市洛南縣靈口鎮(zhèn)（Z3）的連翹種子凈度最低。主要原因是不同產(chǎn)地對(duì)連翹種子采集加工處理的方式不同，有些產(chǎn)地種子加工處理較為粗糙，導(dǎo)致種子凈度過(guò)低。

表2 連翹種子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果分析Tab 2 Quality analysis of Forsythia suspensa seeds

表3 16批連翹種子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Tab 3 Quality of 16 batches of Forsythia suspensa seeds

2.2 千粒重

來(lái)自全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的16份連翹種子的千粒重在2.12～3.81 g，平均值為2.88 g。其中千粒重最小的是來(lái)自陜西延安市黃龍縣（Z14）的種子，河南洛寧縣（Z13）的種子的千粒重最大（見(jiàn)表2、3）。

2.3 含水量

來(lái)自全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的16份連翹種子的含水量在2.72%～8.45%，平均含水量為4.82%。其中含水量最低為2.72%，來(lái)自河南省洛陽(yáng)市嵩縣（Z12），河北省邯鄲市涉縣（Z11）的含水量最高為8.45%（見(jiàn)表2、3）。

2.4 種子活力

來(lái)自全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的連翹種子之間的生活力有很大的區(qū)別，本次實(shí)驗(yàn)16份連翹種子的生活力在23.33%～90.67%，平均生活力為55.54%。其中生活力最低的為陜西省寶雞市眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)（Z15）的種子，最高的為河北省保定市安國(guó)市河西村（Z10）的種子。生活力測(cè)定結(jié)果區(qū)別較大的原因主要與實(shí)驗(yàn)所選用的染色方法、染色時(shí)間、染色溫度以及染色試劑的濃度等有關(guān)[16]，故本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定各產(chǎn)地連翹種子生活力時(shí)，統(tǒng)一測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，減少誤差（見(jiàn)表2、3）。

2.5 發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)

來(lái)自全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的16份連翹種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)之間有著很大的區(qū)別，發(fā)芽率變化范圍為0～92.00%，發(fā)芽勢(shì)的變化范圍是0～36.00%。其中最高的為河北省保定市安國(guó)市河西村（Z10）的種子發(fā)芽率高達(dá)92.00%；陜西省商洛市洛南縣石門鎮(zhèn)、陜西省商洛市山陽(yáng)縣色河鋪鎮(zhèn)、陜西省商洛市商南縣湘河鎮(zhèn)、河南省洛陽(yáng)市嵩縣白云山、河南省洛寧縣神靈寨和陜西省寶雞市眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)的種子發(fā)芽率均未達(dá)10.00%，其中陜西寶雞市眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)（Z15）的種子發(fā)芽率為0，為16份樣本中最低。河北省保定市安國(guó)市河西村（Z10）的種子發(fā)芽勢(shì)最高達(dá)36.00%，陜西省寶雞市眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)（Z15）的種子發(fā)芽勢(shì)最低為0。通過(guò)對(duì)產(chǎn)地分析的比較可以發(fā)現(xiàn)，各個(gè)連翹產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境和氣候環(huán)境都有所差異，會(huì)導(dǎo)致連翹種子的成分和水分的含量不同，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)河北省的連翹種子的發(fā)芽率普遍高于其他省份。

2.6 種子基本特征鑒定

連翹種子扁平，橢圓形，一側(cè)具薄翅，且翅不規(guī)則，使連翹一端呈三角形，一端呈半圓形；成熟種子黃棕色或黑褐色，飽滿，氣微香，質(zhì)堅(jiān)脆；種子長(zhǎng)5.14～6.36 mm，寬1.56～2.34 mm。

2.7 種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制訂

2.7.1 K-均值聚類分析 通過(guò)SPSS 20.0軟件以及Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析對(duì)連翹種子的五項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行K-均值聚類分析并分為三級(jí)，最終類中心值見(jiàn)表4。16份連翹種子中1級(jí)有1個(gè)（Z10），2級(jí)有9個(gè)（Z2、Z5、Z7、Z12、Z13、Z14、Z15），3級(jí)有5個(gè)（Z1、Z3、Z4、Z6、Z8、Z9、Z11），具體見(jiàn)圖1和表4。

圖1 連翹種子聚類分析樹(shù)狀關(guān)系圖Fig 1 Forsythia suspensa seeds cluster analysis

表4 K-均值聚類最終類中心(n＝16)Tab 4 K-mean cluster final class center (n＝16)

2.7.2 種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制訂 通過(guò)K-均值聚類分析，初步將所測(cè)得的種子分為三類，根據(jù)分析數(shù)據(jù)最后確定在連翹種子的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程中，把發(fā)芽率和生活力作為一級(jí)參數(shù)，因?yàn)榉N子是否具有活性和發(fā)芽率直接關(guān)系到連翹的產(chǎn)量，將種子的凈度、含水量以及千粒重作為二級(jí)參數(shù)。研究其他影響因素和K-均值聚類分析，并參考實(shí)際情況，制訂出連翹種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表5），在分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中一級(jí)可作為品質(zhì)良好的種子，可在生產(chǎn)過(guò)程中優(yōu)先考慮。二級(jí)為質(zhì)量合格的種子，可在栽種生產(chǎn)中可選擇性使用。三級(jí)為未達(dá)標(biāo)的種子，不建議在種植栽培過(guò)程中使用此類種植，否則收益不佳。

表5 連翹種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab 5 Quality classification standards of Forsythia suspensa seeds

3 結(jié)論

3.1 不同產(chǎn)地連翹種子品質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果

不同產(chǎn)地的連翹種子各項(xiàng)指標(biāo)之間有較大的差異，種子形態(tài)長(zhǎng)5.14～6.36 mm，寬1.56～2.34 mm。發(fā)芽率在0～92.00%，生活力在23.33%～90.67%；平均生活力為55.54%。凈度在31.86%～94.60%，平均值為60.47%；千粒重在2.12～3.81 g，平均值為2.88 g。含水量在2.72%～8.45%，平均含水量為4.82%。河北省保定市安國(guó)市河西村連翹種子的凈度、生活力、發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)較高，陜西寶雞市眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)連翹種子的各項(xiàng)指標(biāo)值相對(duì)較低，其連翹種子的發(fā)芽率為0，可能與其種子為陳舊種子或存儲(chǔ)不當(dāng)有關(guān)。

3.2 連翹種子質(zhì)量初步分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

通過(guò)K-均值聚類分析，可將不同產(chǎn)地連翹種子初步分為三類，其中一級(jí)為品質(zhì)良好的種子，二級(jí)為質(zhì)量合格的種子，三級(jí)為未達(dá)標(biāo)的種子。通過(guò)分析可知，影響連翹種子質(zhì)量的主要因素有發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、生活力、種子凈度、千粒重、含水量。根據(jù)國(guó)際種子的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合連翹生產(chǎn)的現(xiàn)狀，綜合考慮選定發(fā)芽率、生活力、千粒重、水分、凈度作為連翹種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，初步制訂了連翹種子等級(jí)規(guī)定值。

4 討論

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同產(chǎn)地的連翹種子的質(zhì)量存在較大差異。凈度差異較大是因?yàn)榉N子中含果皮、果梗、短枝、石子等雜質(zhì)，不同產(chǎn)地的連翹種子因采收時(shí)間及加工方法不同導(dǎo)致所含雜質(zhì)有差異。千粒重和含水量的差異可能是由于不同產(chǎn)地間的氣候及生態(tài)環(huán)境不同，導(dǎo)致種子的顆粒大小以及飽滿度有較大差異。其中作為種子質(zhì)量最重要參數(shù)發(fā)芽率和生活力在不同產(chǎn)區(qū)之間也有很大的差異，這對(duì)本次試驗(yàn)的最終目的即制訂連翹種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起到主要影響。本次試驗(yàn)連翹種子的發(fā)芽率在0～92.00%；生活力在23.33%～90.67%。分析其發(fā)芽率與生活力的差異大與地理分布、氣候環(huán)境、采收時(shí)節(jié)以及貯藏過(guò)程都有著很大的關(guān)系。

在中醫(yī)藥臨床應(yīng)用中連翹以果實(shí)入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效；其藥材商品主要來(lái)源于野生資源。但是近年來(lái)隨著對(duì)連翹的不斷研究開(kāi)發(fā)，連翹的野生資源保有量難以滿足市場(chǎng)需求，所以人工栽培種植變?yōu)檫B翹藥材的主要來(lái)源之一。目前市場(chǎng)上并沒(méi)有連翹種子統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，市售連翹種子中常常出現(xiàn)以次充好、新老種子混合出售等情況，從而導(dǎo)致連翹種子質(zhì)量混亂，嚴(yán)重影響連翹藥材的種植。因此對(duì)連翹種子進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)研究尤為必要，是連翹藥材規(guī)范化生產(chǎn)亟待解決的重要問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》及有關(guān)種子分級(jí)方法要求，結(jié)合連翹種子的自身特點(diǎn)進(jìn)行連翹種子質(zhì)量的初步研究，所提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可供有關(guān)部門制訂通用標(biāo)準(zhǔn)時(shí)參考。