基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的分子機(jī)制

王藝霖，孟祥國(guó)，葉宇航，胡霞敏*（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 010；.上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 0118；.上海理工大學(xué)，上海 0009）

缺血性腦卒中，中醫(yī)稱之為中風(fēng)，是指由于腦的供血?jiǎng)用}（頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱[1]，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點(diǎn)[2]。目前臨床上被FDA認(rèn)證的治療方法只有靜脈溶栓及動(dòng)脈取栓[3]，其目的是迅速恢復(fù)缺血區(qū)的血流，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元，緩解腦組織因缺血缺氧引起的神經(jīng)功能損傷[4]，但由于治療時(shí)間窗狹窄限制了其在臨床上的應(yīng)用。

《內(nèi)經(jīng)》有對(duì)中風(fēng)病病機(jī)進(jìn)行論述：情志失調(diào)，血逆瘀于腦，是中風(fēng)病發(fā)生的根本機(jī)制[5]。桃紅四物湯（Taohong Siwu decoction，THSWD）是《醫(yī)宗金鑒》記載的經(jīng)典名方，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃六味藥材組成[6]。其在四物湯補(bǔ)血養(yǎng)血的基礎(chǔ)上，加入活血祛瘀的桃仁及活血通經(jīng)的紅花，使此方養(yǎng)血而不滯血，活血而不破血，補(bǔ)中有行，破中有收，六藥合用，達(dá)到活血行氣、扶正祛邪之功效[7]。臨床表明，桃紅四物湯對(duì)缺血性腦卒中有明顯的治療作用[8]，但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討桃紅四物湯治療腦卒中的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的分子機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供研究思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 小鼠50 只（雄性，SPF級(jí)，浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6～8周，No：20220923Abzz0619000896），飼養(yǎng)于上海健康醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，進(jìn)食進(jìn)水自由，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過上海健康醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)：20220621）。

1.2 試藥

2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，貨號(hào)：45959B），兔抗PI3K（貨號(hào)：4228S）、AKT（貨號(hào)：4060S）、白細(xì)胞介素（IL）-1β（貨號(hào)：12242S）、IL-18（貨號(hào)：57058S）（Cell Signaling Technology公司），β-actin（美國(guó) Proteintech Group 公司，貨號(hào)：81115-1-RR），HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：GB23301）。

桃紅四物湯組方：川芎8 g（批號(hào)：230513），桃仁9 g（批號(hào)：2023062101），當(dāng)歸12 g（批號(hào)：230902），熟地黃15 g（20230707），紅花9 g（批號(hào)：20230717-1），白芍10 g（批號(hào)：230717）（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院）。根據(jù)小鼠與人體表面積比值系數(shù)減壓濃縮至0.36 g·mL－1。

1.3 儀器

體視顯微鏡（日本Olympus公司），EPS-600 數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Tanon 4800 系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），多普勒激光散斑血流儀（上海瑞沃德有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 桃紅四物湯核心成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 應(yīng)用TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，以口服生物利用度≥30%，分子類藥性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲取桃紅四物湯活性成分及活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，再通過GeneCards、PharmGkb、OMIM、TTD、Drugbank 5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲取缺血性腦卒中相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，兩者取交集，將活性成分和交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)獲得9個(gè)核心化合物：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、黃芩素（baicalein）、楊梅酮（myricanone）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、常春藤皂苷（hederagenin）。交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選score＞0.95的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，獲得12個(gè)潛在核心靶點(diǎn)，分別為MAPK14、RELA、TNF、TR53、MAPK1、MYC、FOS、HSP9AA1、ESR1、AKT1、HF1A、CTNNB1。利用使用R語(yǔ)言軟件的R包“ClusterProfiler”對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，選取前8條通路，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“核心成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、分化和凋亡的重要途徑，為經(jīng)典的抗凋亡/促生殖的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，是預(yù)防缺血性腦卒中的關(guān)鍵級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，其通過調(diào)節(jié)線粒體障礙、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制在抗腦卒中中發(fā)揮重要作用[9]。由圖1可發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)AKT1、RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1涉及PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖1 “核心成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Core compound-core target-pathway network

2.1.2 GO功能富集分析 通過R包“ClusterProfiler”對(duì)交集靶點(diǎn)GO功能富集分析獲得2823個(gè)GO功能條目，主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等生物過程（BP）。交集靶點(diǎn)在BP、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）中顯著富集的前10個(gè)GO條目，見圖2。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥在缺血性腦卒中中發(fā)揮重要作用[10]。腦缺血后繼發(fā)性損傷的機(jī)制可能是由于缺血性腦卒中后腦內(nèi)炎癥的產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)加快了缺血性損傷的形成并影響神經(jīng)元死亡和神經(jīng)組織再生。提示桃紅四物湯發(fā)揮腦保護(hù)作用可能與抗炎有關(guān)。

圖2 桃紅四物湯與缺血性腦卒中疾病GO富集分析圖Fig 2 GO functional enrichment analysis of THSWD in treating ischemic stroke

2.1.3 分子對(duì)接 將鑒定篩選得到的9個(gè)潛在核心化合物作為配體，將涉及PI3K/AKT信號(hào)通路的核心靶點(diǎn)蛋白和PI3K蛋白作為受體進(jìn)行分子對(duì)接。首先，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心成分的結(jié)構(gòu)并以mol2格式保存。然后從RCSB（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)的配體結(jié)構(gòu)，使用Autodock對(duì)接每個(gè)成分和配體。結(jié)合能＜－5 kcal·mol－1的對(duì)接分?jǐn)?shù)表明該化合物與靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合活性，結(jié)合能越低，說明結(jié)合活性越好。結(jié)果表明，大部分核心成分與PI3K/AKT相關(guān)蛋白具有較好的結(jié)合能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了桃紅四物湯可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路防治缺血性腦卒中，見表1。將結(jié)合能較低的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖3。

表1 分子對(duì)接結(jié)合能Tab 1 Binding energy of molecular docking

圖3 分子對(duì)接結(jié)果可視化Fig 3 Visualization of molecular docking results

圖4 激光多普勒血流圖Fig 4 Laser Doppler flow chart

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），模型組[腦缺血再灌注損傷（MCAO/R）組]，桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組10只。于飼養(yǎng)第8日開始給藥，假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水，10 mL·kg－1灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組分別給予桃紅四物湯煎煮液0.9、1.8、3.6 g·kg－1灌胃。

2.2.2 MCAO/R模型小鼠的構(gòu)建 小鼠飼養(yǎng)第11日，除空白組外，其余各組均依據(jù)Zea-Longa線栓法[11]的操作步驟建立MCAO/R小鼠模型，采用激光多普勒血流儀分別于缺血前、缺血后5 min和再灌注后5 min監(jiān)測(cè)小鼠腦血流情況，與缺血前相比，缺血后的小鼠左腦血流明顯缺失，再灌注后大部分血流恢復(fù)，表示小鼠造模成功。空白組10 只，模型組8只，桃紅四物湯低、中、高劑量組各9 只造模成功，分別于術(shù)后24、48、72 h分別進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，評(píng)分后采用二氧化碳?xì)怏w麻醉處死，每組3只小鼠斷頭取腦，－20℃冰箱中保存，待TTC染色；每組3只小鼠同法取右側(cè)大腦組織置液氮中速凍固定，－80℃冰箱中保存，供Western blot檢測(cè)用。

2.2.3 桃紅四物湯對(duì)MCAO/R小鼠神經(jīng)功能損傷的影響 參照Z(yǔ)ea-Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和mNss法分別于缺血1.5 h再灌注24、48 和72 h對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分。Longa法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1 分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2 分，向?qū)?cè)自發(fā)性旋轉(zhuǎn)；3分，向?qū)?cè)傾倒；4 分，意識(shí)喪失。mNSS法評(píng)分項(xiàng)目包括運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、感覺實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)4項(xiàng)，評(píng)分從0～18 分，0 分為正常無(wú)缺陷，18 分為最大缺陷。結(jié)果顯示：與 Sham組相比，模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高，主要表現(xiàn)為提尾時(shí)右側(cè)前爪不能完全伸直，置于水平桌面時(shí)，向患側(cè)轉(zhuǎn)圈，偏癱等癥狀；與模型組相比，桃紅四物湯中、高劑量組能明顯減輕神經(jīng)功能障礙，見圖5。

圖5 桃紅四物湯對(duì)C57BL/6小鼠MCAO/R Longa評(píng)分和mNss評(píng)分的影響Fig 5 Effect of THSWD on Longa score and mNss score of MCAO/R mice

2.2.4 桃紅四物湯對(duì)MCAO/R小鼠腦梗死體積的影響 TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，常用來染色檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗死，可使正常腦組織染成紅色，缺血區(qū)因組織壞死呈白色。?。?0℃冰箱中腦組織迅速自視交叉點(diǎn)前后1 mm厚度冠狀面切片（約5片），置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛溶液4℃固定過夜，掃描拍照。用Image J軟件計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積（%）＝左側(cè)腦半球梗死范圍/（左側(cè)腦半球總范圍＋右側(cè)腦半球總范圍）×100%。結(jié)果顯示，與Sham組相比，模型組腦梗死體積明顯升高；與模型組相比，桃紅四物湯中、高劑量組腦梗死體積明顯減小，且高劑量組腦梗死體積減小最明顯，表明桃紅四物湯可有效減少小鼠MCAO/R后腦梗死體積，見圖6。

圖6 桃紅四物湯對(duì)小鼠腦梗死體積的影響Fig 6 Effect of THSWD on the infarct volume

2.2.5 桃紅四物湯對(duì)MCAO/R小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)的影響 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)提示桃紅四物湯可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥發(fā)揮腦保護(hù)作用。用Western blot方法對(duì)腦組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。取Sham組、MCAO/R組及藥效最為明顯的桃紅四物湯高劑量組左半腦組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取蛋白。蛋白樣本經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入PI3K、AKT、β-actin抗體，4℃孵育過夜；加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔/鼠抗體，孵育2 h，使用ECL發(fā)光系統(tǒng)顯像，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值（DPI）分析。結(jié)果顯示，與Sham組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)均降低；與模型組比較，桃紅四物湯組小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)升高（見圖7）。

2.2.6 桃紅四物湯對(duì)MCAO/R小鼠神經(jīng)炎癥的影響

基于以上分析結(jié)果，檢測(cè)了腦組織中IL-1β、IL-18炎性因子的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示（見圖8），桃紅四物湯可明顯降低小鼠促炎因子IL-1β、IL-18的水平。

圖8 桃紅四物湯對(duì)IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響Fig 8 Effect of THSWD on the expression of IL-1β and IL-18 protein

2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用 GraphPad Prism 9 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差，后用Turkey法分析兩組間差異分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用均數(shù)（mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)是由于氣血逆亂，腦脈痹阻或血溢于腦所致。因此，活血理氣是其基本治療原則。桃紅四物湯方中桃紅、紅花為主，主力活血化瘀；熟地、當(dāng)歸養(yǎng)血；白芍補(bǔ)血；川芎活血行氣，是活血化瘀的經(jīng)典名方。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步探討了桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的機(jī)制，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取到桃紅四物湯的成分43個(gè)，治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)179個(gè)，進(jìn)一步篩選獲得桃紅四物湯干預(yù)缺血性腦卒中的主要成分可能為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、黃芩素、楊梅酮、β-胡蘿卜素、常春藤皂苷，核心靶點(diǎn)可能為AKT1、

RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1、TNF、MAPK14等。槲皮素[12]、木犀草素[13]、β-谷甾醇[14]、山柰酚[15]、黃芩素[16]、豆甾醇[17]、常春藤皂苷[18]有相關(guān)抗腦卒作用的文獻(xiàn)報(bào)道，AKT1、TNF、MAPK1、MAPK14等核心靶點(diǎn)與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，這與現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯具有抗炎的藥理作用一致。

GO分析和KEGG分析富集結(jié)果顯示桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的潛在靶點(diǎn)涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程，涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路，PI3K/AKT信號(hào)通路等。本研究從以上分析中選取了PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白，并利用分子對(duì)接技術(shù)將核心成分與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)核心成分與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白具有較好的結(jié)合能力。由于炎癥反應(yīng)和PI3K/AKT信號(hào)通路在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，所以我們可以推斷桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的機(jī)制可能與激活 PI3K/AKT多條信號(hào)通路和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥有關(guān)。

在小鼠MCAO/R模型上對(duì)桃紅四物湯抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可明顯降低MCAO/R模型小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，改善神經(jīng)功能障礙；TTC染色顯示桃紅四物湯可顯著縮小腦梗死體積，表明其對(duì)缺血性腦卒中有較為顯著的防治作用。同時(shí)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果的提示，我們對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白和炎癥因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示桃紅四物湯可明顯提高PI3K、AKT的蛋白表達(dá)，降低IL-1β、IL-18的表達(dá)。以上結(jié)果表明桃紅四物湯能激活PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕神經(jīng)炎癥，發(fā)揮抗腦缺血再灌注作用。

綜上，本研究探討中醫(yī)傳統(tǒng)藥方桃紅四物湯抗腦卒中可能的作用機(jī)制。結(jié)合現(xiàn)代中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)桃紅四物湯抗腦卒中的關(guān)鍵成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行了推測(cè)，并選擇了其中較為重要的PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，提示桃紅四物湯作用機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕神經(jīng)炎癥有關(guān)，該研究結(jié)果對(duì)豐富桃紅四物湯的現(xiàn)代研究，進(jìn)一步探索桃紅四物湯防治缺血性腦卒中的作用機(jī)制提供了線索，對(duì)其二次開發(fā)具有重要意義。但本研究?jī)H對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測(cè)結(jié)果中的PI3K/AKT通路進(jìn)行了驗(yàn)證，因此要闡明桃紅四物湯抗腦卒中的作用機(jī)制仍需更深入的研究。