奧氮平對(duì)乳腺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞增殖與分化功能的影響

孟娟，李東輝，高元慧，劉梅，李建旺（?？谑腥嗣襻t(yī)院，.腫瘤內(nèi)科；2.泌尿外科；.中心實(shí)驗(yàn)室，?？?570208）

乳腺癌已成為全球女性發(fā)病率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅到女性的健康。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用產(chǎn)生的，除了生殖、遺傳、飲食、生活方式及環(huán)境因素外，精神因素也是造成乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要因素[1]。奧氮平（OLZ）作為一種能拮抗5-羥色胺（5-HT）、多巴胺、膽堿能作用的精神類藥物，不僅能穩(wěn)定精神情緒，改善抑郁狀態(tài)，提高睡眠質(zhì)量，還具有良好的止吐作用[2-3]。作為止吐藥物，奧氮平已成為美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）、歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（ESMO）指南中預(yù)防高、中度致吐風(fēng)險(xiǎn)化療藥物的標(biāo)準(zhǔn)方案，在腫瘤對(duì)癥治療中廣泛使用。然而奧氮平對(duì)于腫瘤的影響尚不明確，本研究通過奧氮平作用于體外乳腺癌細(xì)胞-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究其對(duì)巨噬細(xì)胞增殖與分化的影響，探討奧氮平在乳腺癌治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器

奧氮平（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），佛波酯（PMA，Sigma，USA），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco，USA），Transwell培養(yǎng)板（Corning，USA），CCK-8（碧云天生物技術(shù)有限公司），動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，miRNeasy Mini Handbook（德國Qiagen），HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（＋gDNA Wiper）試劑盒、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（by stem-loop）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊），CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒），酶標(biāo)儀（Thermo，USA），熒光定量PCR儀（BioRad CFX96，USA）等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞用完全培養(yǎng)基為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)，MDA-MB-231細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)。所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞生長至融合時(shí)，先用pH 7.4 PBS緩沖液漂洗一次，然后用1 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞開始變圓后，加入3 mL培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，吹吸細(xì)胞使其完全分散，再1∶3傳代培養(yǎng)或調(diào)至所需細(xì)胞密度進(jìn)行鋪板。

1.3 CCK-8法檢測共培養(yǎng)條件下THP-1的細(xì)胞增殖活性

將400 μL 1×105個(gè)·mL－1的密度的THP-1、MDA-MB-231細(xì)胞鋪進(jìn)24 Transwell培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入2 μmol·L－1和100 μmol·L－1的奧氮平，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每100 μL加入10 μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測巨噬細(xì)胞表面分子與相關(guān)炎癥因子的表達(dá)

將400 μL 1×105個(gè)·mL－1的密度的細(xì)胞鋪進(jìn)24 Transwell培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入50 μmol·L－1奧氮平和100 ng·mL－1佛波酯。不同按處理方式，分為PMA-T組：佛波酯處理的THP-1細(xì)胞；PMA-OLZ-T組：奧氮平和佛波酯共同處理的THP-1細(xì)胞；PMA-TM組：佛波酯處理的THP-1與MDA-MB-231共培養(yǎng)體系；PMA-OLZ-TM組：奧氮平和佛波酯共同處理的THP-1細(xì)胞與MDA-MB-231共培養(yǎng)體系。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集巨噬細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取使用動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒。以提取的總RNA為模板，使用HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（＋gDNA Wiper）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測各基因的表達(dá)。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃退火并延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線65℃ 5 s，95℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。利用2－ΔΔCt公式計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。miRNA引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測miRNA表達(dá)用引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR detection of miRNA expression

1.5 qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)miRNA的表達(dá)

將400 μL 1×105個(gè)·mL－1的密度的THP-1、MDA-MB-231共培養(yǎng)細(xì)胞鋪進(jìn)24 Transwell培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入50 μmol·L－1奧氮平和100 ng·mL－1佛波酯，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞miRNA提取使用miRNeasy Mini Handbook。以提取的miRNA為模板，利用Stem-loop引物，使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒（by stem-loop）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測各miRNA的表達(dá)。利用2－ΔΔCt公式計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用miRNA的Stem-loop引物、上下游引物序列見表2。

表2 qRT-PCR檢測miRNA表達(dá)用引物序列Tab 2 Primer sequences for qRT-PCR detection of miRNA expression

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次，結(jié)果用Graphpad Prism 10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧氮平在體外抑制THP-1、MDA-MB-231共培養(yǎng)條件下THP-1細(xì)胞的增殖活性

經(jīng)過不同濃度的奧氮平處理48 h后，CCK-8法檢測THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組中及其與MDA-MB-231共培養(yǎng)組（Co-THP-1）中THP-1細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示：2 μmol·L－1和100 μmol·L－1奧氮平對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用（P＜0.05），100 μmol·L－1奧氮平對(duì)Co-THP-1也有一定程度的抑制作用（P＜0.05）。兩組THP-1（Co-THP-1）的細(xì)胞活性并無明顯差異（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 不同濃度奧氮平對(duì)THP-1和Co-THP-1組中THP-1的增殖活性的影響（＊P＜0.05）Fig 1 Effect of different concentrations of olanzapine on activity of THP-1 in the THP-1-alone group and the co-culture group （＊P＜0.05）

2.2 奧氮平對(duì)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)節(jié)

與PMA-T組相比，PMA-OLZ-T組中THP-1細(xì)胞表面分子CD68顯著增加（P＜0.05）；與PMA-T組相比，PMA-TM組中THP-1細(xì)胞表面分子CD68、CD80和CD163均無明顯變化（P＞0.05）；而與PMA-TM組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1細(xì)胞中CD68、CD80、CD163的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與PMA-OLZ-T組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1細(xì)胞的CD68、CD80、CD163水平也均有不同程度升高（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 qRT-PCR法檢測各組中巨噬細(xì)胞表面分子CD68、CD80及CD163的表達(dá)（＊P＜0.05）Fig 2 Expression of THP-1 surface molecules CD68，CD80，and CD163 by qRT-PCR（＊P＜0.05）

2.3 奧氮平對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子和趨化因子表達(dá)的調(diào)控

與PMA-T組相比，PMA-OLZ-T組中THP-1的炎癥因子IL-12顯著增加（P＜0.05），其余因子的變化并不明顯；與PMA-T組相比，PMA-TM組中THP-1的炎癥因子和趨化因子均無明顯變化（P＞0.05）；與PMA-TM組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1的CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-12、TNF-α表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與PMA-OLZ-T組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1的CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、TNF-α水平也均有不同程度升高（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 qRT-PCR法檢測各組巨噬細(xì)胞炎性因子和趨化因子表達(dá)水平（＊P＜0.05）Fig 3 Expression of THP-1 surface molecules and inflammatory factors by qRT-PCR（＊P＜0.05）

2.4 奧氮平對(duì)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)miRNA分子表達(dá)的調(diào)控

奧氮平處理THP-1細(xì)胞72 h的結(jié)果顯示，THP-1組中，奧氮平僅對(duì)miR155和Let7c的表達(dá)有明顯影響（P＜0.05），對(duì)miR146、miR9和miR34a的影響并不明顯。但在佛波酯誘導(dǎo)THP-1分化的情況下，與Co-THP-1組巨噬細(xì)胞極化相關(guān)miRNA分子miR34a和Let7c出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 qRT-PCR法檢測各組巨噬細(xì)胞極化相關(guān)miRNA分子的表達(dá)（*P＜0.05）Fig 4 Expression of macrophage differentiation-associated miRNAs by qRT-PCR（*P＜0.05）

3 討論

藥物治療是乳腺癌治療的關(guān)鍵，但新藥的研發(fā)成本巨大，而藥物再利用與新藥開發(fā)相比，可大幅縮短藥物的研發(fā)時(shí)間、成本和風(fēng)險(xiǎn)，奧氮平作為一種經(jīng)濟(jì)、安全有效的藥物，在臨床中廣泛應(yīng)用。它可阻斷多種神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺D1、D2、D3和D4受體，5-HT2A、5-HT2C、5-HT3受體，兒茶酚胺受體，α1-腎上腺素能受體，毒蕈堿受體的乙酰膽堿M1，組胺H1受體等。而乳腺癌的發(fā)生與精神壓力密切相關(guān)，在精神壓力作用下神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)，刺激末梢神經(jīng)釋放高濃度的兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素，干擾神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的平衡，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化[4]。而巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，參與抗原呈遞、吞噬和其他免疫調(diào)節(jié)過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。THP-1細(xì)胞通?？杀环鸩フT導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，廣泛用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)的機(jī)制、信號(hào)通路以及營養(yǎng)和藥物運(yùn)輸?shù)妊芯恐小＞奘杉?xì)胞在不同因素的刺激下可分化為M1型或M2型巨噬細(xì)胞[5]。在腫瘤發(fā)展的初始階段，巨噬細(xì)胞可以通過殺死腫瘤細(xì)胞直接促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)，表現(xiàn)為M1型[6]。由于腫瘤進(jìn)展，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）開始表現(xiàn)出免疫抑制的M2型，通過產(chǎn)生大量生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)重塑分子和細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤的生長、遷移和血管生成[7-8]。本課題組推測，具有神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能的奧氮平可影響巨噬細(xì)胞的增殖和分化，從而影響腫瘤生長。因此進(jìn)一步明確奧氮平在乳腺癌中的作用機(jī)制，為奧氮平的藥物再利用提供充分依據(jù)。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的奧氮平對(duì)單獨(dú)THP-1細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的THP-1細(xì)胞均有抑制作用，但兩者之間并無差異。這提示奧氮平對(duì)THP-1細(xì)胞增殖活性的影響并不會(huì)受到MDA-MB-231細(xì)胞的影響。由于100 μmol·L－1的奧氮平對(duì)THP-1細(xì)胞增殖活性的影響較為明顯，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采用50 μmol·L－1的奧氮平對(duì)巨噬細(xì)胞的分化進(jìn)行研究。

為了進(jìn)一步研究奧氮平對(duì)THP-1細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)條件下THP-1的分化是否存在差異，本研究通過佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，然后對(duì)巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在THP-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組中，奧氮平僅參與CD68表達(dá)的調(diào)控；而在MDA-MB-231細(xì)胞參與的情況下，奧氮平能夠顯著提高CD68、CD80和CD163的表達(dá)水平，這提示奧氮平的存在對(duì)于THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化有著重要的意義，而MDA-MB-231細(xì)胞的存在對(duì)奧氮平影響巨噬細(xì)胞分化起著基礎(chǔ)作用，但尚不能明確巨噬細(xì)胞M1或M2分化的方向。

為了進(jìn)一步探索奧氮平對(duì)巨噬細(xì)胞分化的影響，我們檢測了THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化時(shí)趨化因子和炎癥因子表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞的參與下，單純佛波酯誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中炎癥因子的變化并不明顯。但是，在奧氮平的參與下，佛波酯誘導(dǎo)THP-1向巨噬細(xì)胞分化時(shí)IL-12的表達(dá)增加；隨著MDA-MB-231細(xì)胞的進(jìn)一步參與，CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-12、TNF-α、TGF-β表達(dá)水平均顯著升高。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了奧氮平對(duì)腫瘤微環(huán)境下巨噬細(xì)胞分化存在重要意義。已有文獻(xiàn)顯示，CCL-2、IL-6、IL-12、IL-1β是M1型亞群表型[9]，說明經(jīng)奧氮平處理后的THP-1有向M1型分化增強(qiáng)，向M2型分化減弱的可能。但M2型炎癥因子CXCL10、IL-10、TNF-α也有升高[10]，這提示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多因素的調(diào)控。

miRNAs作為一種單鏈RNA，可以調(diào)節(jié)許多病理生理過程，如細(xì)胞增殖、代謝、凋亡等[11]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化[12]。結(jié)合前面的研究，腫瘤細(xì)胞的存在是奧氮平在巨噬細(xì)胞分化和極化中發(fā)揮作用的重要基礎(chǔ)，因而我們進(jìn)一步檢測了巨噬細(xì)胞極化相關(guān)miRNA分子表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在腫瘤細(xì)胞參與的情況下，奧氮平對(duì)miR155、miR34a和Let7c都有一定的調(diào)節(jié)作用。Graff等[13]比較了極化的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞和極化的人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-155在M1和M2b條件下均升高。研究表明，miR-9通過靶向過氧化物酶體增殖體激活受體δ增強(qiáng)M1極化[14]，miR-155水平在巨噬細(xì)胞M1向M2極化時(shí)顯著下降，但在巨噬細(xì)胞M2向M1極化時(shí)升高[15]。但有研究得出不同的結(jié)論，張艷青等[16]發(fā)現(xiàn)TGF-β1下調(diào)miR-155的表達(dá)，巨噬細(xì)胞會(huì)趨向M2型活化。另外，miRNA34a抑制TAMs細(xì)胞極化過程，TAMs細(xì)胞過表達(dá)miRNA34a后可以顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長增殖過程[17]。

綜上所述，本研究證明奧氮平能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表面分子、炎癥因子和極化相關(guān)miRNA分子，參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控。因此，奧氮平具有腫瘤治療的潛力及深入研究的價(jià)值。今后我們會(huì)進(jìn)一步研究奧氮平調(diào)控乳腺癌腫瘤微環(huán)境的作用機(jī)制，并結(jié)合臨床病例進(jìn)行深入研究，探索奧氮平在抗腫瘤治療中的新作用。