香附的化學成分及其體外抗炎活性研究

韓建衛(wèi)，孫延平，楊炳友，王秋紅，匡海學*（.黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，哈爾濱 50040；.廣東藥科大學中藥學院，廣州 50006）

香附為莎草科莎草屬植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖[1]。香附味辛、微苦、微甘，性平，歸肝、脾、三焦經(jīng)，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效[2]。香附的主要化學成分有萜類、黃酮、生物堿、蒽醌類、甾醇類、糖類[3]。現(xiàn)代藥理學研究表明，香附具有抗腫瘤、抗抑郁、抑菌、抗炎和抗氧化等藥理作用[4]。為了進一步對香附資源的開發(fā)和利用，本課題組首次使用制備型正相高效液相色譜技術對香附石油醚層進行系統(tǒng)分離，從中共分離并鑒定了15個萜類化合物，結構見圖1，現(xiàn)報道如下。

圖1 化合物1～15 的結構式Fig 1 Structures of compounds 1～15

1 材料

香附購于芍花堂國藥股份有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物教研室樊銳鋒教授鑒定為莎草科莎草屬植物莎草CyperusrotundusL.的根莖。原植物標本（編號：20220331）保存于黑龍江中醫(yī)大學中藥化學實驗室。

Bruker-600型超導核磁共振儀（德國Bruker公司）；Q-TOF（ESI）高分辨質譜儀、2424-2998型分析HPLC儀（美國Waters公司）；制備型硅膠色譜柱（19 mm×250 mm，10 μm，蘇州速研醫(yī)藥科技有限公司）；柱色譜用硅膠80～100目、200～300目（青島海洋化工有限公司）；Silicage160 GF254薄層高效色譜硅膠板（美國默克公司）；柱色譜用化學試劑（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；正己烷、乙酸乙酯（色譜純，上海麥克林生化科技股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；脂多糖（LPS）、地塞米松（美侖生物科技有限公司）；BV-2 細胞及專用培養(yǎng)基（普諾賽生命科技有限公司）；胰酶細胞消化液、一氧化氮（NO）檢測試劑盒（碧云天公司）。

2 方法

2.1 提取分離

稱取干燥香附45 kg，粉碎過篩，用95%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，得總浸膏（3.3 kg）?？偨嗉舆m量蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3次，減壓回收溶劑，得石油醚萃取部位（1.2 kg）、乙酸乙酯萃取部位（1.1 kg）和水飽和正丁醇萃取部位（1.0 kg）。取石油醚萃取部位（300 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0～0∶100）梯度洗脫，經(jīng)TLC分析后合并，得到14個流分Fr.A～Fr.N。

Fr.C經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1～10∶1）梯度洗脫，得Fr.C1～Fr.C17。Fr.C6經(jīng)制備型正相HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝80∶1）分離純化得到化合物1（5.2 mg）。Fr.C8經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到5個流分Fr.C8-1～Fr.C8-5，F(xiàn)r.C8-2經(jīng)制備型HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝50∶1）分離純化得到化合物3（7.0 mg）、8（7.0 mg）、9（7.0 mg）和11（6.9 mg）。Fr.C11經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到4個流分Fr.C11-1～Fr.C11-4，F(xiàn)r.C11-2 經(jīng)制備型HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝40∶1）分離純化得到化合物2（7.0 mg）、4（6.9 mg）和5（7.4 mg）。Fr.C14經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到3個流分Fr.C14-1～Fr.C14-3，F(xiàn)r.C14-2經(jīng)制備型HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝30∶1）分離純化得到化合物7（7.0 mg）。

Fr.E經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1～0∶1）梯度洗脫，得Fr.E1～Fr.E9。Fr.E3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到3個流分Fr.E3-1～Fr.E3-3，F(xiàn)r.E3-2經(jīng)制備型HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝10∶1）分離純化得到化合物13（7.0 mg）、14（7.0 mg）和15（7.0 mg）。Fr.E5經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到5個流分Fr.E5-1～Fr.E.5-5，F(xiàn)r.E5-2經(jīng)制備型HPLC（正己烷-乙酸乙酯＝8∶1）分離純化得到化合物10（7.0 mg）、12（7.0 mg）和6（7.0 mg）。

2.2 體外抗炎活性評價

2.2.1 細胞的培養(yǎng)及毒性評價 采用CCK-8法測驗化合物對BV-2細胞毒性的作用。BV-2小膠質細胞在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將BV-2細胞以1×105個·mL－1接種于96孔板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后，分為空白組及不同濃度給藥組（6.25、12.5、25、50、100 μmol·mL－1），每組6個復孔，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μLCCK-8溶液，在37℃下培養(yǎng)3 h后，在450 nm處測定吸光度（A）值。

2.2.2 NO含量的測定 將BV-2細胞以 1×105個·mL－1接種于96孔板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后，加入含藥培養(yǎng)基。實驗組分別設置為空白組、模型組、陽性藥組、給藥組，每組6個復孔?？瞻捉M和模型組加入不含藥培養(yǎng)基，孵育細胞1 h后，除空白組外，其他各組均加入LPS（0.5 μg·mL－1），繼續(xù)孵育細胞24 h，收集細胞上清液，按照試劑盒說明書檢測NO的含量。

2.2.3 統(tǒng)計學分析 應用軟件GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學說明，通過對NO抑制率的大小表示化合物體外抗炎活性的強弱，結果以±s的形式表示。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：淡黃色油狀，分子式為C31H50O。HR-ESI-MSm/z：437.3864 [M－H]－（計算值437.3862），[α]25D＝＋22.2°（c0.33，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.86（1H，m，H-1a），1.54（1H，m，H-1b），2.71（1H，m，H-2a），2.31（1H，m，H-2b），1.72（1H，m，H-5），1.55（2H，m，H-6），1.92（1H，m，H-7a），1.31（1H，m，H-7b），1.59（1H，m，H-8），1.40（1H，m，H-11a），1.10（1H，m，H-11b），1.32（2H，m，H-12），1.67（2H，m，H-15），2.05（1H，m，H-16a），1.14（1H，m，H-16b），1.64（1H，m，H-17），1.00（3H，s，H-18），0.79（1H，m，H-19a），0.58（1H，m，H-19b），1.41（1H，m，H-20），0.90（3H，d，J＝5.6 Hz，H-21），1.13（2H，m，H-22），2.13（1H，m，H-23a），1.89（1H，m，H-23b），2.24（1H，m，H-25），1.03（3H，m，H-26），1.03（3H，m，H-27），0.91（3H，s，H-28），1.05（3H，s，H-29），1.10（3H，s，H-30），4.72（1H，br.s，H-31a），4.67（1H，br.s，H-31b）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：33.4（C-1），37.4（C-2），216.5（C-3），50.2（C-4），48.4（C-5），21.5（C-6），28.1（C-7），47.9（C-8），21.1（C-9），27.0（C-10），25.9（C-11），35.6（C-12），45.4（C-13），48.8（C-14），32.8（C-15），26.8（C-16），52.3（C-17），18.3（C-18），29.5（C-19），36.1（C-20），18.1（C-21），35.0（C-22），31.3（C-23），156.9（C-24），33.8（C-25），22.0（C-26），21.9（C-27），19.3（C-28），22.2（C-29），20.8（C-30），106.0（C-31）。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道基本一致，故鑒定化合物1為24-methylenecycloartenone。

化合物2：淡黃色固體，分子式為C15H22O。HR-ESI-MSm/z：217.1673 [M－H]－（計算值217.1671），[α]25D＝－28.4°（c0.84，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.83（3H，s，H-12），1.01（3H，s，H-13），0.85（3H，d，J＝6.0 Hz，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：68.7（C-1），25.6（C-2），33.9（C-3），134.5（C-4），176.6（C-5），28.3（C-6），48.2（C-7），27.1（C-8），27.9（C-9），36.1（C-10），41.6（C-11），26.2（C-12），19.3（C-13），188.2（C-14），18.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，故鑒定化合物2為cyperenal。

化合物3：白色固體，分子式為C15H22O。HR-ESI-MSm/z：217.1675 [M－H]－（計算值217.1671），[α]25D＝－115.2°（c0.56，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.65（1H，ddd，J＝13.5，9.5，1.4 Hz，H-2a），1.89（1H，m，H-2b），2.44（1H，br.dd，J＝18.2，9.5 Hz，H-3a），2.78（1H，br.dt，J＝18.0，9.5 Hz，H-3b），2.05（1H，t，J＝3.5 Hz，H-7），1.73（1H，m，H-8a），1.93（1H，ddt，J＝6.5，3.5，14.0 Hz，H-8b），1.15（1H，ddt，J＝12.0，7.1，14.0 Hz，H-9a），1.57（1H，dt，J＝14.0，6.5 Hz，H-9b），2.16（1H，ddq，J＝12.0，6.5，6.5 Hz，H-10），1.01（3H，s，H-12），0.88（3H，s，H-13），2.07（3H，q like，H-14），1.01（3H，d，J＝6.5 Hz，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：63.7（C-1），26.2（C-2），43.5（C-3），148.5（C-4），139.6（C-5），207.3（C-6），63.0（C-7），25.9（C-8），28.1（C-9），34.6（C-10），41.4（C-11），19.0（C-12），26.4（C-13），15.2（C-14），17.9（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定化合物3為patchoulenone。

化合物4：白色固體，分子式為C15H24O。HR-ESI-MSm/z：219.1825 [M－H]－（計算值219.1827），[α]25D＝－22.4°（c0.83，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：2.03（1H，dd，J＝9.8，6.8 Hz，H-1），2.13（2H，m，H-2），5.18（1H，m，H-3），1.45（1H，m，H-7a），1.16（1H，m，H-7b），1.68（1H，m，H-8a），1.43（1H，m，H-8b），1.57（1H，m，H-9），2.23（1H，d，J＝11.2 Hz，H-11a），1.41（1H，m，H-11b），1.75（3H，m，H-12），1.10（3H，s，H-13），1.08（3H，s，H-14），0.98（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：55.1（C-1），31.1（C-2），124.6（C-3），143.4（C-4），69.7（C-5），74.7（C-6），37.1（C-7），25.7（C-8），49.4（C-9），42.3（C-10），37.8（C-11），16.4（C-12），25.7（C-13），26.2（C-14），27.6（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定化合物4為4，5，6，7，8，8a-六氫-3，4，8，8-四甲基-1H-3a，7-亞甲基甘菊環(huán)-4-醇甲酸酯。

化合物5：淡黃色固體，分子式為C15H24O。HR-ESI-MSm/z：219.1829 [M－H]－（計算值219.1827），[α]25D＝＋28.2°（c0.61，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.40（1H，ddd，J＝12.8，7.9，0.75 Hz，H-2a），1.79～1.75（1H，m，H-2b），2.62（1H，m，H-3a），2.24（1H，dd，J＝16.2，9.4 Hz，H-3b），4.28（1H，s，H-6），1.63（1H，t，J＝3.4 Hz，H-7），1.36～1.30（2H，m，H-8a，H-9b），1.73～1.68（1H，m，H-8b），0.84～0.77（1H，m，H-9a），1.84～1.79（1H，m，H-10），1.08（3H，s，H-12），0.87（3H，s，H-13），0.81（3H，d，J＝6.4 Hz，H-14），1.81（3H，m，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：67.5（C-1），26.4（C-2），42.8（C-3），132.3（C-4），145.8（C-5），73.0（C-6），58.3（C-7），26.4（C-8），28.7（C-9），34.9（C-10），40.5（C-11），27.4（C-12），20.2（C-13），17.8（C-14），14.6（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定化合物5為4-烯-廣藿香醇。

化合物6：淡黃色晶體，分子式為C15H24O。HR-ESI-MSm/z：219.1825 [M－H]－（計算值219.1827），[α]25D＝－14.2°（c0.44，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.44（1H，m，H-2a），1.63（1H，d，J＝13.0 Hz，H-2b），2.62（1H，m，H-3a），2.40（1H，d，J＝15.0 Hz，H-3b），2.62（1H，m，H-6a），2.28（1H，m，H-6b），1.86（1H，m，H-7），1.25（1H，m，H-8a），1.72（1H，m，H-8b），1.07（1H，m，H-9a），1.43（1H，m，H-9b），1.96（1H，m，H-10），0.80（3H，s，H-12），0.92（3H，s，H-13），4.15（2H，m，H-14），0.89（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：65.8（C-1），26.2（C-2），37.9（C-3），131.2（C-4），146.3（C-5），28.2（C-6），48.5（C-7），27.5（C-8，C-9），35.2（C-10），41.1（C-11），26.1（C-12），19.3（C-13），60.6（C-14），17.9（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物6為cyperenol。

化合物7：淡黃色油狀，分子式為C15H22O2。HR-ESI-MSm/z：233.1623 [M－H]－（計算值233.1620），[α]25D＝＋5.2°（c0.78，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：2.11（2H，s，H-2），2.03（2H，dd，J＝15.8，6.8 Hz，H-6），1.40～1.38（1H，m，H-7），1.02～0.98（1H，m，H-8a），1.56～1.47（2H，m，H-8b，H-10），0.91～0.84（1H，m，H-9a），1.13～1.07（1H，m，H-9b），0.46（3H，s，H-12），0.64（3H，s，H-13），0.8（3H，d，J＝6.8 Hz，H-14），1.62（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：50.6（C-1），33.9（C-2），169.1（C-3），142.1（C-4），115.1（C-5），30.0（C-6），44.0（C-7），27.0（C-8），27.7（C-9），35.9（C-10），43.9（C-11），26.3（C-12），18.6（C-13），17.9（C-14），15.6（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物7為cyperolactone。

化合物8：無色針狀，分子式為C15H24O。HR-ESI-MSm/z：219.1829 [M－H]－（計算值219.1827），[α]25D＝－70.1°（c0.93，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.78（1H，t，J＝10.0 Hz，H-1），1.45（1H，m，H-2a），1.64（1H，m，H-2b），2.09（1H，m，H-3a），0.90（1H，m，H-3b），2.89（1H，dd，J＝10.6，4.2 Hz，H-5），2.23（1H，m，H-6a），1.32（1H，m，H-6b），2.36（1H，m，H-7a），2.11（1H，m，H-7b），2.59（1H，q，J＝7.0 Hz，H-9），1.70（1H，m，H-10a），1.64（1H，m，H-10b），1.22（3H，s，H-12），4.99（1H，br.s，H-13a），4.88（1H，br.s，H-13b），1.0（3H，s，H-14），0.97（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：50.8（C-1），27.2（C-2），39.2（C-3），59.8（C-4），63.8（C-5），30.2（C-6），29.8（C-7），151.8（C-8），48.7（C-9），39.8（C-10），34.0（C-11），17.0（C-12），112.8（C-13），21.6（C-14），29.9（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物8為（－）-caryophyllene oxide。

化合物9：淡黃色固體，分子式為C15H24O。HR-ESI-MSm/z：219.1824 [M－H]－（計算值219.1827），[α]25D＝0.0°（c0.85，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.99（1H，dd，J＝13.5，9.6 Hz，H-1a），1.87（1H，dd，J＝13.7，5.2 Hz，H-1b），5.00（1H，dd，J＝9.5，6.7 Hz，H-2），2.20（1H，m，H-4a），2.10（1H，m，H-4b），2.10（1H，m，H-5a），1.37（1H，m，H-5b），2.52（1H，dd，J＝10.1，3.8 Hz，H-6），2.57（1H，dd，J＝12.4，5.2 Hz，H-8a），1.65（1H，dd，J＝12.2，10.4 Hz，H-8b），5.31（1H，ddd，J＝15.7，10.1，5.2 Hz，H-9），5.17（1H，d，J＝15.8 Hz，H-10），1.10（3H，s，H-12），1.13（3H，s，H-13），1.31（3H，s，H-14），1.57（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：40.3（C-1），125.7（C-2），131.9（C-3），36.6（C-4），24.8（C-5），62.0（C-6），63.2（C-7），42.5（C-8），122.1（C-9），143.1（C-10），36.5（C-11），29.7（C-12），24.8（C-13），17.2（C-14），15.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物9為humulene epoxide Ⅱ。

化合物10：無色針晶，分子式為C15H24O2。HR-ESI-MSm/z：235.1773 [M－H]－（計算值235.1776），[α]25D＝－2.2°（c0.43，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：2.48（1H，d，J＝9.6 Hz，H-2），1.57（1H，d，J＝10.8 Hz，H-3a），1.40（1H，m，H-3b），5.31（1H，d，J＝15.9 Hz，H-5），5.49（1H，ddd，J＝15.6，10.5，4.8 Hz，H-6），2.64（1H，dd，J＝12.5，5.1 Hz，H-7a），1.64（1H，dd，J＝14.1，11.1 Hz，H-7b），2.74（1H，dd，J＝9.9，5.1 Hz，H-9），2.20（1H，ddd，J＝14.1，10.5，5.1 Hz，H-10a），1.40（1H，m，H-10b），2.14（1H，ddd，J＝7.5，5.4，1.8 Hz，H-11a），1.08（1H，m，H-11b），1.31（3H，s，H-12），1.19（3H，s，H-13），1.08（3H，s，H-14），1.31（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：60.0（C-1），64.6（C-2），38.3（C-3），35.6（C-4），142.8（C-5），122.5（C-6），43.3（C-7），63.3（C-8），60.3（C-9），25.1（C-10），34.8（C-11），16.4（C-12），23.4（C-13），30.7（C-14），16.5（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物10為 humulene diepoxide A。

化合物11：淡黃色油狀，分子式為C29H50O2。HR-ESI-MSm/z：429.3813 [M－H]－（計算值429.3811），[α]25D＝＋7.2°（c0.65，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：1.24（3H，s，H-2a），1.75（2H，m，H-3），2.58（2H，t，J＝6.8 Hz，H-4），2.19（3H，s，H-7a），2.14（6H，s，H-5a，8a），0.83（3H，d，J＝6.4 Hz，H-4'a），0.83（3H，d，J＝6.4 Hz，H-8'a），0.88（3H，d，J＝6.8 Hz，H-12'a），0.86（3H，d，J＝6.8 Hz，H-13'）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：74.5（C-2），23.8（C-2a），31.6（C-3），20.7（C-4），118.4（C-5），11.2（C-5a），144.5（C-6），121.0（C-7），12.1（C-7a），122.6（C-8），11.7（C-8a），145.6（C-9），117.3（C-10），39.8（C-1'），21.0（C-2'），37.5（C-3'），32.8（C-4'），19.7（C-4'a），37.4（C-5'），24.4（C-6'），37.4（C-7'），32.7（C-8'），19.6（C-8'a），37.3（C-9'），24.7（C-10'），39.4（C-11'），27.9（C-12'），22.7（C-12'a），22.6（C-13'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物11為α-tocopherol。

化合物12：白色無定形粉末，分子式為C15H22O2。HR-ESI-MSm/z：233.1623 [M－H]－（計算值233.1620），[α]25D＝＋6.2°（c0.82，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.67（1H，d，J＝8.0 Hz，H-1），6.86（1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-2），6.83（1H，d，J＝2.0 Hz，H-4），2.60（1H，ddd，J＝12.0，8.3，3.6 Hz，H-6），2.10（1H，m，H-7a），1.73（1H，m，H-7b），2.22（1H，ddd，J＝15.8，7.7，5.3 Hz，H-8a），2.16（1H，dd，J＝15.8，8.0 Hz，H-8b），1.85（1H，m，H-11），1.01（3H，d，J＝6.8 Hz，H-12），0.73（3H，d，J＝6.8 Hz，H-13），2.05（3H，s，H-14），2.25（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：115.8（C-1），127.4（C-2），129.9（C-3），128.7（C-4），130.0（C-5），44.5（C-6），26.8（C-7），42.0（C-8），210.9（C-9），152.1（C-10），33.1（C-11），21.0（C-12），21.4（C-13），30.2（C-14），20.9（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物12為litseachromolaevane A。

化合物13：淡黃色油狀，分子式為C15H24O2。HR-ESI-MSm/z：235.1773 [M－H]－（計算值235.1776），[α]25D＝－1.2°（c0.78，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：3.13（1H，dd，J＝9.1，5.9 Hz，H-1），2.31（1H，m，H-2a），1.51（1H，m，H-2b），2.17（1H，m，H-3a），1.21（1H，m，H-3b），2.89（1H，dd，J＝10.7，3.8 Hz，H-5），2.11（1H，td，J＝13.2，3.8 Hz，H-6a），1.27（1H，m，H-6b），1.99（1H，m，H-7），1.69（1H，m，H-8a），1.58（1H，m，H-8b），2.21（1H，dd，J＝13.9，6.2 Hz，H-9a），1.10（1H，dd，J＝13.9，12.3 Hz，H-9b），4.65（1H，br.s，H-12a），4.61（1H，br.s，H-12b），1.70（3H，s，H-13），1.32（3H，s，H-14），1.37（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：60.4（C-1），24.9（C-2），34.7（C-3），59.6（C-4），63.7（C-5），33.2（C-6），45.0（C-7），28.6（C-8），41.0（C-9），60.0（C-10），150.1（C-11），108.9（C-12），19.7（C-13），16.8（C-14），15.8（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物13為hyperhubein G。

化合物14：淡黃色油狀，分子式為C15H22O。HR-ESI-MSm/z：217.1675 [M－H]－（計算值217.1671），[α]25D＝＋200.2°（c0.68，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.78（1H，s，H-1），4.72（1H，br.s，H-12a），4.74（1H，br.s，H-12b），1.74（3H，br.s，H-13），1.13（3H，s，H-14），0.97（3H，d，J＝3.7 Hz，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：124.6（C-1），199.6（C-2），42.1（C-3），40.3（C-4），39.3（C-5），32.9（C-6），40.4（C-7），31.6（C-8），43.9（C-9），170.5（C-10），149.1（C-11），109.2（C-12），20.9（C-13），14.9（C-14），16.8（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物14為nootkatone。

化合物15：白色無定形粉末，分子式為C15H22O。HR-ESI-MSm/z：217.1673 [M－H]－（計算值217.1671），[α]25D＝＋0.4°（c0.64，CHCl3）。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：2.65（1H，dd，J＝6.7，1.3 Hz，H-1），5.71（1H，m，H-3），1.96（1H，dd，J＝6.7，0.9 Hz，H-5），2.64（1H，s，H-6），1.70（1H，m，H-7），1.50（1H，ddd，J＝2.8，10.5，10.5 Hz，H-8a），1.70（1H，m，H-8b），1.85（1H，m，H-9a），1.70（1H，m，H-9b），1.48（1H，dd，J＝6.5，6.5 Hz，H-11），0.83（3H，d，J＝6.5 Hz，H-12），0.81（3H，d，J＝6.5 Hz，H-13），1.98（3H，d，J＝1.4 Hz，H-14），0.94（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：56.6（C-1），203.5（C-2），121.4（C-3），169.5（C-4），55.9（C-5），54.6（C-6），45.4（C-7），21.9（C-8），36.7（C-9），57.0（C-10），31.7（C-11），19.4（C-12），19.9（C-13），20.2（C-14），23.5（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物15為mustakone。

3.2 化合物生物活性測試結果

采用CCK-8法測定化合物1～15對LPS誘導小鼠BV-2細胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)15個化合物在濃度為50 μmol·L－1時，細胞存活率均高于90%。15個化合物在終濃度為50 μmol·L－1時對LPS誘導的BV-2細胞的炎癥反應結果如表1所示。化合物4和11可顯著抑制NO的釋放，提示化合物4和11具有一定的抗炎活性，為后續(xù)抗炎機制研究奠定基礎。

表1 化合物1～15對LPS誘導的BV-2細胞產(chǎn)生NO的抑制效果Tab 1 Inhibition of compounds 1～15 on NO production in LPSinduced BV-2 microglial cells

4 討論

本研究首次使用制備型正相HPLC技術對香附石油醚層進行系統(tǒng)分離，得到15個化合物，其中化合物2、6、9～11和13為首次從莎草科植物中分離得到，化合物12為首次從莎草屬植物中分離得到，化合物4、5和7為首次從香附中分離得到，制備型正相HPLC解決了小極性化合物不溶于甲醇或乙腈而造成的損失。NO是目前廣泛被認可的炎癥因子，標志著免疫細胞的激活。LPS可以刺激BV-2細胞產(chǎn)生炎癥反應，并增加細胞中NO的生成，直接參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展。本實驗測定了15種化合物對LPS誘導小鼠BV-2細胞釋放NO的抑制率，同時進行了CCK-8檢測。結果顯示，化合物4和11能顯著抑制NO的生成。本實驗結果豐富了香附的化學成分，可為香附的進一步開發(fā)利用提供參考。