微量QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測涼茶中59 種非法添加化學(xué)藥物

戴盡波，沈 潔，董文靜，何嘯峰，聶榮榮，梁沁嫻，葉彩平

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東梅州 514071）

涼茶是最獨(dú)特的飲料之一，是嶺南人民根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍夂蚝退撂匦?，由清熱消暑、祛濕解毒的中草藥熬制而成，含有黃酮、有機(jī)酸、多糖、生物堿等各種生物活性物質(zhì)，具有抗菌、消炎、抗病毒和增強(qiáng)免疫力的藥效[1-3]。發(fā)展至今，廣東涼茶已經(jīng)成為嶺南中醫(yī)藥文化的一個重要分支，代表了一種中國獨(dú)有的防病養(yǎng)生文化，2006 年5 月，經(jīng)國務(wù)院批準(zhǔn)，廣東涼茶被列入第一批國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。近年來，有些商家為提高涼茶療效，吸引回頭客、牟取暴利，非法往涼茶里添加化學(xué)藥品，部分市區(qū)開展的食品安全專項(xiàng)行動中也有發(fā)現(xiàn)多家涼茶商鋪存在非法添加西藥的情況[4-6]，消費(fèi)者長期飲用含化學(xué)藥品的涼茶，可能會出現(xiàn)重復(fù)或過量用藥的情況，易發(fā)生嚴(yán)重的藥品不良反應(yīng)。

目前，針對涼茶非法添加藥物的檢測方法主要有免疫層析法[7-9]、高效液相色譜法[10-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-17]，超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[18-20]等。免疫層析法假陽性率高、檢測成分單一，而液相色譜法靈敏度、準(zhǔn)確度較低。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于設(shè)備昂貴、維護(hù)成本高，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、抗干擾強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前涼茶非法添加藥物檢測的主流手段。胡佳哲等[14]報道了HPLC-MS/MS 同時測定涼茶中磺胺甲惡唑、馬來酸氯苯那敏等19 種非法添加藥物的方法，結(jié)果表明，所建立的方法可以用于涼茶等植物型飲料中非法添加化學(xué)藥物的快速測定。張科明等[21]建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，用于分析涼茶中非法添加的10 種止咳平喘類化學(xué)藥物，結(jié)果表明該方法操作簡單、靈敏度高、可用于涼茶中10 種非法添加的止咳平喘類化學(xué)藥物的快速分析。

涼茶一般為一種或多種中草藥的水溶液提取物，成分復(fù)雜，含有大量的親水性多糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)以及生物堿等，針對復(fù)雜基質(zhì)，目前處理方法主要有QuEChERS 法[22-24]、固相萃取法[25-26]。QuECh-ERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）是一種高效的前處理技術(shù)。此技術(shù)在檢測目標(biāo)物具有靈敏度高、快速、回收率高且具有多殘留檢測的能力，被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境檢測及生物檢測等領(lǐng)域[27-29]，目前，QuEChERS 技術(shù)在涼茶非法添加檢測方面均采用常規(guī)QuEChERS，用5～10 mL 的萃取溶劑，如乙腈去萃取5～10 mL 的樣品，取凈化后5～20 μL 的上清液進(jìn)行儀器分析，而基于質(zhì)譜的分析方法所使用的上樣量很小，大部分的樣品提取液被浪費(fèi)，既不環(huán)保也不經(jīng)濟(jì)。微量QuEChERS（micro-QuEChERS）技術(shù)為小型化的QuEChERS 方法，與傳統(tǒng)QuEChERS 相比，該方法產(chǎn)生使用較少的溶劑、樣品、吸水劑和吸附劑量，節(jié)約了分析成本，其檢測更快，并達(dá)到與QuEChERS 相當(dāng)?shù)撵`敏度[30-31]，且產(chǎn)生的廢液量小。本研究基于micro-QuEChERS 前處理技術(shù)建立同時檢測涼茶中59 非法添加藥物的UPLC-MS-MS 方法，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量分析，滿足市售實(shí)際樣品的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20 批次的涼茶樣品 均為梅州本地市售涼茶；液體混標(biāo)：大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚、甲基苯丙胺混標(biāo)（4 種）、磺胺類混標(biāo)（18 種）、喹諾酮類混標(biāo)（10 種）、四環(huán)素類混標(biāo)（4 種）、酰胺醇類混標(biāo)（3 種）、硝基咪唑類混標(biāo)（2 種）、罌粟堿類混標(biāo)（5 種）

純度≥97%，濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司；固體單標(biāo)：對乙酰氨基酚、美洛昔康、氯苯那敏、地塞米松、保泰松、特拉唑嗪、吡羅昔康、2-甲基-5 硝基咪唑、氨基比林、地西泮、萘普生、雙氯芬酸鈉、布洛芬 純度≥97%，中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈、甲酸、氨水 色譜純，美國ACS恩科化學(xué)；氯化鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂 分析純，上海國藥集團(tuán)；活性炭、C18、PSA 天津博納艾杰爾科技有限公司；Z-Sep+美國Supelco 公司；多壁碳納米管 南京先豐納米科技公司。

AB Sciex 3500 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國SCIEX 公司；AUW220 型電子分析天平 島津企業(yè)管理有限公司；Thermo ST16R 型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher 公司；UC-7100S 型數(shù)控超聲波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；S25 型旋渦混勻器 德國IKA 公司；Milli Q 型超純水系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 13 種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備 分別精密稱取對乙酰氨基酚、美洛昔康、氯苯那敏、地塞米松、保泰松、特拉唑嗪、吡羅昔康、2-甲基-5 硝基咪唑、氨基比林、地西泮、萘普生、雙氯芬酸鈉、布洛芬固體標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g 用乙腈溶解并定容至100 mL，得到濃度為100 μg/mL 的13 種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃冰箱中避光保存。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備 分別吸取濃度為100 μg/mL 大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚、甲基苯丙胺混標(biāo)（4 種）、磺胺類混標(biāo)（18 種）、喹諾酮類混標(biāo)（10 種）、四環(huán)素類混標(biāo)（4 種）、酰胺醇類混標(biāo)（3 種）、硝基咪唑類混標(biāo)（2 種）、罌粟堿類混標(biāo)（5 種）和13 種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.0 mL，用乙腈定容至10 mL，配成濃度為10 μg/mL 的59 種混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-18 ℃冰箱中避光保存。

1.2.2 micro-QuEChERS 前處理過程 準(zhǔn)確量取1.0 mL 的樣品于10 mL 離心管中，加入1.0 mL 乙腈，混勻，超聲提取5 min，隨后加入鹽包（含0.4 g 無水Na2SO4及0.1 g NaCl），渦旋混勻1 min，4 ℃下10000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確取1.0 mL 上清液至2 mL 凈化管（含80 mg C18、150 mg 無水Na2SO4），渦旋混合30 s，5000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后，待測。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；流動相：A 為乙腈：甲醇（8:2），B 為0.01%甲酸水；梯度洗脫條件：0～0.5 min 95% A，0.5～2.0 min 95%～85% A，2.0～6.0 min 85%～68% A，6.0～7.5 min 68%～8% A，7.5～12.0 min 8%～3% A，12.0～14.0 min 3% A；14.0～14.1 min 3%～95%；14.0～16.0 min 95%A；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：ESI 源，正/負(fù)離子模式；離子源參數(shù)：IS 電壓：5500 V/-4500 V，氣簾氣CUR：30 psi，霧化氣GS1：50 psi，輔助氣GS2：60 psi，源溫度TEM：550 ℃，碰撞氣CAD：7 psi。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex Analyst 軟件完成數(shù)據(jù)的采集，AB Sciex OS 軟件完成數(shù)據(jù)處理。平行及精密度數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 進(jìn)行計算，采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，分別將1 μg/mL 的59 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在正、負(fù)離子模式下對各待測化合物進(jìn)行全掃描，確定合適的電離方式和準(zhǔn)分子離子，再對相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，每種化合物選擇信號高、干擾小的兩個離子對作為定性與定量離子，通過優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE），使特征碎片離子信號達(dá)到最大，優(yōu)化的質(zhì)譜條件見表1。

表1 59 種化合物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters for detection of 59 analytes

2.1.2 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)檢測對象有59 種化合物，化學(xué)性質(zhì)差異較大，同時含有5 組11 種化合物是同分異構(gòu)體（磺胺二甲異嘧啶和磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺鄰二甲氧嘧啶、四環(huán)素和多西環(huán)素、大麻二酚和四氫大麻酚），同分異構(gòu)體具有相同的母離子，色譜峰需要達(dá)到完全分離，才能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因此，實(shí)驗(yàn)針對色譜柱類型和流動相成分進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2.1 色譜柱優(yōu)化 分別考察了EclipseXDB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）、Kinetex F5（50 mm×3.0 mm，2.6 μm）、Shim-pack GIST-HP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）、ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 種型號的色譜柱對59 種目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用ACQUITY HSS T3 色譜柱時，各目標(biāo)組分具有較好分離效果，特別是5 對同分異構(gòu)體能夠完全分離、且峰形尖銳，結(jié)果見圖1，最終選擇采用ACQUITY HSS T3 色譜柱進(jìn)行分離。

圖1 5 組同分異構(gòu)體和59 種化合物總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of five groups of isomers and analytes

2.1.2.2 流動相優(yōu)化 考慮到本研究中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類化合物占比較多，參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.17[32]方法選擇乙腈:甲醇（8:2）作為優(yōu)化條件之一，并與純甲醇、純乙腈有機(jī)流動相進(jìn)行比較，通過比較發(fā)現(xiàn)，純甲醇作為有機(jī)相時，甲硝唑、罌粟堿等化合物峰形毛刺多、分叉，出現(xiàn)前沿峰，且梯度運(yùn)行時間長；純乙腈作為有機(jī)相時，喹諾酮類、四環(huán)素類化合物峰形毛刺多、不對稱，磺胺類同分異構(gòu)體分離度較差，甲硝唑等硝基咪唑類保留差，有雜峰，靈敏度差；乙腈:甲醇（8:2）作為有機(jī)相時化合物峰型較窄、分離度好、靈敏度高、在16 min 化合物能夠完全分離。

電噴霧離子源正離子模式下，流動相中添加適量甲酸可增強(qiáng)目標(biāo)分析物離子化效率，提高靈敏度，本實(shí)驗(yàn)大部分化合物均為正離子模式，但也有9 種化合物采用負(fù)離子模式，因此對濃度為0、0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%的甲酸水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲酸濃度超過0.01%時，負(fù)離子模式的化合物色譜峰響應(yīng)值下降明顯，靈敏度不能滿足檢測需求；當(dāng)濃度低于0.01%時，正離子模式的靈敏度較低，且峰形較差；甲酸濃度為0.01%時，大部分化合物峰形尖銳，靈敏度較高，能夠滿足檢測需求，實(shí)驗(yàn)最終選擇0.01%甲酸水-乙腈:甲醇（8:2）作為流動相，該條件下59 種化學(xué)藥物的分離效果好、各化合物靈敏度和和峰形均可滿足檢測要求。

2.2 Micro-QuEChERS 條件優(yōu)化

2.2.1 鹽析試劑優(yōu)化 QuEChERS 前處理方法常用Na2SO4、MgSO4作為脫水劑、NaCl 作為鹽析劑，NaCl 能夠促進(jìn)樣品中水的析出，提高脫水劑效率，從而提高提取效率，實(shí)驗(yàn)分別對比了NaCl 和Na2SO4、NaCl 和MgSO4對目標(biāo)化合物回收率的影響。取1 mL 樣品，按樣品量:乙腈:NaCl:除水劑比率1.0:1.0:0.1:0.4（v/v/w/w），添加乙腈、NaCl、Na2SO4或MgSO4。當(dāng)選用MgSO4作為脫水劑時，喹諾酮類和四環(huán)素類化合物的回收率明顯降低，最高降低幅度達(dá)到80%。因?yàn)猷Z酮類和四環(huán)素類藥物易與Mg2+形成螯合物導(dǎo)致溶解度降低[33]。當(dāng)選用Na2SO4作為脫水劑時，喹諾酮、四環(huán)素回收率明顯提高，其余化合物的回收率變化不大，因此本實(shí)驗(yàn)選用NaCl 作為鹽析劑、Na2SO4作為脫水劑。

2.2.2 樣品體積優(yōu)化 傳統(tǒng)QuEChERS 方法中樣品取樣量通常為10 g 或10 mL，為考察樣品量對目標(biāo)化合物提取效果影響，實(shí)驗(yàn)測試了1.0、2.0、4.0、10.0 mL 取樣量時目標(biāo)化合物回收率。實(shí)驗(yàn)中按涼茶樣品量:乙腈:NaCl:Na2SO4比率1.0:1.0:0.1:0.4（v/v/w/w），添加提取試劑、脫水劑、鹽析劑，通過加標(biāo)回收率進(jìn)行評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2）1.0、2.0、4.0、10.0 mL 涼茶樣品量的對應(yīng)59 種化合物回收率分別為47.7%～124.0%、48.5%～125.4%、44.9%～126.7%、41.0%～128.3%，RSD 小于18.2%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品量減少不會影響提取回收率，最終選擇樣品量為1 mL。

圖2 不同樣品體積對59 種化合物回收率影響Fig.2 Effects of different sample amount on the recoveries of 59 analytes

2.2.3 凈化材料優(yōu)化 根據(jù)涼茶基質(zhì)的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)首先考察了C18、PSA、Z-Sep+、GCB、MWCNTs 吸附劑的凈化效果，結(jié)果見圖3。當(dāng)各吸附劑用量為50 mg 時，從回收率角度看，C18吸附劑效果最好，回收率在53%～126.0%，平均回收率為71.6%；Z-Sep+回收率在33.0%～131.9%，平均回收率為67.5%，其中回收率＜60%有32 種，特別是對萘普生、雙氯芬酸鈉、布洛芬等化合物有吸附作用，回收率較低；PSA 對喹諾酮類、磺胺類、萘普生、布洛芬等帶有羧基化合物具有較強(qiáng)吸附作用，回收率在24.1%～138.0%，平均回收率為56.3%；GCB、MWCNTs 具有較強(qiáng)的吸附能力，能很好的去除涼茶中色素，但對喹諾酮類、磺胺類、大麻酚等吸附作用強(qiáng)，平均回收率均在50%以下。故最終選擇C18作為凈化吸附劑，并對凈化吸附劑C18的用量進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)其用量為80 mg 時，59 種化合物回收率最佳，回收率在60%～120%范圍內(nèi)的化合物個數(shù)占84.7%，最終確定C18用量為80 mg。

圖3 不同吸附劑對59 種回收率影響Fig.3 Effect of different sorbent on the recoveries of 59 analytes

2.3 基質(zhì)效應(yīng)研究

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是指樣品中除檢測目標(biāo)分析物之外的其他成分對分析過程造成的干擾和影響。基質(zhì)效應(yīng)可以通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比來評價。ME＜0.8 時，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；0.8≤ME≤1.2 時，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯；ME＞1.2 時，表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[34-35]。實(shí)驗(yàn)考察了59 種化合物在涼茶中的基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，17%化合物的ME＜0.8，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；64%化合物的ME 為0.8～1.2，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；19%藥物的ME＞1.2，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，可降低對目標(biāo)藥物基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 方法線性范圍、檢出限、定量限 按照1.2.2前處理方法制備得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)液配成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以59 種化合物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到59 種化合物線性范圍、線性方程和決定系數(shù)（R2），結(jié)果顯示，59 種化合物在其線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，決定系數(shù)均大于0.999，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 59 種化合物基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 2 Matrix effects,LOD and LOQ of 59 analytes

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐級稀釋后加入涼茶陰性樣品中，按1.2.2 前處理方法處理，上機(jī)測定，以目標(biāo)峰信噪比（S/N）≥3 時樣品濃度確定為檢出限（LOD），S/N≥10 時樣品濃度為定量限（LOQ），結(jié)果顯示可知59 種化合物的檢出限在5.0～10.0 μg/L 之間，定量限為10.0～25.0 μg/L 在之間，結(jié)果詳見表2，表明該方法具有較高的靈敏度。

2.4.2 回收率與精密度 取陰性涼茶樣品為基質(zhì)，添加25、50、100 μg/L 低中高3 個濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平平行測試6 次，計算各化合物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），由表3 可知，結(jié)果表明，加標(biāo)濃度為25 μg/L 時，59 種化合物回收率范圍為60.3%～121.7%，RSD 為2.0%～13.7%，加標(biāo)濃度為50 μg/L 時，59 種化合物收率范圍為70.2%～128.8%，RSD 為1.2%～13.1%，加標(biāo)濃度為100 μg/L時,59 種化合物的平均回收率范圍為66.3%～127.4%，RSD 為1.0%～13.2%，由此可見，回收率及精密度均能夠滿足定量分析的需求。

表3 59 種化合物平均回收率和精密度（n=3）Table 3 Recoveries and RSDs of 59 analytes spiked into blank matrix sample (n=3)

2.5 方法學(xué)比較

與其他已有關(guān)于涼茶中非法添加化學(xué)藥物檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較（表4），從表4 中可看出，本方法在樣品及提取溶劑使用量、檢測藥物數(shù)量、檢測模式、儀器檢測時間、檢出限等方面具有優(yōu)勢，特別是在降低樣品及試劑用量、提高檢測效率、降低檢測成本上優(yōu)勢明顯。靈敏度方面與大部分研究相當(dāng)，優(yōu)于現(xiàn)有國家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[36]。因此，所建方法靈敏、高效和可靠，可適用于涼茶中非法添加藥物的快速、定量檢測。

表4 micro-QuEChERs/LC-MS/MS 與其他已報道方法的比較Table 4 Comparison of micro-QuEChERs-LC-MS/MS with other reported methods

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本研究建立的方法，隨機(jī)對從梅州本地市場購買的感冒茶、咽喉茶、口腔茶、咽炎茶、清熱解毒茶、祛濕茶等共20 批次樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示20 批涼茶樣品均未檢出以上59 種化學(xué)藥物。

3 結(jié)論

本研究以涼茶為對象，采用micro-QuEChERS前處理方法，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，建立了同時測定涼茶中59 種非法添加藥物的方法。該方法操作簡便、檢測效率高，藥物覆蓋面廣，特別是大大減少了樣品用量、試劑耗材用量，檢測成本顯著降低，與傳統(tǒng)QuEChERS 前處理方式相比，有著明顯的優(yōu)勢。對方法的檢出限、定量限、精密度及基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)評價，本方法檢出限為5.0～10.0 μg/L、定量限為10.0～25.0 μg/L，平均回收率為60.3%～128.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～13.7%，檢出限優(yōu)于國家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 201713，回收率、精密度等均滿足要求，該方法可以廣泛應(yīng)用于涼茶中非法添加藥物快速篩查和定量檢測，為涼茶風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。