藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵富集多酚和黃酮工藝優(yōu)化及其生物有效性研究

江慧斌，聶 攀，呂 瑋，宋立華,

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.河北省科技創(chuàng)新服務(wù)中心，河北石家莊 050011）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是一種營養(yǎng)價值較高的“類全谷物”，與小麥、水稻等傳統(tǒng)糧食作物相比，藜麥富含優(yōu)質(zhì)蛋白、多不飽和脂肪酸、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[1]。此外，藜麥還含有多酚、黃酮、皂苷、植物甾醇等多種功能活性成分[2]，具有抗氧化、調(diào)節(jié)餐后血糖、預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能，經(jīng)常食用可促進(jìn)健康[3-7]。黑大麥與普通大麥（Hordeum vulgareL.）均為禾本科大麥屬一年生草本植物，二者在營養(yǎng)特性方面具有“三高二低”（高蛋白、高纖維素、高維生素、低脂肪、低生糖的成分）等共性，但由于黑大麥同化力強(qiáng)，其較普通大麥具有更好的營養(yǎng)特性，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)、必需氨基酸、維生素、微量元素（如硒、鐵、鋅元素）、膳食纖維、不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）等含量更高，同時還是多酚等抗氧化成分的重要膳食來源，具有一定的食療價值[8-9]。

藜麥和黑大麥雖然具有較好的營養(yǎng)與功能特性，但是存在適口性不佳、氨基酸成分比例不均衡及營養(yǎng)物質(zhì)生物利用度低等問題。利用發(fā)酵技術(shù)加工全谷物可以有效改善上述問題[10-11]，楊慶華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用乳酸菌發(fā)酵能使谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)降解成小分子物質(zhì)、減少抗?fàn)I養(yǎng)成分、增加酚類化合物和維生素等營養(yǎng)成分的含量，并促使谷物產(chǎn)生更多理想的風(fēng)味物質(zhì)，賦予產(chǎn)品較好的感官品質(zhì)。Li 等[13]利用干酪乳桿菌發(fā)酵藜麥，使總酚含量顯著增加。史臘妮[14]的研究表明，利用植物乳桿菌發(fā)酵大麥能顯著提高多酚的含量。本課題組前期利用植物乳桿菌（Lactobacillus kisonensis）發(fā)酵藜麥和黑燕麥復(fù)合谷物，在原料比（藜麥:黑燕麥）1:3.4（g/g）、液料比7.5:1（mL/g）、接種量4.9%、發(fā)酵時間36.5 h 的工藝條件下，能顯著富集多酚和黃酮類功能性成分，提示復(fù)合谷物發(fā)酵有利于進(jìn)一步增強(qiáng)谷物的功能營養(yǎng)特性，但底物不同，工藝條件差異較大[15]。

本研究以藜麥與黑大麥為原料，以植物乳桿菌（Lactobacillus kisonensis）為發(fā)酵菌種，以多酚和黃酮含量為響應(yīng)值，利用單因素和響應(yīng)面實驗獲得優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件；在此基礎(chǔ)上，通過體外胃腸道模擬消化試驗，考察復(fù)合發(fā)酵谷物中酚類物質(zhì)的釋放規(guī)律和生物有效性，為功能性全谷物食品的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑大麥 青海省西寧市澤華綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)合作社提供；藜麥（青藜1 號）青海三江沃土生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；Lactobacillus kisonensis（JCM 15041）華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室饋贈；總抗氧化能力（FRAP 法）試劑盒 上海泰坦科技股份有限公司；羥自由基清除率檢測試劑盒上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶 上海恩拿馬生物技術(shù)有限公司；其他分析純化學(xué)試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BJ-800A 粉碎機(jī) 湖州德清百捷電器有限公司；LRH-150 培養(yǎng)箱、HWS24 型恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THC 型數(shù)控超聲波提取儀 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；LegendMicro17高速離心機(jī)、Multiskan FC 酶標(biāo)儀 德國Thermo Fisher 公司；THE01504B ATC 手持糖度計 深圳市雅戈科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥與黑大麥復(fù)合發(fā)酵基本工藝流程 藜麥與黑大麥按比例混勻→酶解糖化→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→復(fù)合谷物發(fā)酵物。

谷物前處理：將藜麥與黑大麥除雜，粉碎過80 目篩，在4 ℃冰箱密封保藏備用。

酶解糖化：將上述除雜粉碎后的藜麥與黑大麥按照一定比例混勻，按照不同料液比加入純水，在70 ℃條件下加入α-淀粉酶（10 U/g）酶解40 min 至糖度值達(dá)到12%后滅菌。

菌種活化與接種：從保存Lactobacillus kisonensis菌種（Lk）的甘油管中吸取30 μL 菌液，加入到1.4 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h 活化，制成9.0×108CFU/mL 的活化菌株。將活化好的菌株按一定接種量接種至上述滅菌的藜麥與黑大麥培養(yǎng)基中，同時用等量無菌水代替活化菌株加入到滅菌的谷物培養(yǎng)基中作為對照組（未發(fā)酵組），其余所有條件同發(fā)酵組。

發(fā)酵：在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵一定時間得到復(fù)合谷物發(fā)酵物。

1.2.2 藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵工藝單因素實驗

以原料比（藜麥:黑大麥）、料液比、接種量、發(fā)酵時間為優(yōu)化參數(shù)，以多酚和黃酮含量為考察指標(biāo)，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素實驗。

1.2.2.1 原料比（藜麥：黑大麥）的確定 控制料液比1:7、接種量3%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度30 ℃，研究不同原料比（即藜麥：黑大麥分別為5:1、3:1、1:1、1:3、1:5）對多酚和黃酮含量的影響。

1.2.2.2 接種量的確定 控制原料比（藜麥:黑大麥）1:1、料液比1:7、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度30 ℃，研究不同接種量（1%、2%、3%、5%、7%）對多酚和黃酮含量的影響。

1.2.2.3 發(fā)酵時間的確定 控制原料比（藜麥:黑大麥）1:1、料液比1:7、接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃，研究不同發(fā)酵時間（12、24、36、48、60 h）對多酚和黃酮含量的影響。

1.2.2.4 料液比的確定 控制原料比（藜麥:黑大麥）1:1、接種量2%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度30 ℃，研究不同料液比（1:3、1:5、1:7、1:9、1:11）對多酚和黃酮含量的影響。

1.2.3 藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在上述各單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 模型的中心組合實驗設(shè)計原理，分別選用原料比（3:1、1:1、1:3）、接種量（1%、2%、3%）、發(fā)酵時間（24、36、48 h）和料液比（1:7、1:9、1:11）作為具有顯著影響的四個單因素為自變量，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗，并以多酚（Y1）和黃酮（Y2）含量為響應(yīng)變量。響應(yīng)面試驗因素和水平設(shè)計詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Design of response surface experiment

1.2.4 藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵與兩種谷物分別單獨發(fā)酵效果比較 采用1.2.2 及1.2.3 單因素實驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化后的工藝條件，分別單獨發(fā)酵藜麥和發(fā)酵黑大麥，與藜麥和黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵相比，探究復(fù)合谷物發(fā)酵對多酚、黃酮的富集作用、生物有效性及抗氧化活性的影響。

1.2.5 藜麥與黑大麥復(fù)合發(fā)酵谷物體外模擬胃腸消化過程 體外模擬消化模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[16]中的方法并做修改，包括口腔消化、胃消化和小腸消化三個階段。

口腔消化：取發(fā)酵谷物60 g，用60 mL 無菌蒸餾水溶解，混勻，加入10 mgα-淀粉酶（提前溶解在1.0 mL CaCl2溶液（1 mmol/L），pH7.0），37 ℃搖床培養(yǎng)20 min 后即得到口腔消化液，用于后續(xù)胃消化。

胃消化：取上述口腔消化液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2.0，加入模擬胃液（0.54 g 蛋白酶提前溶于5 mL 0.24 mol/L 鹽酸中），37 ℃恒溫水浴振蕩器培養(yǎng)2 h，分別于1、2 h 取部分樣品作為模擬胃消化液（胃消化組），其余用于小腸消化。

小腸消化：取上述胃消化液，用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 至6.8，加入10 mL 模擬腸液（含0.11 g 胰酶和0.70 g 豬膽鹽的NaHCO3溶液（0.5 mol/L）），混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，分別于1、2 h 取部分樣品作為模擬小腸消化液（腸消化組）。

以上所取樣品均于4 ℃、10000 r/min 離心20 min，取上清液，貯存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)分析。

1.2.6 多酚含量的測定

1.2.6.1 游離酚的提取 參考王彩霞等[17]的方法并稍作修改：取1.2.5 中部分體外消化液（取樣均勻），按照料液比1:10（g/mL）加入80%乙醇，200 W、30 ℃條件下超聲提取30 min，8000 r/min 離心10 min，收集上清，得到游離酚提取液，-20 ℃保存用于后續(xù)分析。

1.2.6.2 結(jié)合酚的提取 參考Fuentealba 等[18]的方法并稍作修改：將上述1.2.6.1 中得到的殘渣收集，懸浮在2 mol/L 氫氧化鈉溶液中（料液比1:10（g/mL）），60 ℃、200 W 條件下超聲提取60 min，堿水解完成后，用酸調(diào)節(jié)pH 至2.0，8000 r/min 離心10 min，取上清液，即得到結(jié)合酚提取液，-20 ℃保存用于后續(xù)分析。

1.2.6.3 多酚含量測定 多酚含量按照聶攀等[15]的方法，利用Folin-Ciocalteu 比色法進(jìn)行測定。以沒食子酸（GAE）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每100 g樣品中GAE 當(dāng)量表示，單位為mg GAE/100 g。

1.2.7 黃酮含量測定 黃酮含量按照聶攀等[15]的方法，利用AlCl3比色法進(jìn)行測定。以蘆?。≧E）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每100 g 樣品中RE 當(dāng)量表示，單位為mg RE/100 g。

1.2.8 多酚類物質(zhì)的生物有效性 生物有效性指數(shù)表示經(jīng)過模擬胃腸道消化后能進(jìn)入體循環(huán)中被利用的酚類化合物的量[19]，其計算公式如下[20]：

試驗結(jié)果(表2)表明，各組合對粗糠樹莖干重、根干重的影響差異很大，種實混沙漚制，10月15日在露地營養(yǎng)袋播種(處理4)的莖干重(25.625 g)、根干重(8.157 g)最高。

1.2.9 體外抗氧化活性的測定

1.2.9.1 總抗氧化活力測定 總抗氧化活力按照FRAP 試劑盒方法說明進(jìn)行測定。主要步驟如下：新鮮配制含150 μL 2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）稀釋液、15 μL TPTZ 溶液和15 μL 緩沖液 的FRAP工作液，并在37 ℃下保溫。將體外模擬消化樣品稀釋2 倍后，取5 μL 與180 μL FRAP 工作液混合，并在37 ℃下孵育5 min。利用酶標(biāo)儀在593 nm 處測吸光度。結(jié)果以FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)液的濃度來表示。（以0.1 mmol/L Trolox 為陽性對照）。

1.2.9.2 羥基自由基清除能力的測定 羥基自由基清除能力的測定依照羥基自由基試劑盒方法說明進(jìn)行。主要步驟如下：將體外模擬消化樣品稀釋2 倍后取400 μL，依次按照試劑盒說明加入試劑，并在37 ℃下孵育1 h。利用酶標(biāo)儀在540 nm 處測吸光度A，按照試劑盒公式計算羥自由基清除率（以0.11 mg/mL 抗壞血酸為陽性對照）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析（one-way ANOVA）通過LSD 多重比較分析各組平均值之間的差異（SPSS Statistics 21），P＜0.01 和P＜0.05 分別表示差異極顯著和差異顯著。應(yīng)用GraphPad Prism 8.2.1 軟件作圖，利用R 4.3.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析并作圖，以上實驗均重復(fù)三次，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵工藝單因素實驗結(jié)果

2.1.1 原料比（藜麥：黑大麥）對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響 藜麥與黑大麥配比對多酚和黃酮含量的影響如圖1 所示。在本研究范圍內(nèi)，隨著藜麥：黑大麥配比的升高，多酚和黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當(dāng)原料比分別為1:1 和1:3 g/g 時，對多酚和黃酮的富集效果分別達(dá)到最佳（多酚和黃酮含量分別為304.83 mg/100 g 和261.68 mg/100 g）。這可能是因為在該原料比下，復(fù)合谷物的營養(yǎng)成分組成及含量更均衡，可為乳酸菌的生長代謝提供足夠的營養(yǎng)保障，使其能分泌更多代謝相關(guān)的酶[21]，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物（多酚及黃酮物質(zhì)）的生成[22]。當(dāng)原料比由1:1 調(diào)整為1:3 時，多酚含量會發(fā)生顯著性降低（P＜0.05），但對黃酮的含量無顯著性影響（P＞0.05），考慮到本研究以多酚和黃酮同時富集作為優(yōu)化指標(biāo)，故而選擇原料比1:1 作為后續(xù)實驗參數(shù)。

圖1 原料比（藜麥:黑大麥）對復(fù)合谷物發(fā)酵多酚和黃酮含量的影響Fig.1 Effects of raw material ratio (quinoa:black barley) on contents of polyphenols and flavonoids in co-fermented grains

2.1.2 接種量對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響 接種量對多酚和黃酮含量的影響如圖2 所示。在本研究范圍內(nèi)，發(fā)酵能顯著提高復(fù)合谷物中多酚和黃酮的含量（P＜0.05），且隨著接種量的增加，多酚和黃酮含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并分別于接種量3%和2%條件下達(dá)到最大值（多酚和黃酮含量分別為295.92 mg/100 g 和216.90 mg/100 g）。這是因為乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生豐富的酶系，其中，纖維素酶、多酚酯酶等可使谷物細(xì)胞壁裂解，促進(jìn)多酚和黃酮類物質(zhì)的釋放[23-25]。此外，通過乳酸菌適當(dāng)發(fā)酵，還能在微生物酶的作用下利用酪氨酸和苯丙氨酸等組分合成多酚和黃酮等次級代謝產(chǎn)物[26-27]。但當(dāng)接種量過高時，會導(dǎo)致發(fā)酵菌體數(shù)量過高，產(chǎn)生競爭抑制，反而不利于菌體的生長代謝，導(dǎo)致多酚和黃酮等次級代謝產(chǎn)物合成減少[27]。當(dāng)接種量從2%增加到3%時，多酚含量未顯著增加（P＞0.05），但黃酮含量卻顯著降低（P＜0.05），故選擇接種量2%作為后續(xù)單因素實驗參數(shù)。

圖2 接種量對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on the contents of polyphenols and flavonoids in combined fermented grains

2.1.3 發(fā)酵時間對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響 發(fā)酵時間對多酚和黃酮含量的影響如圖3 所示。由圖3 可知，在本研究范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，復(fù)合發(fā)酵谷物中多酚黃酮的含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間分別為48 h 和36 h 時，多酚和黃酮含量達(dá)到最大值，分別為285.79 和263.78 mg/100 g。發(fā)酵初期，由于發(fā)酵時間過短（≤12 h），植物乳桿菌生長不充分，次級代謝產(chǎn)物合成量較低；隨著發(fā)酵時間的延長，多酚含量在12～48 h 內(nèi)有升高的趨勢但并不顯著，黃酮含量在12～36 h 內(nèi)則顯著升高（P＜0.05）。這是因為隨著發(fā)酵時間的延長，植物乳桿菌數(shù)量增多，可充分利用復(fù)合谷物中多糖、酪氨酸和苯丙氨酸等營養(yǎng)成分，代謝產(chǎn)生多酚和黃酮等次級代謝產(chǎn)物，同時生長旺盛的發(fā)酵菌體能分泌次級代謝產(chǎn)物合成的酶，可在一定程度上促進(jìn)多酚和黃酮等成分的釋放[27]；但另一方面可能存在某些酚類物質(zhì)被乳酸菌利用或與其他物質(zhì)相互作用被破壞，導(dǎo)致酚類物質(zhì)含量減少，從而使得酚類物質(zhì)含量并未顯著提高。隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長，植物乳桿菌的生長進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量減少，菌體內(nèi)的多種酶（如多酚氧化酶）被釋放出來，造成多酚和黃酮氧化、消化與降解[28]。因此，選用36 h 發(fā)酵時間作為后續(xù)單因素實驗參數(shù)。

圖3 發(fā)酵時間對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on the contents of polyphenols and flavonoids in combined fermented grains

2.1.4 料液比對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響 料液比對多酚和黃酮含量的影響如圖4 所示。由圖可知，在本研究范圍內(nèi)，隨著料液比的升高，復(fù)合發(fā)酵谷物中多酚和黃酮的含量總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在料液比為1:9 g/mL 時達(dá)到最大值，含量分別為332.76 和214.33 mg/100 g。發(fā)酵過程中，乳酸菌生長代謝需要適宜的底物濃度，當(dāng)料液比較低時，由于水分少導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)粘度增大，不利于營養(yǎng)成分的擴(kuò)散、吸收和利用，使得菌體生長受限，使多酚和黃酮等次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較少[28]；當(dāng)料液比很高時，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度下降，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，多酚和黃酮的含量降低。因此，合適的料液比可以更好地為乳酸菌的生長繁殖提供適宜的環(huán)境條件，從而促進(jìn)多酚和黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累[29]。

圖4 料液比對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the contents of polyphenols and flavonoids in combined fermented grains

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析 藜麥和黑大麥復(fù)合發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果如表2 所示。通過Design-Expert 軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型擬合，得到復(fù)合谷物發(fā)酵液多酚含量（Y1）和黃酮含量（Y2）與原料比（A）、料液比（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）四個因素之間的多元二次回歸模擬方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

為檢驗?zāi)M方程的有效性，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析及顯著性分析，結(jié)果如表3 和表4 所示。由表3 可知，Y1模型中，一次項A、B 對多酚富集效果的影響極顯著（P＜0.01），C 對多酚富集效果的影響顯著（P＜0.05）；交互項CD 的影響效果達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；二次項中，各因素的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。此外由F值可知，各因素對復(fù)合谷物發(fā)酵多酚富集效果影響的重要順序依次為：A＞B＞C＞D；該模型顯著性檢驗P＜0.01，且失擬項（即所用模型與實驗擬合的程度）對應(yīng)的P值為0.1292＞0.05，差異不顯著；該模型的決定系數(shù)R2為0.9497，校正系數(shù)R2Adj為0.8958，變異系數(shù)CV 為0.7325%，說明該模型具有很好的穩(wěn)定性，實際值與預(yù)測值具有較好的擬合相關(guān)性。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果（多酚，Y1）Table 3 ANOVA results of response surface regression model(polyphenols,Y1)

表4 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果（黃酮,Y2）Table 4 ANOVA results of response surface regression model(flavonoids,Y2)

由表4 可知，在Y2模型中，一次項A、B 和C 對黃酮富集效果均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），D 為顯著水平（P＜0.05）；交互項AC 的影響效果為極顯著水平（P＜0.01），BC 和BD 則為顯著水平（P＜0.05）；二次項中，A2、B2和C2對黃酮的富集效果影響極顯著（P＜0.01）；由F值可知，各因素對復(fù)合谷物發(fā)酵富集黃酮效果影響的重要性次序也為：A＞B＞C＞D；該模型顯著性檢驗P＜0.01，且失擬項（即所用模型與實驗擬合的程度）對應(yīng)的P值為0.2713＞0.05，差異不顯著；該模型的決定系數(shù)R2=9631，校正系數(shù)R2Adj=0.9262，變異系數(shù)CV 為0.8137%，說明該模型的擬合度較好，實際值與預(yù)測值具有較好的擬合相關(guān)性。綜上，上述模型Y1與Y2對藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵后多酚和黃酮的富集效果分析具有實際應(yīng)用價值。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 固定其他因素，以觀察各因素之間的交互作用對復(fù)合發(fā)酵谷物多酚和黃酮含量的影響，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行二次多元擬合，繪出響應(yīng)面圖和對應(yīng)的等高線圖，其中具有顯著性作用的結(jié)果如圖5 和圖6 所示。

圖5 接種量與發(fā)酵時間交互作用對藜麥與黑大麥復(fù)合發(fā)酵后多酚富集效果的影響Fig.5 Effects of interaction between inoculum volume and fermentation time on polyphenols enrichment after co-fermentation of quinoa and black barley

圖6 不同因素間交互作用對復(fù)合發(fā)酵藜麥與黑大麥黃酮富集效果的影響Fig.6 Effects of interaction of different factors on flavonoid enrichment of quinoa and barley in complex fermentation

由圖5 可以看出，接種量與發(fā)酵時間交互作用下呈現(xiàn)的坡面較陡峭，等高線呈近橢圓狀，表明二者交互作用對復(fù)合發(fā)酵谷物中的多酚富集效果影響顯著（P＜0.05）。由圖6 可以看出，AC（接種量的坡面陡峭、原料比曲面不平滑）、BC（料液比與接種量的坡面陡峭）、及BD（料液比的坡面較為陡峭、發(fā)酵時間的曲線不平滑）交互作用可以看出，對應(yīng)的等高線呈橢圓狀或近橢圓狀，表明原料比與接種量、料液比與接種量、料液比與發(fā)酵時間的交互效應(yīng)對黃酮富集效果影響顯著（P＜0.05）。上述結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 優(yōu)化發(fā)酵工藝的驗證 根據(jù)單因素和響應(yīng)面實驗結(jié)果選擇最優(yōu)工藝參數(shù)：即通過比較與平衡多酚和黃酮富集效果及對應(yīng)的優(yōu)化條件，最終確定有利于二者富集的復(fù)合谷物發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)：原料比1:2.4（g/g）、料液比1:8.9（g/mL）、接種量2.0%、發(fā)酵時間36.7 h。在該條件下多酚含量和黃酮含量分別達(dá)到最優(yōu)值370.67 和264.39 mg/100 g。經(jīng)驗證試驗得到藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵多酚和黃酮含量分別為364.90 和264.35 mg/100 g（表5），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.10%和0.01%。表明此次建立的響應(yīng)面模型在利用藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵富集多酚和黃酮具有較好的實際應(yīng)用價值。

表5 藜麥、黑大麥單獨發(fā)酵與復(fù)合發(fā)酵藜麥與黑大麥多酚和黃酮富集效果對比Table 5 Comparison of polyphenols and flavonoids enrichment effect between quinoa and black barley fermentation alone and quinoa-black barley combined fermentation

在上述最佳發(fā)酵工藝條件下，與單獨發(fā)酵藜麥和黑大麥相比，復(fù)合谷物發(fā)酵后多酚含量分別提高了35.73%和34.39%（P＜0.05），黃酮含量分別提高了25.70%和21.73%（P＜0.05）（表5）。此外，與發(fā)酵前相比，利用植物乳桿菌發(fā)酵可使藜麥、黑大麥和藜麥與黑大麥復(fù)合谷物中多酚含量分別提高 24.95%、25.23%和55.65%（P＜0.05）；單獨發(fā)酵藜麥和黑大麥其黃酮含量較發(fā)酵前變化并不顯著（P＞0.05），但藜麥與黑大麥復(fù)合發(fā)酵后黃酮含量較發(fā)酵前提高了25.90%（P＜0.05）。說明藜麥與黑大麥復(fù)合谷物發(fā)酵富集多酚和黃酮效果更顯著。這可能得益于復(fù)合谷物中營養(yǎng)組分較單一谷物更均衡，為植物乳桿菌的生長提供更充足的養(yǎng)分，有利于多酚和黃酮等次級代謝產(chǎn)物的累積，但具體代謝機(jī)制尚有待于深入研究。

2.3 體外模擬消化過程中復(fù)合發(fā)酵谷物酚類物質(zhì)的釋放及生物有效性分析

2.3.1 酚類物質(zhì)的釋放 已有研究表明胃、腸道消化酶可促進(jìn)谷物酚類物質(zhì)的釋放，這是由于谷物中的酚類物質(zhì)大多以糖苷鍵、酯鍵等形式與蛋白質(zhì)、淀粉、多糖等大分子結(jié)合，在α-淀粉酶、胃酸、胃蛋白酶（可水解多糖羧基）、胰酶（可水解淀粉糖苷鍵和蛋白質(zhì)酯鍵）等的作用下，被逐漸水解釋放出來[30]，與本研究谷物體外消化過程中游離酚的變化趨勢相一致（圖7A）。此外，隨著消化過程（0～4 h）的進(jìn)行，復(fù)合發(fā)酵谷物消化液中游離酚含量均顯著高于未發(fā)酵谷物和單獨發(fā)酵谷物組（P＜0.05），表明復(fù)合發(fā)酵谷物可以促進(jìn)游離酚的合成代謝以及酚類物質(zhì)的釋放。

圖7 體外模擬胃腸道消化過程谷物酚類物質(zhì)釋放情況Fig.7 Release of polyphenols from grains during simulated gastrointestinal digestion in vitro

結(jié)合酚是谷物多酚重要的存在形式，由圖7B 可看出，與未發(fā)酵谷物相比，發(fā)酵能顯著提高谷物結(jié)合酚的含量（P＜0.05），且復(fù)合發(fā)酵谷物較單獨發(fā)酵藜麥可更顯著富集結(jié)合酚（P＜0.05），與單獨發(fā)酵黑大麥相比呈增加趨勢，但差異基本不顯著。在體外消化的不同階段，谷物消化液中結(jié)合酚釋放量略呈增加趨勢，但差異并不顯著，說明消化過程中結(jié)合酚的釋放有限。這一方面可能是由于在胃腸道消化過程中，少部分游離酚與食物基質(zhì)中大分子互作結(jié)合，形成結(jié)合酚，導(dǎo)致結(jié)合酚含量升高[31-32]；但另一方面，胃腸道消化過程中釋放出來的部分結(jié)合酚對消化酶或胃腸道環(huán)境敏感，會被降解破壞，導(dǎo)致其含量降低[33]。在兩者的共同影響下，使得在消化過程中結(jié)合酚的釋放量未顯著提高。

由圖7C 可知，隨著胃腸道消化過程的進(jìn)行，消化液中總酚含量逐漸增加，這是由于在消化過程中，各種胃腸道消化酶和膽鹽的作用下細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，促使酚類物質(zhì)被釋放出來。另外，復(fù)合發(fā)酵谷物在體外消化各階段總酚含量均顯著高于單獨發(fā)酵谷物組（P＜0.05）。

2.3.2 酚類物質(zhì)的生物有效性 谷物中酚類物質(zhì)的生物有效性分析結(jié)果如圖8 所示。由圖8A 和圖8C 可知，隨著消化過程的進(jìn)行，谷物游離酚和總酚的體外生物有效性均較消化前顯著增強(qiáng)（P＜0.05），與已有研究結(jié)果一致[34]。這是因為在胃腸道消化過程中，酚類物質(zhì)從食物基質(zhì)中被釋放游離出來，使生物有效性得到提高[35]。但本研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵谷物相比，單獨發(fā)酵藜麥和黑大麥中的游離酚生物有效性顯著降低（P＜0.05），總酚的生物有效性變化趨勢與游離酚相近。而與單獨發(fā)酵谷物不同，復(fù)合發(fā)酵谷物中游離酚和總酚的生物有效性均未顯著降低的現(xiàn)象（P＞0.05），在部分消化階段其游離酚和總酚的生物有效性還高于未發(fā)酵組，說明與單一發(fā)酵谷物相比，復(fù)合發(fā)酵谷物能在一定程度上改善酚類物質(zhì)的生物有效性，其機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。另外，由圖8B 可知，谷物經(jīng)體外消化前后其結(jié)合酚生物有效性無顯著變化（P＞0.05）；谷物發(fā)酵前后其結(jié)合酚的生物有效性也無顯著變化（P＞0.05），與結(jié)合酚在消化過程中的釋放情況相一致。

圖8 體外模擬胃腸道消化過程谷物酚類物質(zhì)的生物有效性Fig.8 Bioavailability of polyphenols in grains during in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.4 復(fù)合發(fā)酵谷物的抗氧化活性

2.4.1 體外模擬消化過程中復(fù)合發(fā)酵谷物抗氧化活性的變化 藜麥與黑大麥復(fù)合發(fā)酵谷物在體外模擬消化過程中抗氧化活性的變化如圖9 所示。由圖可知，隨著胃腸道消化過程的進(jìn)行，各發(fā)酵谷物總抗氧化能力和羥基自由基清除能力均逐漸增強(qiáng)。與未發(fā)酵谷物組相比，各谷物發(fā)酵后其總抗氧化能力和羥基自由基清除能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這與已有研究關(guān)于發(fā)酵小米體外消化抗氧化活性變化趨勢一致[36]。另外，與單一谷物發(fā)酵相比，由于復(fù)合谷物發(fā)酵能更有效地富集多酚和黃酮類物質(zhì)，其總抗氧化能力和羥基自由基清除能力也顯著提高（P＜0.05）。

圖9 體外模擬胃腸道消化過程中谷物抗氧化活性變化情況Fig.9 Changes of antioxidant capacity of grains during in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.4.2 復(fù)合發(fā)酵谷物抗氧化活性與酚類物質(zhì)的相關(guān)性分析 為明確酚類物質(zhì)對發(fā)酵谷物抗氧化活性的影響，本研究進(jìn)一步對二者進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖10 所示?？煽闯?，谷物游離酚和總酚含量與其總抗氧化活性呈顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)大于0.7），與之前的研究結(jié)果相一致，提示游離酚可能較結(jié)合酚具有更顯著的抗氧化活性[37]。這可能由于游離酚較結(jié)合酚能更有效地捕捉自由基，從而表現(xiàn)出較高的抗氧化活性；而結(jié)合酚與其他生物大分子結(jié)合，使得抗氧化活性受到限制。

圖10 發(fā)酵谷物酚類物質(zhì)含量與其抗氧化活性相關(guān)性熱圖Fig.10 Heat map of correlation between polyphenols content of fermented grains and their antioxidant activity

3 結(jié)論

本研究以藜麥和黑大麥為原料，利用植物乳桿菌進(jìn)行復(fù)合谷物發(fā)酵。通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗建立了可有效富集多酚和黃酮的復(fù)合谷物發(fā)酵工藝條件：原料比1:2.4（g/g）、料液比1:8.9（g/mL）、接種量2.0%、發(fā)酵時間36.7 h，在該條件下，多酚和黃酮的含量分別達(dá)到364.90 mg/100 g 和264.36 mg/100 g，富集效果顯著優(yōu)于單獨發(fā)酵谷物組；此外，谷物復(fù)合發(fā)酵還能顯著促進(jìn)游離酚和總酚物質(zhì)的釋放，改善酚類物質(zhì)的生物有效性，增加復(fù)合發(fā)酵谷物的體外抗氧化活性。在已有單一谷物發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，明確了發(fā)酵用復(fù)合谷物基料種類對多酚等功能活性成分富集及生物有效性的影響，研究可為谷物發(fā)酵食品工藝優(yōu)化和功能性全谷物食品的開發(fā)和利用提供了可參考的數(shù)據(jù)。本研究借助體外實驗初步分析了復(fù)合發(fā)酵谷物中多酚的生物利用度和抗氧化活性，但其在體內(nèi)的實際消化吸收利用情況及抗氧化活性的發(fā)揮尚有待于通過動物和人群實驗進(jìn)一步研究。