骨髓脂代謝紊亂與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系及臨床意義研究

張靖嬪，羅錦輝，邱明林

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的慢性骨病，是骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)升高的重要因素之一［1］。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，OP 在各個(gè)人群中都可能發(fā)生，我國50 歲以上人群OP 患病率女性為20.7%，男性為14.4%，但絕經(jīng)后女性和老年男性的OP 發(fā)病率明顯升高［2-5］。近年來，隨著我國老齡人口的比例增加，OP 已成為老年人群致殘和致死的主要危險(xiǎn)因素之一，同時(shí)嚴(yán)重影響老年人群的生活質(zhì)量，因此，OP 的治療和預(yù)防已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生和臨床醫(yī)學(xué)問題［6］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，OP 發(fā)病機(jī)制研究和治療方案有了長(zhǎng)足進(jìn)步，然而其發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確，為OP 的精準(zhǔn)治療和個(gè)性化預(yù)防方案的制定造成一定的阻礙。因此，積極探索OP的發(fā)病機(jī)制仍是該領(lǐng)域重要的熱點(diǎn)問題和戰(zhàn)略任務(wù)之一。

近年來，相關(guān)研究顯示，骨量減少或OP 與骨髓脂代謝紊亂常存在普遍的并存現(xiàn)象，二者深層關(guān)系也受到越來越多的關(guān)注［7-9］。脂代謝涵蓋的指標(biāo)較多，脂代謝異常的定義也比較廣泛。脂代謝紊亂是高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的直接危險(xiǎn)因素。目前研究認(rèn)為，高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病與OP 具有密切聯(lián)系，提示（骨髓）脂代謝紊亂可能是OP 的間接危險(xiǎn)因素［10-11］。另有證據(jù)表明脂代謝紊亂可以直接導(dǎo)致骨髓脂肪增多，進(jìn)而引起骨髓微循環(huán)障礙和骨量減少，這即為骨髓脂代謝紊亂形成的基本過程［12-14］。但上述OP 與脂代謝關(guān)系的機(jī)制假說仍需進(jìn)一步深入證實(shí)。

為進(jìn)一步探明骨髓脂代謝紊亂對(duì)OP 發(fā)生和發(fā)展的影響和作用機(jī)制，本研究利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)，分析脂代謝相關(guān)基因在OP 患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因組學(xué)范圍內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)，了解骨髓脂代謝紊亂對(duì)OP 影響及臨床意義，為OP 的預(yù)防和治療提供基因組學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源 在美國國立生物技術(shù)信息中心GEO 數(shù)據(jù)庫下載獲得基因芯片數(shù)據(jù)GSE35959（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE35959），該數(shù)據(jù)集研究設(shè)計(jì)類型為病例對(duì)照研究，標(biāo)本來源為與OP 關(guān)系緊密的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本研究將標(biāo)本分為2 組，OP 組（n=5）和健康對(duì)照組（n=14）。OP 組共5 例，其中男性2 例，女性3 例，年齡（86.20 ± 5.66）歲；健康對(duì)照組共14 例，其中男性2 例，女性12 例，年齡（64.07 ±13.90）歲。

1.2 差異表達(dá)基因分析 采用R 軟件（4.1.3 版）的Limma 包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；然后獲得原發(fā)性O(shè)P 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes， DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)為llog2Fold Changel＞ 2，F(xiàn)DR＜0.05。

1.3 人類脂代謝基因的獲取 從Molecular Signature Database v5.1（MSigDB）中綜合收集751 個(gè)脂代謝相關(guān)基因。然后與OP 的DEGs 取交集，獲得OP患者差異表達(dá)的脂代謝基因列表。

1.4 富集分析 本研究使用R 軟件在KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取最新的KEGG Pathway 和GO 注釋，以此作為背景，將OP 脂代謝基因集映射到背景集合中，使用R 軟件包c(diǎn)luster Profiler 進(jìn)行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，F(xiàn)DR＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的建立 將OP 差異表達(dá)的脂代謝基因列表上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，信度參數(shù)設(shè)定為0.700。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中重要的HUB 蛋白（互作關(guān)系≥5 的節(jié)點(diǎn)），采用受試者操作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲線分析評(píng)估HUB 蛋白鑒別診斷OP 的敏感度和特異度，并采用Pearson 相關(guān)性分析上述重要HUB 蛋白表達(dá)在OP 患者中是否具有關(guān)聯(lián)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 分析 與健康對(duì)照組相比，在OP 患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，共鑒定出2 105 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因1 940 個(gè)，下調(diào)基因165 個(gè)，火山圖和聚類熱圖見圖1A、1B。在2 105 個(gè)OP-DEGs 中，共有75 個(gè)與脂代謝相關(guān)的DEGs，見圖1C。

圖1 OP 患者間充質(zhì)干細(xì)胞DEGs 的篩選和表達(dá)模式

2.2 OP 脂代謝相關(guān)基因的富集分析 OP 脂代謝相關(guān)基因的GO 富集分析結(jié)果顯示：OP 脂代謝相關(guān)基因參與機(jī)體的各種脂代謝過程，包括細(xì)胞脂代謝、小分子脂代謝、脂質(zhì)合成、脂肪酸代謝等過程。由此可見，OP 脂代謝相關(guān)基因參與機(jī)體脂代謝的途徑復(fù)雜、精細(xì)，值得進(jìn)一步證實(shí)。KEGG富集分析結(jié)果表明，OP 脂代謝相關(guān)基因主要涉及花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、PPAR 信號(hào)通路、α-亞麻酸代謝、醚脂代謝、卵巢類固醇生成、膽固醇代謝、亞油酸代謝、甘油脂代謝等信號(hào)通路。見圖2。

圖2 OP 脂代謝相關(guān)基因的富集分析結(jié)果

2.3 OP 脂代謝相關(guān)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)的建立 PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含75 個(gè)節(jié)點(diǎn)，65 條互作關(guān)系（P＜0.01）；其中互作關(guān)系≥5 的節(jié)點(diǎn)為7 個(gè)，分別為HELZ2、CYP4A11、ALOX5、PTGS2、CYP4F2、ALOX12B、FABP4，互作關(guān)系最多的為HELZ2。OP 脂代謝相關(guān)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3。

圖3 OP 脂代謝相關(guān)基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 HUB 脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平 OP 患者7 個(gè)HUB 基因的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示OP 患者的脂代謝水平存在升高的趨勢(shì)。OP 脂代謝相關(guān)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的7 個(gè)HUB 脂代謝基因的表達(dá)水平分析見圖4。

圖4 OP 脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平比較

2.5 OP 脂代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析 OP 脂代謝相關(guān)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的7 個(gè)HUB 基因與OP 患者的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ALOX5 基因與HELZ2 基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 OP 脂代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析

2.6 脂代謝相關(guān)基因?qū)P 的鑒別 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的7 個(gè)HUB 基因鑒別OP 的ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，HELZ2、CYP4A11、ALOX5、PTGS2、CYP4F2、ALOX12B、FABP4 基因?qū)P 均具有一定的鑒別意義，曲線下面積均＞0.8，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6 和表1。

表1 OP 脂代謝相關(guān)基因鑒別OP 的ROC 曲線各指標(biāo)

圖6 OP 脂代謝相關(guān)基因鑒別OP 的ROC 曲線

3 討論

OP 是一種慢性全身性骨骼疾病，其病理特征為骨量減少、骨密度降低及骨微觀結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。目前，全球OP 患者超過2 億人，其發(fā)病率位居常見病的第7 位，已成為世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題［4,15-17］。OP 成為我國第4 大常見慢性病，其發(fā)病率和患者人數(shù)均隨人口老齡化趨勢(shì)而升高［6］。據(jù)調(diào)查，我國50 歲以上人群中，約40%的女性和13% 的男性在其老齡階段至少發(fā)生1 次骨折［18-19］。目前，針對(duì)OP 病因機(jī)制制定的干預(yù)治療方案臨床上已達(dá)成共識(shí)。然而，雖然近年來OP 的治療和預(yù)防手段越來越先進(jìn)，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，影響其防治效果進(jìn)一步改善。因此，OP 的預(yù)防和治療已成為醫(yī)務(wù)工作者重要的工作任務(wù)之一。

目前，對(duì)OP 發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生成和功能平衡、雌激素缺乏等方面。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cells， BMSCs）與脂肪細(xì)胞的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。目前，該領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化增速，使骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)目不斷增多，體積逐漸增大，直接導(dǎo)致骨髓腔內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變，造成骨髓脂代謝紊亂；同時(shí)BMSCs 向成骨細(xì)胞的分化減少，破骨細(xì)胞的形成增多和功能活化，二者之間的功能平衡被破壞，最終導(dǎo)致OP［12-13］。另有學(xué)者認(rèn)為，機(jī)體雌激素等水平變化后，可加速運(yùn)動(dòng)員脂肪分解，總膽固醇和三酰甘油水平升高，誘發(fā)高脂血癥，提高OP 發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，這一關(guān)系已得到證實(shí)［10-11,20］。近年來，在臨床上，OP患者常伴有脂代謝紊亂，同時(shí)，部分OP 患者應(yīng)用降血脂藥物的同時(shí)骨密度升高。由上述證據(jù)可見，骨髓脂代謝紊亂在OP 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，仍需深入探索。

本研究基于基因組學(xué)數(shù)據(jù)，采用基因組學(xué)分析技術(shù)，探討了脂代謝基因在OP 患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況，并建立了PPI 網(wǎng)絡(luò)，探討關(guān)鍵基因?qū)P 的指示意義。分析結(jié)果顯示，75 個(gè)脂代謝相關(guān)的基因在OP 患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中異常表達(dá)，提示這些基因參與了OP 患者骨髓脂代謝紊亂過程。此過程中，OP 脂代謝相關(guān)基因主要參與了細(xì)胞脂代謝、小分子脂代謝等更加精細(xì)的脂代謝過程，并涉及甘油磷脂代謝、α-亞麻酸代謝等信號(hào)通路。上述分析結(jié)果提示，骨髓脂代謝紊亂是一個(gè)更加復(fù)雜、精細(xì)的過程，可涉及多條信號(hào)通路。隨后筆者建立了OP 差異表達(dá)的脂代謝相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)為HELZ2，互作關(guān)系≥5 的節(jié)點(diǎn)的蛋白在OP 患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中均呈高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)OP 患者均存在骨髓脂代謝紊亂現(xiàn)象。

HELZ2 基因編碼的蛋白質(zhì)是過氧化物酶體增殖物激活受體α 的核轉(zhuǎn)錄共激活因子，包含一個(gè)鋅指，是一種解旋酶，可能是過氧化物酶體增殖物激活受體α 相互作用復(fù)合物的一部分［21-22］。該蛋白位于OP 脂代謝相關(guān)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)的中心，提示在OP 患者骨髓脂代謝紊亂過程中，可能存在復(fù)雜的氧化應(yīng)激過程。ALOX5 基因編碼的花生四烯酸5-脂氧合酶是炎癥介質(zhì)白三烯和脂氧素生成旁路的一個(gè)起始催化酶［23-25］。OP 患者ALOX5 和HELZ2基因表達(dá)升高，二者存在負(fù)相關(guān)，提示OP 患者骨髓脂代謝紊亂過程是一個(gè)脂氧代謝平衡紊亂的過程，有待進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，OP 患者機(jī)體存在骨髓脂代謝紊亂，脂代謝相關(guān)基因?qū)ι鲜鲞^程具有一定的調(diào)控作用，本研究篩選的7 個(gè)重要的脂代謝相關(guān)基因?qū)P 具有一定的鑒別診斷能力，為OP 的預(yù)防、診斷和治療提供了重要參考。