端粒酶、γ-干擾素、腺苷酸脫氨酶及結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在診斷結(jié)核性和惡性胸腔積液中的作用分析

由振華，黃錦宏，趙云根，顧宇平，程易，凌春華

胸腔積液是胸膜疾病常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，而結(jié)核性胸膜炎和腫瘤均可引起胸腔積液［1］。這2 種疾病的治療方式截然不同，因此胸腔積液的病因診斷對(duì)疾病的治療至關(guān)重要［2］。胸腔積液中是否有結(jié)核分枝桿菌是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其不易檢出，需反復(fù)抽取胸腔積液測(cè)定，患者依從性差［3］。近20 年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，細(xì)胞因子被越來(lái)越多地應(yīng)用于各種疾病的診斷，如感染性疾病、腫瘤及免疫性疾病等。端粒酶是一種備受關(guān)注的腫瘤標(biāo)志物，其在惡性腫瘤組織中的表達(dá)活性明顯增強(qiáng)［4］；γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）是診斷結(jié)核性疾病的重要細(xì)胞因子之一，其可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性而在結(jié)核性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［5］；腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase， ADA）是一種催化腺苷酸脫氨基生成鳥(niǎo)苷的酶，已經(jīng)被用于結(jié)核性胸膜炎的診斷［6］；T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T cell spot test， T-SPOT.TB）對(duì)于各種結(jié)核性疾病的診斷有著極高的敏感度和特異度，已被廣泛應(yīng)用于臨床，是結(jié)核性胸膜炎主要的診斷措施之一［7］。本研究擬選取端粒酶、IFN-γ、ADA 及結(jié)核T-SPOT.TB 4 個(gè)診斷指標(biāo)，探索聯(lián)合應(yīng)用的診斷價(jià)值，以期為胸腔積液的鑒別診斷提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017 年1 月至2020 年12 月在常熟市第二人民醫(yī)院治療的80 例胸腔積液患者作為研究對(duì)象。其中結(jié)核性胸腔積液患者40 例，男性患者17 例，女性患者23 例；年齡30～68 歲［（51.29 ± 6.80）歲］；惡性胸腔積液40 例，男性18 例，女性22 例；年齡33～65 歲［（53.04 ± 6.48）歲］。2 組患者的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核組與腫瘤組患者一般資料比較

1.2 診斷、納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)核性胸膜炎診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》［8］中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中合并肺結(jié)核4 例，其他均為單純結(jié)核性胸膜炎。惡性胸腔積液診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)胸腔穿刺、內(nèi)科胸腔鏡、纖維支氣管鏡等檢查，取得病理組織（包括胸水），送檢病理科，病理組織見(jiàn)癌細(xì)胞，惡性胸腔積液診斷明確，否認(rèn)結(jié)核病史和結(jié)核病接觸史。其中肺腺癌24 例，肺小細(xì)胞癌7 例，肺鱗狀細(xì)胞癌5 例，其他類(lèi)型肺癌4 例 。排除病毒感染者、免疫性疾病患者、嚴(yán)重肝腎功能損害者和孕婦。

1.3 標(biāo)本采集 患者入院24 h 內(nèi)查體和影像學(xué)檢查胸腔積液，治療前空腹抽取患者血液5 ml 和采用胸腔穿刺針抽取積液15 ml，隨后以3 000 r/min 離心10 min，離心半徑為30 cm，取上清液置于-80 °C中備用。并應(yīng)用Ficoll 分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，備用。

1.4 檢測(cè)方法及結(jié)果判定 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析法分別檢測(cè)端粒酶的含量和IFN-γ 的濃度，應(yīng)用比色分析法檢測(cè)ADA 的活性，使用北京百奧萊博科技有限公司提供的試劑盒；應(yīng)用T-SPOT.TB 試劑盒檢測(cè)T-SPOT.TB 陽(yáng)性率，T-SPOT.TB 檢測(cè)原理是檢測(cè)外周血中單個(gè)核細(xì)胞中的效應(yīng)T 細(xì)胞，其判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5 個(gè)時(shí)，任意1 個(gè)試驗(yàn)孔的斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)大于等于6，判為陽(yáng)性；當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10 個(gè)時(shí)，任意1 個(gè)試驗(yàn)孔的斑點(diǎn)數(shù)大于等于陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)的2 倍，判為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，以±s 表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核組與腫瘤組患者胸腔積液中端粒酶、IFNγ、ADA 比較 結(jié)核組和腫瘤組的端粒酶含量分別為（1.46 ± 0.73）×10-3nmol/L 和（3.34 ± 1.72）×10-3nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；結(jié)核組和腫瘤組的IFN-γ 含量分別為（137.44 ± 38.93） U/L和（27.94 ± 8.46） U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)核組和腫瘤組的ADA 含量分別為（68.42 ± 9.58） U/L 和（15.39 ± 4.43） U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)核組與腫瘤組胸腔積液中端粒酶、IFN-γ、ADA 比較（±s）

表2 結(jié)核組與腫瘤組胸腔積液中端粒酶、IFN-γ、ADA 比較（±s）

注：IFN-γ 為γ-干擾素，ADA 為腺苷酸脫氨酶

組別結(jié)核組腫瘤組t 值P 值IFN-γ（ng/L）137.44 ± 38.93 27.94 ± 8.46 17.384＜0.001 ADA（U/L）68.42 ± 9.58 15.39 ± 4.43 31.777＜0.001例數(shù)40 40端粒酶（nmol/L）（1.46 ± 0.73）×10-3（3.34 ± 1.72）×10-3 6.363＜0.001

2.2 腫瘤組與結(jié)核組端粒酶、IFN-γ、ADA 和TSPOT.TB 陽(yáng)性率比較 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，端粒酶濃度小于2.0×10-3nmol/L 則判斷為陰性，結(jié)核組中端粒酶的陰性率（36 例，90.00%）高于腫瘤組（4 例，10.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，IFN-γ 高于100 ng/L 判斷為陽(yáng)性，結(jié)核組中IFN-γ 的陽(yáng)性率（34 例，85.00%）高于腫瘤組（6 例，15.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，ADA 高于45 U/L 判斷為陽(yáng)性，結(jié)核組中ADA 的陽(yáng)性率（36 例，90.00%）高于腫瘤組（5 例，12.50%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；結(jié)核組中T-SPOT.TB 陽(yáng)性35 例，陰性5 例，陽(yáng)性率為87.50%；腫瘤組中T-SPOT.TB 陽(yáng)性3 例，陰性37 例，陽(yáng)性率為7.50%。結(jié)核組T-SPOT.TB 的陽(yáng)性率高于腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)核組與腫瘤組端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 陽(yáng)性率比較［例（%）， n=40］

2.3 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 單項(xiàng)與聯(lián)合檢測(cè)的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分析 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 聯(lián)合檢測(cè)鑒別結(jié)核性胸腔積液與惡性胸腔積液的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度均高于4 項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)。見(jiàn)表4。

表4 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 單項(xiàng)與聯(lián)合應(yīng)用診斷的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度（%）

3 討論

胸腔積液是臨床上常見(jiàn)病、多發(fā)病，如今胸腔積液的鑒別主要是針對(duì)結(jié)核性和惡性胸腔積液［8-9］。結(jié)核性和惡性胸腔積液的治療方案及預(yù)后均有著極大的差別。因此，對(duì)于兩者的鑒別診斷具有重要的臨床意義。目前，細(xì)菌學(xué)檢查是診斷結(jié)核性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，而病理學(xué)檢查是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但是細(xì)菌學(xué)檢查和病理學(xué)檢查均存在陽(yáng)性率低以及檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等不足［10］。因此，本研究聯(lián)合應(yīng)用端粒酶、IFN-γ、ADA、T-SPOT.TB 4 種診斷指標(biāo)來(lái)鑒別2 種胸腔積液，探索聯(lián)合應(yīng)用以上4 種診斷指標(biāo)的診斷試驗(yàn)在鑒別結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的價(jià)值，以期為臨床工作中胸腔積液的鑒別診斷提供幫助。

端粒酶作為一種核糖核酸蛋白酶，可以自身RNA 為模板合成端粒DNA，使得端粒延伸并維持其穩(wěn)定性［11］。端粒酶可將端粒DNA 加至真核細(xì)胞染色體末端，填補(bǔ)因DNA 復(fù)制而損失的端粒，使端粒修復(fù)延長(zhǎng)，可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗，使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒（縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限），從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性、基因組完整和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，其長(zhǎng)度隨著細(xì)胞分裂的進(jìn)行而縮短。然而，端粒酶的活性在腫瘤細(xì)胞中被重新激活，使得腫瘤細(xì)胞可以逃避衰老［12］，從而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的端粒酶成為目前最常用的腫瘤分子標(biāo)志物之一。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組胸腔積液中的端粒酶含量低于腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)端粒酶低于2.0×10-3nmol/L 時(shí)結(jié)果判斷為陰性，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核組和腫瘤組中端粒酶的陰性患者分別為36 例和4 例，結(jié)核組中端粒酶的陰性率高于腫瘤組。劉然等［13］和程江濤等［14］研究均發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸腔積液中端粒酶的含量和陽(yáng)性率低于惡性胸腔積液，與本研究結(jié)果一致。

IFN-γ 屬于一種分泌蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用［15-16］。IFN-γ 主要通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)抗原呈遞及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)殺菌能力而起到抗結(jié)核免疫調(diào)節(jié)的作用。結(jié)核性胸腔積液中IFN-γ 的水平高于非結(jié)核性的胸腔積液。陳林［17］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸腔積液中的IFN-γ 水平高于惡性胸腔積液，IFN-γ 水平對(duì)于結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度為90.3%、特異度為79.5%；孫冰等［18］研究發(fā)現(xiàn)，與包括白細(xì)胞介素6（interleukin-6， IL-6）、IL-4 在內(nèi)的其他6 種細(xì)胞因子相比，IFN-γ 對(duì)結(jié)核性胸腔積液的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度均最高。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組的IFN-γ 水平高于腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)核組IFN-γ 的陽(yáng)性率為85.00%，而腫瘤組的陽(yáng)性率為15.00%，結(jié)核組IFN-γ 的陽(yáng)性率高于腫瘤組，與既往的研究結(jié)果相一致［17］。當(dāng)發(fā)生結(jié)核性胸膜炎時(shí)，結(jié)核抗原的刺激會(huì)引起胸腔積液中CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)明顯增加。CD4+T 細(xì)胞是細(xì)胞因子IFN-γ 的直接來(lái)源，因此，胸腔積液中的IFN-γ 水平明顯增高。

ADA 是一種嘌呤核苷分解代謝中的重要酶類(lèi)，較早應(yīng)用在臨床上診斷結(jié)核性胸膜炎，其在淋巴細(xì)胞尤其是T 淋巴細(xì)胞中含量高于其他細(xì)胞組織［19］。臨床上胸腔積液中ADA 大于40 U/L 提示為結(jié)核性胸腔積液的可能性較高。結(jié)核性胸膜炎的細(xì)胞免疫反應(yīng)以T 淋巴細(xì)胞為主，因此，胸腔積液中ADA的含量可被用于結(jié)核性胸膜炎的診斷［20］。黃曉磊等［21］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸腔積液組患者中ADA 含量高于惡性胸腔積液組，ADA 含量對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度和特異度均達(dá)到了75% 以上。本研究中結(jié)核組患者胸腔積液中的ADA 含量高于腫瘤組，結(jié)核組和腫瘤組胸腔積液中ADA 的陽(yáng)性率分別為90.00% 和12.50%，ADA 在結(jié)核組中的陽(yáng)性率高于腫瘤組。T-SPOT.TB 是一種運(yùn)用IGRA 技術(shù)，檢測(cè)被結(jié)核分支桿菌特異的早期分泌靶抗原6和培養(yǎng)濾液蛋白10 分別刺激后釋放IFN-γ 的效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，以輔助診斷結(jié)核感染的一種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)從單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞的數(shù)量，且不受細(xì)胞因子代謝的干擾。因此，該檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確地反映體內(nèi)細(xì)胞因子的水平。試驗(yàn)結(jié)果用每25 萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目來(lái)判定陰陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)對(duì)斑點(diǎn)形成細(xì)胞的計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)估機(jī)體是否存在結(jié)核桿菌感染，已成為診斷結(jié)核性疾病的重要方法之一。大量研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 對(duì)于肺外結(jié)核的診斷具有高度敏感性，在臨床上具有重要的診斷和鑒別診斷價(jià)值［22-26］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組中患者T-SPOT.T的陽(yáng)性率高于腫瘤組（87.50%vs.7.50%），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)論

端粒酶、IFN-γ、ADA、T-SPOT.TB 的單獨(dú)檢測(cè)在結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液的診斷及鑒別診斷方面具有重要的臨床參考價(jià)值，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4 項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的準(zhǔn)確度、特異度和敏感度均達(dá)到了97.50%，均高于任何一項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度。說(shuō)明四者在鑒別結(jié)核性和惡性胸腔積液中具有互補(bǔ)性，4 項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)核性和惡性胸腔積液鑒別診斷中具有重要價(jià)值，值得臨床推廣。本研究不足之處在于沒(méi)有將其他疾病如心力衰竭、感染、結(jié)締組織病等疾病引起的胸腔積液及其相關(guān)指標(biāo)納入研究檢測(cè)范圍，有待于進(jìn)一步對(duì)其他病因的胸腔積液共同分析，為臨床對(duì)胸腔積液的診斷提供更全面的參考。