異基因造血干細(xì)胞移植患者T 淋巴細(xì)胞亞群與EB 病毒感染的相關(guān)性分析

陳希，金宏飛，吳青，劉靜

淋巴瘤等惡性血液病嚴(yán)重威脅著人們的健康與生存，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， allo-HSCT）逐漸成為治療惡性血液病的有效手段［1］。而移植后的免疫功能重建（immune reconstitution， IR）是影響allo-HSCT 療效的主要因素之一［1-2］，延遲的IR 會(huì)導(dǎo)致移植后感染、疾病復(fù)發(fā)和死亡率增加［3］。Berger 等［4］、Kim 等［5］均報(bào)道過(guò)allo-HSCT 3 個(gè)月后，CD4+T 淋巴細(xì)胞水平升高與患者總體生存率相關(guān)，CD4+T 淋巴細(xì)胞恢復(fù)正常水平的患者非復(fù)發(fā)死亡率降低，機(jī)會(huì)性感染發(fā)生概率下降，提示CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是移植后IR 的重要指標(biāo)。EB 病毒（Epstein-Barr virus， EBV）屬γ皰疹病毒亞科，是唯一能引起人類(lèi)感染的淋巴濾泡病毒，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系，被認(rèn)為是免疫失調(diào)的觸發(fā)點(diǎn)［6-8］。巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus， CMV）屬β 皰疹病毒亞科，也是allo-HSCT患者發(fā)生并發(fā)癥及死亡的主要原因［9］。EBV 和人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）都與機(jī)體的免疫功能相關(guān)，病毒感染陽(yáng)性的allo-HSCT 患者大多存在淋巴細(xì)胞亞群分布不平衡，并且與患者的康復(fù)程度、生存率都密切相關(guān)［10］。最近有研究探討了allo-HSCT 患者的IR 中T 淋巴細(xì)胞亞群的分布和γ 皰疹病毒的感染情況［11］，然而allo-HSCT 患者的T 淋巴細(xì)胞亞群與病毒感染相關(guān)性的研究并不深入。本研究主要分析了allo-HSCT 患者T 淋巴細(xì)胞亞群和病毒感染的相關(guān)性，探討T 淋巴細(xì)胞亞群的變化對(duì)預(yù)測(cè)allo-HSCT 后EBV 感染的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2015 年5 月至2021 年12 月行allo-HSCT 的67 例患者作為研究組，同時(shí)選取54 例造血干細(xì)胞移植供者作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷均符合《血液病診斷療效與標(biāo)準(zhǔn)》［12］；（2）EBV DNA＞4.0×102copies/ml；（3）HCMV DNA＞4.0×102copies/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心肌炎、肝炎等的危急病情；（2）合并自身免疫病等免疫系統(tǒng)疾病。研究組患者年齡（25.00 ± 7.00）歲，其中男性患者43 例，女性患者24 例，原發(fā)病包括急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia， AML）28 例，急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）28 例，骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes， MDS）11 例。對(duì)照組患者年齡（30.00 ±10.00）歲，男性患者34 例，女性患者20 例，各項(xiàng)體檢指標(biāo)均無(wú)明顯異常。2 組患者年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過(guò)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：Y2022215），并通過(guò)免除知情同意申請(qǐng)。

1.2 方法

1.2.1 外周血中性粒細(xì)胞（neutrophil， NEU）與淋巴細(xì)胞（lymphocyte， LYM）的檢測(cè) 將DIFF 溶血?jiǎng)┡c樣本混合后，使用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（BC-6900；邁瑞公司）進(jìn)行檢測(cè)。取患者EDTA-K2抗凝的全血，根據(jù)操作步驟，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 外周血中EBV-DNA 拷貝數(shù)的檢測(cè) 采用圣湘生物科技股份有限公司提供的EBV 熒光定量檢測(cè)試劑盒（PCR 熒光探針?lè)ǎ?，取患者EDTA-K2抗凝的全血800 μl，加入紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻至透明，12 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心3 min，加入生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心3 min，沉淀液中加入400 μl 核酸釋放劑，75 ℃加熱10 min 后備用擴(kuò)增。另外，每批次標(biāo)本同時(shí)擴(kuò)增試劑盒中4 個(gè)病毒陽(yáng)性定量參考品（4×104～4×107），以及陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品，根據(jù)其結(jié)果對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行質(zhì)控，并分析得出所測(cè)樣品中病毒DNA 總含量（用基因copies/ml 表示）。

1.2.3 外周血中HCMV-DNA 拷貝數(shù)的檢測(cè) 采用圣湘生物科技股份有限公司提供的HCMV 熒光定量檢測(cè)試劑盒（PCR 熒光探針?lè)ǎ』颊呱裳苤醒?00 μl，加入等體積濃縮液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μl 核酸釋放劑，與沉淀震蕩或移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，作為待測(cè)樣本備用擴(kuò)增。另外，每批次標(biāo)本同時(shí)擴(kuò)增試劑盒中4 個(gè)病毒陽(yáng)性定量參考品（4×104～4×107），以及陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品，根據(jù)其結(jié)果對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行質(zhì)控，并分析得出所測(cè)樣品中病毒DNA 總含量（用基因copies/ml 表示）。

1.2.4 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取患者EDTA-K2抗凝的全血，T 淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)用免疫熒光單克隆抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞百分比并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用CD3+-FITC、CD4+-APC、CD8+-PE、CD16+-PE、CD56+-PE 熒光抗體，檢測(cè)包括CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞和CD4+/CD8+比值及CD16+CD56+自然殺傷（natural killer， NK）細(xì)胞。CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞正常參考值范圍為31%～60%，CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞正常參考值范圍為13%～41%，CD4+/CD8+比值正常參考值范圍為0.71～2.78，CD16+CD56+NK 細(xì)胞正常參考值范圍為5%～27%。

1.2.5 檢測(cè)試劑 CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System 購(gòu)自Bio-Rad Laboratories， BD MultiTEST IMK Kit 購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson 公司，F(xiàn)ACS Calibur 購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson 公司，溶血素購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson 公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料用±s 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血病毒載量的檢測(cè)

54 例對(duì)照組EBV 感染率為12.96%（7/54），67 例研究組患者EBV 感染率為43.28%（29/67），2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。54 例對(duì)照組HCMV 感染率為1.85%（1/54），67 例研究組患者HCMV 感染率為11.94%（8/67），2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035）。研究組EBV-DNA 載量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。研究組HCMV-DNA 載量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 研究組與對(duì)照組研究對(duì)象一般資料及外周血病毒載量比較

2.2 研究組EBV 感染者與非感染者的免疫激活功能比較

檢測(cè)研究組合并EBV 感染者與非感染者的免疫激活功能的差異性。將研究組患者根據(jù)EBVDNA 檢測(cè)結(jié)果分為EBV 陽(yáng)性組和EBV 陰性組，比較其N(xiāo)EU、LYM 及T 淋巴細(xì)胞亞群水平。研究組EBV 陽(yáng)性組和EBV 陰性組患者外周血NEU 與LYM 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。研究組EBV 陰性組與EBV 陽(yáng)性組患者外周血CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.440，P=0.010；t=3.070，P=0.005）。研究組EBV 陰性組與EBV 陽(yáng)性組患者外周血CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞百分率與CD16+CD56+NK 細(xì)胞百分比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 研究組EBV 陽(yáng)性組與EBV 陰性組患者NEU、LYM 及T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較（±s）

表2 研究組EBV 陽(yáng)性組與EBV 陰性組患者NEU、LYM 及T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較（±s）

注：EBV 為EB 病毒，NEU 為中性粒細(xì)胞，LYM 為淋巴細(xì)胞，NK 細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞

組別EBV 陽(yáng)性組EBV 陰性組t 值P 值CD16+CD56+ NK 細(xì)胞百分比(%)25.07 ± 5.90 18.30 ± 5.30 0.940 0.350例數(shù)29 38 NEU（%）47.92 ± 16.33 52.72 ± 16.95 1.080 0.351 LYM（%）39.91 ± 13.95 36.02 ± 18.30 0.790 0.627 CD3+CD4+ T 淋巴細(xì)胞百分比(%)16.67 ± 4.40 34.90 ± 5.20 2.440 0.010 CD3+CD8+ T 淋巴細(xì)胞百分比(%)33.33 ± 7.80 30.10 ± 3.60 0.450 0.650 CD4+/CD8+比值0.49 ± 0.29 0.93 ± 0.41 3.070 0.005

2.3 研究組EBV 陽(yáng)性組與EBV 陰性組患者T 淋巴細(xì)胞亞群分布差異

研究組剔除明顯免疫抑制數(shù)據(jù)后（EBV 陽(yáng)性組8 例），分別將CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比與CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值按分布等比分群，再將患者按各分群數(shù)值計(jì)量。外周血CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比分為0～＜20%、20%～＜40%和40%～65%，研究組EBV 陰性組與EBV 陽(yáng)性組CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比均主要分布在20%～＜40%，2 組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.269，P=0.010）。外周血CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞百分比分為0～＜30%、30%～＜60% 和60%～90%，研究組EBV陰性組與EBV 陽(yáng)性組組間CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞百分比分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.279，P=0.870）。外周血CD4+/CD8+比值分為0～＜0.6、0.6～＜1.2 和1.2～1.8，EBV 陽(yáng)性組CD4+/CD8+比值主要分布在0.6～＜1.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.367，P=0.006)。見(jiàn)表3。

表3 研究組EBV 陰性組與EBV 陽(yáng)性組患者的T 淋巴細(xì)胞亞群分布情況［例（%）］

2.4 研究組感染EBV 的病毒載量與T 淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

研究組感染EBV 的病毒載量與CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞水平無(wú)相關(guān)性（r=0.065，P＞0.05）；研究組感染EBV 的病毒載量與CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞水平呈正相關(guān)（r=0.399，P＜0.05）；研究組感染EBV 的病毒載量與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（r=-0.626，P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 EBV 病毒載量與T 淋巴細(xì)胞亞群的線(xiàn)性關(guān)系

表4 研究組EBV 陽(yáng)性組患者EBV 病毒載量與T 淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析（n=21a）

3 討論

Allo-HSCT 后的IR 是影響移植相關(guān)死亡率的重要因素。免疫功能失衡將會(huì)使患者的死亡率和復(fù)發(fā)率明顯升高。據(jù)報(bào)道，一般固有免疫功能會(huì)最先恢復(fù)，而獲得性免疫功能包括細(xì)胞免疫（T 淋巴細(xì)胞）、體液免疫（B 淋巴細(xì)胞）功能的恢復(fù)，需要l～2 年的時(shí)間［13］。一般認(rèn)為，移植后T 淋巴細(xì)胞功能的重建主要分如下2 個(gè)作用機(jī)制：（1）供者成熟T 淋巴細(xì)胞的短期生存及擴(kuò)增；（2）供者造血早期細(xì)胞經(jīng)受者胸腺重新發(fā)育出來(lái)的T 淋巴細(xì)胞［14-15］。因此T 淋巴細(xì)胞重建的過(guò)程與其本身因素有關(guān)，而胸腺發(fā)育產(chǎn)生的T 淋巴細(xì)胞與移植后CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的重建密切相關(guān)。

EBV 和HCMV 是2 種常見(jiàn)的人類(lèi)皰疹病毒。EBV 屬于γ 皰疹病毒科，病毒基因組的全部序列是一全長(zhǎng)172 282 bp 的DNA［14］。人是EBV 的自然宿主，EBV 感染與宿主免疫狀態(tài)密切相關(guān)。EBV 通常作為一種潛伏性和亞臨床感染的狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中，當(dāng)宿主免疫功能受到抑制時(shí)，EBV 被激活并復(fù)制。EBV 感染可引起宿主免疫狀態(tài)的一系列持續(xù)改變，直至出現(xiàn)嚴(yán)重的疾病［16-17］，同樣免疫受損的宿主EBV 激活風(fēng)險(xiǎn)比普通人更高。而值得注意的是，接受allo-HSCT 術(shù)后患者的免疫功能重建與EBV 的重新激活或原發(fā)感染均有密切的關(guān)系［11］。HCMV 屬β 皰疹病毒科亞科的雙股線(xiàn)性DNA 病毒，是免疫受損患者的重要病原體，其感染是血液病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一［18-20］。

T 淋巴細(xì)胞亞群是預(yù)測(cè)移植后IR 程度的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)大量allo-HSCT 相關(guān)報(bào)道證實(shí)［21-22］，其與人類(lèi)免疫缺陷病毒感染患者相似，CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目與移植后人類(lèi)皰疹病毒感染率明顯相關(guān)［23-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，allo-HSCT 患者感染EBV與HCMV 的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，且allo-HSCT 患者感染后EBV-DNA 的拷貝數(shù)更高，說(shuō)明allo-HSCT 患者更容易感染或重新激活HCMV 和EBV。隨后對(duì)比allo-HSCT 患者中EBV 陽(yáng)性與EBV 陰性的NEU和LYM 水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與allo-HSCT患者IR 過(guò)程相關(guān)。隨后對(duì)T 淋巴細(xì)胞亞群與EBV感染的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞與CD4+/CD8+比值在allo-HSCT 的EBV 陽(yáng)性患者中更低。模擬免疫功能恢復(fù)過(guò)程，研究組EBV 陰性組與EBV 陽(yáng)性組CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比均主要分布在20%～＜40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.269，P=0.010）。EBV 陽(yáng)性組CD4+/CD8+主要分布在0.6～＜1.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.367，P=0.006)。惡性血液病allo-HSCT 患者感染EBV 的風(fēng)險(xiǎn)與CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞含量與CD4+/CD8+比值具有相關(guān)性。隨后，EBV-DNA 的載量分析發(fā)現(xiàn)，CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞與EBV-DNA 載量呈正相關(guān)，CD4+/CD8+比值與EBV-DNA 載量呈負(fù)相關(guān)，原因可能是EBV 的感染導(dǎo)致了CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞的水平升高，也是allo-HSCT 患者病毒感染后免疫失衡的表現(xiàn)。

本研究分析了T 淋巴細(xì)胞亞群變化來(lái)反映免疫功能的變化，探討了T 淋巴細(xì)胞亞群變化與allo-HSCT 患者EBV 感染的相關(guān)性，CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞為allo-HSCT 患者EBV 感染的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，而allo-HSCT EBV 感染患者CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞含量的增多影響了allo-HSCT 患者免疫系統(tǒng)的重建，進(jìn)一步加重病毒感染的allo-HSCT 患者免疫功能失衡。同時(shí)CD4+/CD8+比值在預(yù)測(cè)EBV 感染和病毒載量中起著關(guān)鍵的作用。因此，建議allo-HSCT 患者在免疫功能恢復(fù)過(guò)程中，需要同時(shí)監(jiān)測(cè)病毒感染狀態(tài)和免疫功能的變化。本研究仍有一些不確定因素的存在。檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中的EBV-DNA 比EBV 抗體的檢測(cè)更有助于診斷EBV 的感染，但部分EBV 攜帶者的外周血單個(gè)核細(xì)胞可以檢測(cè)到低拷貝數(shù)的EBV-DNA，因很難區(qū)分EBV 的感染狀態(tài)，所以低拷貝數(shù)的EBV-DNA 并沒(méi)有加入到EBV 陽(yáng)性的分組中。此外，受本研究樣本量的限制，統(tǒng)計(jì)分析的偏差可能較大。且未進(jìn)一步對(duì)HCMV 感染allo-HSCT 患者的T 淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，后續(xù)會(huì)對(duì)這一部分進(jìn)行研究。