家蠶濃核病病毒和血液型膿病病毒PCR診斷方法的建立及應(yīng)用

葉 斌，蔡冬冬，李建崗，范 毅，羅 毅，劉伽均，胡曉亮，田志革*

（1.成都市動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室，四川 宜賓 644000）

家蠶血液型膿病也被稱作家蠶核型多角體病，是由家蠶血液型膿病病毒（BmNPV）引起的亞急性傳染性疾病［1］。該病毒是一種DNA病毒，屬于桿狀病毒科、核型多角體病毒屬、蠶核多角體病毒種，病毒粒子呈長桿狀。它是最早被我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種主要危害家蠶的病原體，早在12世紀(jì)的中國農(nóng)業(yè)文獻(xiàn)中就已有該病的記載［2］。在家蠶中主要以食下感染和皮膚創(chuàng)傷感染兩種方式傳播。當(dāng)病毒進(jìn)入蠶體后，主要寄生于皮膚上皮及脂肪等組織細(xì)胞的細(xì)胞核中。一旦家蠶患上血液型膿病后，體色就會變成乳白色，身體發(fā)生腫脹等現(xiàn)象［3］。近年來，家蠶血液型膿病成為發(fā)病最多、最普遍的傳染性蠶病之一，危害程度極高。

家蠶濃核病由家蠶濃核病病毒引起，由于與大蠟螟DNV 相似，將其稱為BmDNV［4］。家蠶濃核病病毒（BmDNV）屬于細(xì)小病毒科、濃核病毒屬，無囊膜，病毒粒子呈球形，基因組為4.0～6.5 kb，且為正負(fù)鏈單分子ssDNA，正鏈和負(fù)鏈包被在不同的衣殼蛋白中［5］。家蠶感染BmDNV后食欲會減退，出現(xiàn)空頭癥狀，將蠶的體壁撕開，可觀察到腸內(nèi)空虛，幾乎沒有桑葉片，只有黃綠色半透明的消化液［4］。BmDNV具有很強(qiáng)的感染能力，對蠶的毒性非常強(qiáng)，少量病毒，都會引起蠶發(fā)病，給養(yǎng)蠶戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

臨床上一般通過血清學(xué)檢測、癥狀觀察和顯微鏡檢查進(jìn)行粗略地診斷，這些診斷方法存在操作復(fù)雜、耗時長、靈敏度低，或者判斷不準(zhǔn)確的問題。因此，本試驗擬建立能夠檢測單個病原的單重PCR 方法和同時檢測兩種病原的雙重PCR 方法，為BmDNV 和BmNPV的快速檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒基因合成 連接有家蠶血液型膿病病毒（BmNPV）ie-1基因和濃核病病毒（BmDNV）ORF2 基因片段的質(zhì)粒，由北京擎科生物科技有限公司合成，原始濃度為100 ng/μL，于－20 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑Premix Taq DNA聚合酶，DL2000 DNAMarker；瓊脂粉，TAE緩沖液（50倍）；EB替代染料等為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計 查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)選定BmDNV的ORF2 基因和BmNPV 的ie-1 基因作為病毒檢測的基因，在NCBI 官網(wǎng)上分別下載相關(guān)基因序列，通過Mega 4.0軟件進(jìn)行同源序列比對，找到其保守區(qū)域。根據(jù)找到的保守區(qū)域位置，在Oligo軟件上分別進(jìn)行BmDNV 和BmNPV的引物設(shè)計，并通過Oligo 軟件上的Analyze 程序進(jìn)行檢測，確定BmDNVORF2 基因片段擴(kuò)增的最終引物和BmNPVie-1 基因片段擴(kuò)增的最終引物（表1）。從Oligo軟件中導(dǎo)出設(shè)計的最終引物，送往北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 BmDNV和BmNPV基因片段擴(kuò)增引物信息

1.4 BmDNV、BmNPV 單 重PCR 體 系 的 優(yōu)化BmDNV、BmNPV單重PCR反應(yīng)體系為20μL：Premix TaqDNA 聚合酶10μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72℃終延伸10 min。在此基礎(chǔ)上，對BmDNV、BmNPV 單重PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件進(jìn)行優(yōu)化。PCR 結(jié)束后，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，然后將獲得的目的片段膠回收后送往公司測序鑒定。

1.5 BmDNV、BmNPV 單重PCR 方法特異性的檢測 使用已經(jīng)建立的針對BmDNV 的單重PCR方法，分別對BmNPV、BmDNV 的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見1.4，同時以ddH2O 為空白對照，檢測BmDNV單重PCR反應(yīng)的特異性。同理，使用建立的BmNPV單重PCR方法，分別對BmNPV、BmDNV 的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見1.4，同時以ddH2O 為空白對照，檢測BmNPV 單重PCR 反應(yīng)的特異性。

1.6 BmDNV、BmNPV雙重PCR方法的建立 根據(jù)建立的兩種病毒的單重PCR方法，確定雙重PCR方法的反應(yīng)體系如下：Premix TaqDNA 聚合酶10 μL，BmDNV、BmNPV 上下游引物（10 μmol/L）各1μL，DNA 模板各1μL，ddH2O 補足至20 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退 火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。對反應(yīng)溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并測定此雙重PCR 方法的敏感性。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.6.1 BmDNV、BmNPV雙重PCR 退火溫度優(yōu)化 將BmDNV、BmNPV 雙重PCR 反應(yīng)體系的退火溫度分別設(shè)為50、52、53.9、58.3、60 ℃五個梯度，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.2 BmDNV、BmNPV 雙重PCR 引物濃度的優(yōu)化 根據(jù)優(yōu)化的退火溫度，將BmDNV 和BmNPV雙重PCR 反應(yīng)體系的上下游引物濃度分別設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/L 五個梯度，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.3 BmDNV、BmNPV雙重PCR 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 采用優(yōu)化的退火溫度和引物濃度，分別設(shè)置反應(yīng)程序為25、30、35個循環(huán)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmDNV、BmNPV 單重PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化 以BmDNV的DNA為模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，結(jié)果得出：最佳循環(huán)數(shù)為30個循環(huán)，最佳退火溫度為50 ℃，最佳引物濃度為0.4 μmol/L。以BmNPV的DNA為模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示：最佳退火溫度為50 ℃，最佳引物濃度為0.5 μmol/L，最佳循環(huán)數(shù)為30個循環(huán)。

2.2 BmDNV、BmNPV 單重PCR 方法的特異性檢測 利用建立的BmDNV 單重PCR 方法對BmDNV、BmNPV 的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果得出此檢測方法只對BmDNV有擴(kuò)增（圖1a）。利用建立的BmNPV單重PCR方法對BmDNV、BmNPV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示此檢測方法只對BmNPV有擴(kuò)增，對其他體系無擴(kuò)增（圖1b）。

圖1 BmDNV和BmNPV單重PCR方法的特異性檢測

2.3 BmDNV、BmNPV 雙重PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化 以BmDNV 和BmNPV 的DNA 為模板，進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示：最佳循環(huán)數(shù)為30 個循環(huán)（圖2a），最佳退火溫度為50 ℃（圖2b），最佳引物濃度為0.4 μmol/L（圖2c）。

圖2 BmDNV和BmNPV雙重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

2.4 BmDNV、BmNPV 雙重PCR 方法的敏感性檢測 利用滅菌ddH2O 對兩種病毒DNA 進(jìn)行10倍梯度稀釋，取每個稀釋度的1 μL DNA為模板，應(yīng)用建立的BmDNV、BmNPV雙重PCR方法進(jìn)行敏感性檢測。結(jié)果表示該方法能同時檢測到BmDNV（原始模板濃度100 ng/μL）和BmNPV（原始模板濃度100 ng/μL），最低檢測限均為10pg（圖3）。

圖3 BmDNV和BmNPV雙重PCR方法的敏感性檢測

3 討論

中國歷來是世界上最大的繭絲生產(chǎn)國和出口國，我國的繭、絲生產(chǎn)量都占世界產(chǎn)量的75%以上［6］，養(yǎng)蠶成為許多家庭的主要收入來源。隨著“絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶”和“21 世紀(jì)海上絲綢之路”戰(zhàn)略構(gòu)想的提出，蠶絲業(yè)必將得到進(jìn)一步發(fā)展［7］。但是養(yǎng)殖家蠶對環(huán)境有一定的要求，在密集群體飼養(yǎng)條件下，家蠶極易受病原微生物和其他外界因素的影響而發(fā)生各種疾病。

BmDNV 和BmNPV 是家蠶病毒病的重要病原，具有很高的傳染性，一旦暴發(fā)，就會給養(yǎng)蠶戶帶來極大的損失。故早期確診病原對于蠶病的有效防控意義重大。BmDNV 和BmNPV 的單重PCR檢測方法，經(jīng)證實具有較好的敏感性和特異性，基于此本試驗建立了兩種病毒的雙重PCR檢測方法，并對其反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化（包括退火溫度、循環(huán)數(shù)、引物濃度），最終確定最佳反應(yīng)條件。該方法可以更加快速和高效地檢測BmDNV和BmNPV 兩種病毒，為后續(xù)開發(fā)組裝試劑盒并投入市場奠定了基礎(chǔ)。

（責(zé)任編輯：曾憲春）