奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎診治

李艷艷，高亞偉，王靖萱，熊蘇悅，于婉真，陳銘堅(jiān)

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.安徽省碭山縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心，安徽 碭山 235300；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210000）

金黃色葡萄球菌（SA）簡(jiǎn)稱金葡菌，是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。金葡菌引起的奶牛乳房炎具有病程長(zhǎng)、傳播速度快、反復(fù)發(fā)作、治愈率低等特點(diǎn)，可對(duì)產(chǎn)奶腺體組織造成不可逆的損傷，導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能和奶質(zhì)顯著下降。

1 診斷

1.1 免疫學(xué)診斷

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）使用酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，使對(duì)應(yīng)的抗原或抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的顯色反應(yīng)，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。該法使用方便，具有較好的靈敏度和特異性，適用于大量樣本的檢測(cè)。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法既可以檢測(cè)牛奶中是否含有金葡菌，也可以診斷金葡菌性乳房炎。

1.1.2 免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 該技術(shù)需要建立針對(duì)專門結(jié)合到A蛋白的免疫熒光探針，使用帶有熒光標(biāo)記的抗體，以此捕獲釋放到樣品中的病原，通過(guò)特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

該方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)，但是成本較高，并且對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)性有較高要求。

1.1.3 免疫層析檢測(cè)技術(shù) 免疫層析檢測(cè)技術(shù)是一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷方法。該方法以抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)和層析反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)毛細(xì)管作用使樣品在層析條上運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而使其與受體結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，能夠直接診斷奶牛是否患有乳房炎。

1.2 分子生物學(xué)診斷 分子生物學(xué)用于金葡菌性奶牛乳房炎的診斷已經(jīng)越來(lái)越普遍，檢測(cè)方法包括普通PCR法、多重PCR法、實(shí)時(shí)定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。PCR方法與常規(guī)檢測(cè)手段相比，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，并能確定對(duì)應(yīng)的基因型和抗生素耐藥基因的存在，尤其是多重PCR可以同時(shí)進(jìn)行多種病原篩查，其臨床應(yīng)用廣泛。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 細(xì)菌的分離鑒定與培養(yǎng)是診斷細(xì)菌性疾病的常用方法。

金葡菌在血平板上培養(yǎng)24 h 后，會(huì)形成厚的、有光澤的、隆起的，直徑為1～2 mm 的金黃色菌落，并出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象，即在菌落周圍有透明的溶血環(huán)。革蘭氏染色后，可在顯微鏡下觀察到紫色葡萄串狀的球菌。在細(xì)菌生化反應(yīng)中，金葡菌觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

1.4 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿由美國(guó)康奈爾大學(xué)Bicalho教授研發(fā)，可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷。

此培養(yǎng)基中添加了特殊顯色劑，不同病原菌的不同代謝產(chǎn)物可在平板上顯出不同色彩。Ganda等以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)診斷方法來(lái)評(píng)估Accumast診斷培養(yǎng)皿對(duì)金葡菌的鑒定效果，其靈敏性、特異性分別為100%、99.8%。

1.5 試管凝固酶試驗(yàn) 試管凝固酶試驗(yàn)是診斷金葡菌常用的生化試驗(yàn)。

金葡菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。該法巧妙利用了金葡菌此特性進(jìn)行特異性診斷，具有經(jīng)濟(jì)、高效、可靠且快速的特點(diǎn)，在生產(chǎn)實(shí)際中，常采用玻片法、試管法進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)。

1.6 其他實(shí)驗(yàn)室診斷 甘露醇鹽瓊脂測(cè)試和脫氧核糖核酸酶測(cè)試能夠快速診斷出奶牛乳汁中的金葡菌。Bi-plate 和Tri-plate 培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于金葡菌的快速檢測(cè)。乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于評(píng)估乳腺狀態(tài)和奶?；窘】禒顩r，而乳汁電導(dǎo)率檢查和pH值檢查可以對(duì)奶牛乳汁的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，可用于本病的綜合性診斷。

目前基于表型和基因分型方法的分子技術(shù)為診斷本病提供了快速和特異的鑒定方法。中國(guó)農(nóng)科院智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)利用表面增強(qiáng)拉曼納米標(biāo)簽改進(jìn)的免疫滲濾裝置，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度奶牛乳腺炎癥因子白介素-6的檢測(cè)，為及早發(fā)現(xiàn)和診斷奶牛乳腺炎提供了新方法。

2 耐藥性與治療

2.1 耐藥性 隨著抗生素的廣泛使用，金葡菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，金葡菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生有水解作用的β-內(nèi)酰胺酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)、耐藥基因以及細(xì)胞膜對(duì)藥物通透性降低等。

金葡菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制是通過(guò)修飾核糖靶位點(diǎn)，以此影響大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)核糖亞基的親和力。主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌的正常生理結(jié)構(gòu)，存在于敏感菌株中，但當(dāng)細(xì)菌被環(huán)境中的底物長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)時(shí)，其編碼基因的外排系統(tǒng)會(huì)被激活和表達(dá)，使得外排藥物的能力顯著增強(qiáng)，從而導(dǎo)致耐藥性。金葡菌的tet（K）基因是其主要耐藥基因，該基因編碼的主動(dòng)外排機(jī)制能將四環(huán)素類抗菌藥物泵出細(xì)胞外，從而產(chǎn)生耐藥性。

由于金葡菌多樣化的耐藥機(jī)制，使得乳源金葡菌的耐藥性不斷加強(qiáng)。耐甲氧西林金葡菌株（MRSA）是一種耐多藥的“超級(jí)細(xì)菌”，其對(duì)包括治療金葡菌性奶牛乳房炎的常規(guī)抗生素均有耐藥性。MRSA 等耐藥菌株的出現(xiàn)，給本病的治療帶來(lái)了全新的挑戰(zhàn)。

2.2 抗生素治療 抗生素療法是國(guó)內(nèi)外普遍采用的治療奶牛乳房炎的常用方法，由于臨床用藥不規(guī)范等原因，使得金葡菌成為較難根治的乳房炎病原之一。同時(shí)，由于其獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制、傳染性、環(huán)境持久性、對(duì)皮膚及黏膜的強(qiáng)大粘附能力，使用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療的有效性已近耗竭。

隨著抗生素耐藥性、藥物殘留和公共衛(wèi)生問(wèn)題的日益突出，抗生素的應(yīng)用受到了諸多限制。因此，尋求新的乳房炎預(yù)防和治療策略已成為當(dāng)下之需。

2.3 替代療法 針對(duì)金葡菌的替代治療方法包括使用細(xì)菌素、益生菌、噬菌體和生物活性植物化學(xué)物質(zhì)。大量實(shí)驗(yàn)證明，噬菌體可以有效提高感染細(xì)菌動(dòng)物的存活率，與抗生素相比，噬菌體制劑特異性高、自我增殖快、開發(fā)時(shí)間短。另外，益生菌也極具治療前景，過(guò)氧化乳桿菌、乳酸乳球菌和干酪類乳桿菌在體外對(duì)抗幾種引起乳房炎的病原體有良好的效果，它們可以刺激奶牛的免疫應(yīng)答，去除金葡菌生物膜，調(diào)節(jié)病原體在宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。

有研究證明包括藍(lán)桉、黃芪、柴胡、洋甘菊、薄荷、金銀花、羅勒、蒺藜、艾葉等多種中草藥的提取物具有顯著抑菌效果。中藥消除細(xì)菌耐藥性的作用機(jī)制主要是抑制β-內(nèi)酰胺酶的作用、抑制主動(dòng)外排泵、抑制細(xì)菌生物膜及細(xì)菌耐藥質(zhì)粒形成等。

2.4 納米制劑療法 納米顆粒的開發(fā)為金葡菌性乳房炎的治療提供了新的思路。納米顆?？商岣哂行лd荷藥物在細(xì)胞內(nèi)的穿透和積累，降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性和防止其生物膜形成的能力。

納米抗菌藥物具有廣譜、親水和環(huán)保等許多特性，并且使用天然礦物，無(wú)耐藥性產(chǎn)生。

一些納米載體可通過(guò)與多種抗菌藥物偶聯(lián)或結(jié)合來(lái)促進(jìn)對(duì)金葡菌的藥理活性，因此，納米顆粒給藥被認(rèn)為是抑制金葡菌感染的較理想工具。納米顆?？梢栽鰪?qiáng)藥物在細(xì)胞內(nèi)的滲透性，其主要通過(guò)增加釋放藥物向主要靶點(diǎn)的擴(kuò)散和被細(xì)胞攝取的能力，以及改善包被或吸附納米顆?？股氐尼尫牛鰪?qiáng)抗生素對(duì)細(xì)胞內(nèi)金葡菌感染的抗菌活性。

脂質(zhì)體也被認(rèn)為是抗菌藥物在細(xì)胞內(nèi)分布的可能載體，這歸因于其磷脂雙層結(jié)構(gòu)，大單片脂質(zhì)體可作為鏈霉素的載體對(duì)抗金葡菌的細(xì)胞內(nèi)感染。使用克拉霉素和達(dá)托霉素負(fù)載脂質(zhì)體的最佳比例也驗(yàn)證了阿奇霉素負(fù)載脂質(zhì)體對(duì)MRSA具有更高的殺菌作用。

2.5 中草藥療法 作為我國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)藥資源，中草藥具有提高非特異性免疫力和抗菌力的作用，近年來(lái)在奶牛乳房炎上應(yīng)用研究也越來(lái)越多。

研究表明中草藥提取物，如黃芪多糖，以及中草藥組方制劑對(duì)包括金葡菌性奶牛乳房炎具有明顯的治療效果。除了抑菌和抗炎作用，中草藥還能通過(guò)活血、化瘀、消腫、散癰等作用改善乳房局部的血液循環(huán)，調(diào)節(jié)乳腺血液供應(yīng)，進(jìn)而修復(fù)乳腺組織，達(dá)到治愈乳房炎的目的。

3 預(yù)防

3.1 抗病育種 早期的抗乳房炎育種研究主要集中在測(cè)定臨床乳房炎、乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)及乳房表型等性狀的遺傳參數(shù)方面。不同奶牛品種之間存在著遺傳差異，可以微妙地影響奶牛的生產(chǎn)性能和疾病抗性，從而使人們能夠選擇具有乳房炎抗性遺傳特征的奶牛進(jìn)行繁育。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)尤其是基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，以功能基因組、轉(zhuǎn)基因?yàn)榇淼姆肿佑N技術(shù)已成為抗乳房炎育種的發(fā)展方向，乳房炎抗性相關(guān)候選基因的研究也取得重大進(jìn)展。如BTA22 基因編碼的乳鐵蛋白具有抑菌和殺菌的作用，BTA23可通過(guò)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答來(lái)發(fā)揮其在預(yù)防乳房炎中的作用，而β-防御素基因可在乳腺等組織中受病原的誘導(dǎo)而表達(dá)，對(duì)金葡菌等乳房炎致病菌有抗菌活性。

3.2 疫苗預(yù)防 免疫疫苗是控制和終結(jié)大多數(shù)傳染病的首選方法。

市場(chǎng)上也已生產(chǎn)出了多款針對(duì)金葡菌性乳房炎的疫苗，如西班牙歐杰諾的MASTIVAC 牛乳房炎滅活疫苗、德國(guó)勃林格的Lysigin多價(jià)裂解疫苗、西班牙海博萊用的Startvac 多價(jià)疫苗。市售疫苗具有一定的保護(hù)效力，能在一定程度上降低臨床型乳房炎的發(fā)病率。

在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，對(duì)乳房炎自家苗的研究也已開展起來(lái)。針對(duì)金葡菌性乳房炎的感染，國(guó)外許多農(nóng)場(chǎng)開始使用自家苗，這些疫苗具有很高的畜群特異性，且抗原濃度通常較高，為金葡菌性乳房炎的防治提供了一種新的思路。

3.3 信息化監(jiān)測(cè)管理 定期對(duì)泌乳期奶牛進(jìn)行乳房炎監(jiān)測(cè)是防治和控制乳房炎蔓延的有力措施。

通用信息技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步為現(xiàn)代化乳制品行業(yè)提供了新的技術(shù)支持，同時(shí)也建立了一系列乳房炎防控的信息體系，如使用適配并可連接到智能手機(jī)應(yīng)用程序的納米生物傳感器，可快速檢測(cè)牛奶樣本中的病原體，數(shù)字化的擠奶機(jī)控制系統(tǒng)也降低了機(jī)械控制故障而導(dǎo)致的臨床乳房炎的發(fā)病率。不同的傳感器系統(tǒng)可以測(cè)量每頭奶牛的生理、行為和生產(chǎn)指標(biāo)。

信息化監(jiān)測(cè)管理有助于對(duì)金葡菌性乳房炎進(jìn)行監(jiān)測(cè)、防控和診斷，并統(tǒng)計(jì)建立出金葡菌性乳房炎的特征性診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為收集不同類型乳房炎的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了便利。