四川地區(qū)一株P(guān)CV2的分離鑒定及基因組序列分析

陳勁松，郭紫晶，黃雄挺，張志東，李彥敏

（西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是環(huán)狀單鏈DNA病毒。PCV-2感染后會引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、初生仔豬先天性震顫（CT）［1-3］。PCV2基因組大小為1 767～1 768 nt，包含2個主要的開放閱讀框（ORFs），其中ORF1 編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白Rep，ORF2編碼衣殼蛋白（Cap）。PCV2基因組易發(fā)生點(diǎn)突變和基因重組，在疫苗免疫和自然感染選擇壓力作用下，PCV2 流行株持續(xù)進(jìn)化和變異［4-5］。

本研究從四川省某發(fā)病豬場病料組織中成功分離并鑒定出一株P(guān)CV2毒株（SMU-2022），通過克隆測序獲得全基因組序列，并對其進(jìn)行分子生物學(xué)特征分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和臨床樣本 豬腎細(xì)胞（PK-15）由本單位實(shí)驗(yàn)室保存；從四川省某養(yǎng)豬場疑似PMWS發(fā)病豬上采集18 份組織樣本，其中3 份肺臟、4份脾臟、3份肝臟、4 份腎臟和4份淋巴結(jié)組織，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素雙抗、DMEM 培養(yǎng)基，購自Gibco 公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、Dream TaqGreenPCR預(yù)混液（2×）、膠回收試劑盒，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PMD-19T 載體，購自Takara 公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000Marker、質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PCV2兔源多抗，來自GeneTex 公司；FITC 標(biāo)記羊抗兔IgG，來自Biosharp 公司；D（＋）-氨基葡萄糖，購自Sigma試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 將收集到的肺臟、脾臟、肝臟、腎臟和淋巴結(jié)病料組織在無菌條件下剪碎，每份病料剪取約1 g，置于無菌研磨管中，加入PBS 1 mL和勻漿珠4粒，按照標(biāo)準(zhǔn)研磨程序研磨，4 ℃、10 500 r/min 離心3～5min，吸取上清液，參照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA。

1.3.2 PCV2的PCR檢測 參考文獻(xiàn)［6］合成P1檢測引物，參考文獻(xiàn)［7］合成P2、P3 全基因序列擴(kuò)增引物（表1）。用P1 引物對提取的DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL PCR 反應(yīng)體系：DreamTaq Green PCR預(yù)混液（2×）12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2 μL，無酶水（RNase freewater）8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 引物序列

1.3.3 病毒的分離 將經(jīng)PCR 檢測為陽性的樣品制成組織懸液，離心后取組織上清液用氯仿處理，每1 mL 上清加入50 μL 氯仿，室溫下不斷混合10 min，2 000 r/min 離心10 min。取上清，用0.22 μm 濾膜過濾。將長成單層的PK-15細(xì)胞用0.05%EDTA-胰酶消化液消化，制成細(xì)胞濃度為5×104個/mL 的細(xì)胞懸液。取上清液1 mL 接種到10 mL細(xì)胞懸液，分裝到2個25 cm2（T25）細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加300～500 μL 300 mMD（＋）-氨基葡萄糖，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；同時培養(yǎng)正常PK-15 細(xì)胞作為對照。接種后18～24 h，細(xì)胞長成50%～60%單層，用300 mMD（＋）-氨基葡萄糖處理細(xì)胞，用預(yù)熱無菌PBS 液（37 ℃）溶解D（＋）-氨基葡萄糖，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。棄去培養(yǎng)液，加入1～2mL預(yù)熱的300 mMD（＋）-氨基葡萄糖。37 ℃孵育30 min，去除D（＋）氨基葡萄糖，用PBS 洗滌細(xì)胞，加入含2%FBS 的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按上述步驟將病毒盲傳5 代后進(jìn)行PCR 檢測，鑒定為陽性的病毒繼續(xù)傳代。

1.3.4 病毒的PCR 鑒定 收獲的每一代次細(xì)胞病毒液以P1 為引物，以PCV2 臨床陽性樣本為陽性對照，同時設(shè)立未接毒的PK-15細(xì)胞為陰性對照，進(jìn)行PCR檢測。將擴(kuò)增結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.5 病毒的間接免疫熒光鑒定 將病毒接種到預(yù)先培養(yǎng)的PK-15 細(xì)胞上，37 ℃培養(yǎng)48～60 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌2次，晾干；用4%多聚甲醛（溶于PBS 中，pH7.6）室溫下固定細(xì)胞10min，用預(yù)冷PBS洗滌3次，晾干；用0.25%Triton X-100（溶于PBS 中，pH7.6）室溫下孵育10min，用預(yù)冷PBS洗滌3次，晾干；加封閉液（1%BSA＋含22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST）封閉45min，用預(yù)冷PBS洗滌3次，晾干；加入兔源PCV2 多抗（1∶500）50 μL/孔，4 ℃孵育過夜，用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，晾干；加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶1 000）50 μL/孔，室溫下避光孵育1 h，用預(yù)冷PBS洗滌3次，晾干；熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 PCV2 全基因組擴(kuò)增及克隆 根據(jù)表1 全基因擴(kuò)增引物P2、P3 擴(kuò)增全基因組序列。25 μL PCR 反應(yīng)體系：Dream TaqGreen PCR預(yù)混液（2×）12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無酶水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共36次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增出的目的條帶用DNA純化回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，最后將鑒定為陽性的單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.7 遺傳進(jìn)化分析 測序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對后進(jìn)行手動拼接。從GenBank 中選取源于不同國家、不同基因型的PCV2 毒株全基因組核苷酸序列，使用Mega 7.0 和DNAstar 中的Seqman和MegAlign軟件對本次分離的PCV2 毒株與GenBank 中PCV2 參考毒株進(jìn)行全基因核苷酸序列相似性比對；利用Mega 7.0 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用ClustalW方法和Neighbor-Joining（NJ）（Bootstrap，1 000次重復(fù)）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.8 PCV2 Cap蛋白的氨基酸序列和抗原指數(shù)分析 從GenBank中選取與PCV2分離毒株同源性最高的20 株參考毒株、4 株參考疫苗株進(jìn)行比對，利用DNAstar 中的MegAlign 和Mega 7.0 軟件分析ORF2基因編碼的氨基酸序列的相似性。利用DNAstar 中Protean 軟件的Anligenicily Jameson-Wolf方法，預(yù)測PCV2分離株的Cap蛋白抗原指數(shù)，并與4株參考疫苗株（GenBank 號：HM038027.1、HM641752、AY686764、HM038034）的Cap蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品PCV2 的檢測 對采集的18 份疑似PMWS患病豬的臨床樣本進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，有3 份樣本（脾臟、淋巴結(jié)和腎臟）擴(kuò)增得到大小約537 bp 的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。測序結(jié)果進(jìn)一步表明，這3 份樣品均為PCV2陽性。

圖1 部分病料組織中PCV2的PCR擴(kuò)增

2.2 病毒的分離與鑒定 將3份PCV2陽性的組織病料接種到PK-15 細(xì)胞上，并連續(xù)傳代7 次后再次進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示，只有腎臟接種的每一代PK-15 細(xì)胞能擴(kuò)增出特異性PCV2 條帶（圖2），表明分離到的PCV2能夠在PK-15細(xì)胞上增殖。與對照細(xì)胞相比，PCV2 感染的PK-15 細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。通過間接免疫熒光檢測，在接種PCV2的第7代PK-15細(xì)胞中出現(xiàn)特異性綠色染色，陰性對照細(xì)胞上沒有出現(xiàn)特異性染色?？傊驹囼?yàn)從疑似PMWS患豬的腎臟組織中分離到一株P(guān)CV2，命名為SMU-2022。

圖2 每一代PK15細(xì)胞中PCV2的PCR擴(kuò)增

2.3 PCV2 基因組擴(kuò)增及克隆 用引物P2 和P3對分離毒株進(jìn)行克隆測序，結(jié)果顯示，在960 bp、980 bp 左右處出現(xiàn)目的電泳條帶，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致（圖3）。將測序獲得的2 個基因組序列片段與P1擴(kuò)增的序列片段進(jìn)行拼接，得到PCV2（SMU-2022）分離毒株的全基因序列，全長為1767nt，提交至GenBank，登錄號為OQ656424。

圖3 PCV2的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 PCV2分離株的遺傳進(jìn)化分析PCV2分離株（SMU-2022）與國內(nèi)外46 株P(guān)CV2 參考毒株進(jìn)行全基因組核苷酸序列比對及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，PCV2 分離株與國內(nèi)外46 株參考毒株的相似性為91.8%～99.1%，與我國參考株QZ1410 毒株（江蘇，GenBank 號：MG732832.1）的相似性最高，親緣關(guān)系最接近?；谌蚪M序列和ORF2基因序列所構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹顯示，PCV2 分離株（SMU-2022）屬于PCV2d基因型（圖4）。

圖4 PCV2全基因組（A）和ORF2基因（B）的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 Cap蛋白的氨基酸序列和抗原指數(shù)分析ORF2基因長為705 bp，編碼235 個氨基酸，利用Mega 7.0 軟件將分離株的Cap 蛋白氨基酸序列與國內(nèi)外20個參考毒株進(jìn)行序列比對，結(jié)果得出氨基酸相似性為98.3%～99.1%。與4 株參考疫苗株的氨基酸相似性為81.7%～86%。分析PCV2 分離株（SMU-2022）的ORF2 氨基酸位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在Cap蛋白B細(xì)胞表位區(qū)有1個特異性突變位點(diǎn)V30L，在T細(xì)胞表位區(qū)有1個特異性突變位點(diǎn)T232K。

對PCV2 分離株（SMU-2022）的Cap 蛋白與4株疫苗株的Cap 蛋白進(jìn)行抗原指數(shù)分析，結(jié)果顯示：PCV2分離株與4株疫苗株的抗原指數(shù)差異較大，主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220 位氨基酸這6 個區(qū)域，且PCV2分離株的抗原指數(shù)明顯高于疫苗株。

3 討論

3.1 PCV2 在我國的流行情況 根據(jù)全基因組序列和ORF2 基因序列分析，PCV2 分為8 種基因亞型（a、b、c、d、e、f、g、h），目前國內(nèi)流行毒株為PCV2a、PCV2b 和PCV2d 基因亞型［8］。PCV2a 是臨床上最流行的基因型，之后發(fā)生兩次基因型轉(zhuǎn)移，即從PCV2a 到PCV2b再到PCV2d，而PCV2d 已成為中國當(dāng)前流行的主要基因型［9］。Liu［10］等綜合整理2015～2019年間已報道的各地區(qū)的PCV2流行情況，發(fā)現(xiàn)PCV2總流行率為46.0%，其中東北地區(qū)最高，PCV2 流行率最高的是保育豬（50.9%）。集約型農(nóng)場和粗放型農(nóng)場的PCV2 感染率分別為50.1%和37.5%。這些結(jié)果表明PCV2 在中國豬群中有較高的感染率，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的威脅和挑戰(zhàn)［11-12］。

本研究從疑似PMWS 發(fā)病豬的組織樣本中成功分離到一株P(guān)CV2（SMU-2022，GenBank 號：OQ656424），該毒株為PCV2d 基因型。通過基因組和Cap 基因序列遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與QZ1410 毒株（江蘇，GenBank 號：MG732832.1）的親緣關(guān)系密切，但是其PCV2d基因組在進(jìn)化樹上單獨(dú)分為一支。相似性分析顯示，該毒株與國內(nèi)外46株參考毒株的核苷酸相似性為91.8%～99.1%，表明PCV2毒株基因型正在不斷變異和進(jìn)化。

3.2 Cap 蛋白抗原性分析Cap 蛋白作為PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，包含與病毒免疫相關(guān)的主要抗原決定性表位及中和表位（47-87aa、113-147aa、165-200aa、230-233aa），決定了PCV2 抗原性和致病性［13-15］。Cap蛋白氨基酸序列的微小變化也會改變構(gòu)象，影響病毒與受體的結(jié)合以及病毒的免疫逃避［16］。此外，Cap 蛋白還參與調(diào)節(jié)宿主生物過程、病毒復(fù)制和運(yùn)輸?shù)龋?5］。

當(dāng)前國內(nèi)豬場接種的商品化疫苗多基于PCV2a 和PCV2b 基因型研發(fā)，在臨床防控PCV2的流行和傳播方面仍然有效。但是，在疫苗免疫的選擇壓力下PCV2 基因亞型的變異速度加快，新的流行毒株可能會破壞疫苗保護(hù)效力，故應(yīng)加快研制針對當(dāng)前流行毒株的疫苗。

4 結(jié)論

本研究從四川地區(qū)某發(fā)病豬場的臨床樣本中成功分離到一株P(guān)CV2 流行毒株，該毒株為當(dāng)前主要流行的基因型——PCV2d。該毒株的Cap蛋白氨基酸序列存在2 個突變位點(diǎn)，抗原指數(shù)與當(dāng)前市場疫苗株的差異較大。本研究結(jié)果為四川省PCV2的遺傳進(jìn)化分析和疫苗株的篩選提供了數(shù)據(jù)支撐。